專利名稱：可溶性p－選擇素及炭疽致死毒素的新用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可溶性血小板-選擇素(P-選擇素，platelet-selectin，P-selectin)用于治療全身性出血疾病的新穎用途。
背景技術：
出血性疾病的種類非常多樣化且其致病原因相當復雜，例如血管壁或結締組織結構異常，血小板量或功能異常，凝血因子異常，纖維蛋白溶解過度及循環(huán)抗凝物質等等?；谶z傳與否，出血性疾病可分類為遺傳性及非遺傳性出血疾病。遺傳性出血疾病如血友病，是由于凝血因子發(fā)生突變，使凝血能力喪失或減低所造成。在出血臨床病例，則大部分為非遺傳性出血疾病，包括內外創(chuàng)傷出血、營養(yǎng)或維生素K攝取不足所造成的出血、腸胃道潰瘍出血、傳染性疾病所引起的出血、醫(yī)療行為所造成的出血、婦女生產(chǎn)過程的出血、造血系統(tǒng)失常、肝臟功能失調、自體免疫疾病造成的出血、出血性登革熱、出血性蛇毒攻擊、炭疽病、菌血癥及癌癥造成的出血等等。
除外傷出血外，目前的醫(yī)療方法對于大量全身性出血均束手無策。目前已知的血液凝集促進藥劑(如抗纖維蛋白溶解劑)僅適用于治療局部出血。該等血液凝集促進藥劑進入體內將迅速形成小血栓，常造成心肌梗塞以及腦中風的副作用。因此，目前并無適當安全且無副作用的全身性止血用藥。
P-選擇素系選擇素家族之一成員，其位于血小板的α-顆粒及內皮細胞的WP小體(Weibel-Palade bodies)內。內皮細胞受到凝血酶或組織胺的刺激后，可快速表現(xiàn)P-選擇素。P-選擇素的可溶形式(可溶性P-選擇素，sP-selectin)可發(fā)現(xiàn)于血漿中，為血液循環(huán)蛋白質。可溶性P-選擇素分子較P-選擇素分子小3kDa，在血液中以單體形式存在，而與膜結合的P-選擇素則是以寡聚狀態(tài)存在。健康人的可溶性P-選擇素系來自發(fā)現(xiàn)于內皮細胞及血小板的選擇性剪切形式(Johnston，G.I.等人，1990，J.Biol.Chem.265，21381-21385)。
已有研究認為可溶性P-選擇素的血漿量可視為預期血栓消耗血小板疾病(thrombotic consumptive platelet disorder)的有用工具(Smith，A.等人，1999，Throm.Haemost.82，1593-1599)。Blann，A.D.及Lip.G.Y.則指出可溶性P-選擇素循環(huán)于血液的生物功能并不清楚(J.Clin.Endocrinol.Metab.(2000)85，1745-1747)。后續(xù)研究運用測量血漿凝集所耗費時間(Plasma clotting time)實驗，發(fā)現(xiàn)將可溶性P-選擇素打入老鼠體內可促進血液的凝固(Patrick Andre等人，2000，PNAS vol.97，No.25，13835-13840)。該研究僅就分子機轉及局部性出血予以描述，并推論可溶性P-選擇素可能與凝血病變有關。然而，該研究并未指出可溶性P-選擇素可用于全身性出血疾病的治療。
進一步的研究則指出急性心肌梗死(AMI)患者及不穩(wěn)定心絞痛患者的血漿可溶性P-選擇素量明顯升高(Meral Kayikcioglu等人，Int JCardiol 2001，79223；Enver Atalar等人，Int J Cardiol，2001，7869)。然而，該等文獻亦未提及任何有關全身性出血疾病治療的建議。
綜上所述，并無任何文獻揭示或建議P-選擇素于治療全身性出血疾病的新穎應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種可溶性P-選擇素于制備治療全身性出血疾病藥物的應用。
本發(fā)明還提供一種炭疽致死毒素于制造治療抗血栓疾病藥物的應用。
本發(fā)明涉及可溶性P-選擇素在制備治療全身性出血疾病的藥物中的應用。
所述的可溶性P-選擇素選自天然存在的可溶性P-選擇素、其遺傳工程重組體、多形性(polymorphic)變體、對偶(allelic)變體及其它異構體。
所述的可溶性P-選擇素選自天然存在的可溶性P-選擇素及其遺傳工程重組體。
所述的可溶性P-選擇素可經(jīng)口服或靜脈內注射用藥。
所述的可溶性P-選擇素的用藥量為每公斤體重應用藥約0.1毫微克至約100毫克。
所述的全身性出血疾病選自出血性登革熱、出血性蛇毒及炭疽病。
所述的全身性出血疾病為菌血癥中的出血病況。
本發(fā)明涉及炭疽致死毒素在制造治療抗血栓疾病藥物的應用。
所述的炭疽致死毒素選自天然存在的炭疽致死毒素、其遺傳工程重組體、多形性(polymorphic)變體、對偶(allelic)變體及其它異構體。
所述的炭疽致死毒素選自天然存在的炭疽致死毒素及其遺傳工程重組體。
所述的炭疽致死毒素可經(jīng)口服或靜脈內注射用藥。
所述的炭疽致死毒素的用藥量為每公斤體重應用藥約0.1毫微克至約100毫克。
所述的抗血栓疾病選自心臟病及腦中風。
根據(jù)本發(fā)明，可溶性P-選擇素提供治療全身性出血疾病的新穎應用。本發(fā)明未預期地發(fā)現(xiàn)可溶性P-選擇素具有明顯促進凝血的功能，但并不會引起血栓，導致心肌梗塞及腦中風。因此，本發(fā)明的可溶性P-選擇素在治療全身性出血疾病具有良好效果且無不良副作用。


圖1為血漿凝集試驗結果的數(shù)據(jù)；圖中的橫條由上而下分別代表控制組免疫球蛋白(IgG)，炭疽毒素(LeTx)，重組可溶性P-選擇素(rP-sel)，重組可溶性P-選擇素(rP-sel)+抗P-選擇素抗體(抗-P-sel)，抗登革病毒第一非結構蛋白抗體(抗-NS1抗體)+P-選擇素及抗登革病毒第一非結構蛋白抗體(抗-NS1抗體)。
圖2為小鼠保護力試驗結果的數(shù)據(jù)；圖2A為可溶性P-選擇素對施打出血性蛇毒小鼠的保護力數(shù)據(jù)，圖中的---○---代表西部菱背響尾蛇蛇毒+重組可溶性P-選擇素(rP-sel)，——代表東部菱背響尾蛇蛇毒+重組可溶性P-選擇素(rP-sel)，——代表西部菱背響尾蛇蛇毒，—■—代表東部菱背響尾蛇蛇毒；圖2B為為可溶性P-選擇素對施打炭疽毒素小鼠的保護力數(shù)據(jù)，—●—代表炭疽毒素(LeTx)，---○---代表炭疽毒素(LeTx)+重組可溶性P-選擇素(rP-sel)，——代表炭疽毒素(LeTx)+控制組免疫球蛋白(IgG)及——代表炭疽毒素(LeTx)+重組可溶性P-選擇素(rP-sel)+抗P-選擇素抗體(抗-P-sel)。
圖3為小鼠血小板凝集時間試驗的結果；其中AA代表花生四烯酸；及LeTx代表炭疽毒素。
具體實施例方式
針對全身性出血性疾病，目前尚無有效且不會造成血栓風險的藥物?，F(xiàn)行的治療方法大多僅為支持性(supporting)治療，并無較佳方法可治療全身性出血。本發(fā)明提供可溶性P-選擇素治療全身性出血疾病的新穎用途。該可溶性P-選擇素可有效治療出血性疾病，特別是如炭疽病及出血性登革熱，且不會引起血栓形成的副作用。此外，本發(fā)明的可溶性P-選擇素亦可用于治療菌血癥所引發(fā)的出血病況。
可溶性P-選擇素的新穎用途本發(fā)明提供一種可溶性P-選擇素于制備治療全身性出血疾病藥物的應用。
可溶性P-選擇素及其醫(yī)藥組合物根據(jù)本發(fā)明，用語”可溶性P-選擇素”包括天然存在的P-選擇素的可溶形式及其遺傳工程重組體或多形性(polymorphic)或對偶(allelic)變體或其它異構體(isoform)。該用語亦包括修飾及未修飾的可溶性P-選擇素，如醣基化及未醣基化形式。研究顯示可溶性P-選擇素可來自活化的血小板或內皮細胞。然而，一般技藝人士對于可溶性P-選擇素的功能及其與血小板間的關系并不十分明了。未預期地，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)可溶性P-選擇素在全身性出血疾病的治療上具有相當良好的效果。根據(jù)本發(fā)明，適合治療全身性出血疾病的任何形式的可溶性P-選擇素均可用于本發(fā)明。較佳地，本發(fā)明可溶性P-選擇素為天然存在的可溶性P-選擇素或可溶性P-選擇素的重組體。本發(fā)明根據(jù)本發(fā)明，可溶性P-選擇素系一般技藝人士可易于獲得者，例如分離自天然來源，購自商業(yè)來源或化學合成或藉分子生物學技術合成。
本發(fā)明的可溶性P-選擇素可與醫(yī)藥上可接受載劑制備成醫(yī)藥組合物。除可溶性P-選擇素及載劑外，該組合物可另含有稀釋劑，充填劑，鹽類，緩沖劑，安定劑，溶解劑及其它該技藝中已知的物質。用語”醫(yī)藥上可接受”系指不會干擾活性成份的生物活性作用的無毒性物質。用于本發(fā)明可溶性P-選擇素醫(yī)藥組合物的載劑的特性系依用藥路線而定。本發(fā)明醫(yī)藥組合物亦可含有本技藝中已知的促凝血劑，例如維生素K及抗纖維蛋白溶解劑。
可溶性P-選擇素的用藥為實施本發(fā)明的應用，治療上有效量的本發(fā)明可溶性P-選擇素或醫(yī)藥組合物可用藥至罹患出血性疾病的哺乳動物，包括人類及非人類哺乳動物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明可溶性P-選擇素或醫(yī)藥組合物的用藥可藉各種一般方式進行，如靜脈內注射。當以液體形式用藥時，可添加液體載劑，如水、生理食鹽液或動植物油。該液體形式的醫(yī)藥組合物包含0.5％至90％以重量計的可溶性P-選擇素，較佳為1％至50％以重量計的可溶性P-選擇素。
當靜脈注射用藥治療上有效量的可溶性P-選擇素時，可溶性P-選擇素系為非經(jīng)腸可接受的水溶液形式。制備此種非經(jīng)腸可接受溶液需考慮的pH、等張性、安定性及類似條件系屬本技藝中已知的知試或技術。除可溶性P-選擇素外，較佳的靜脈注射醫(yī)藥組合物可含有本技藝中已知的等張媒劑。本發(fā)明醫(yī)藥組合物亦可含有安定劑、保存劑、緩沖劑、抗氧化劑或其它一般技藝人士已知的添加劑。使用本發(fā)明組合物的靜脈注射治療的時間系視欲治療疾病嚴重性及各別病患的病況而定。醫(yī)師將決定使用本發(fā)明醫(yī)藥組合物的適當靜脈用藥時間。
本發(fā)明的可溶性P-選擇素在醫(yī)藥組合物中的量系依欲治療病況的性質及嚴重性及病患已進行的先前治療的性質而定。醫(yī)師將以個別病患的情況決定可溶性P-選擇素的量。針對各種用于實施本發(fā)明用途的醫(yī)藥組合物，預期每公斤體重應用藥約0.1毫微克至約100毫克的可溶性P-選擇素。
特別是，本發(fā)明的可溶性P-選擇素可用于治療出血性登革熱、出血性蛇毒及炭疽病并可治療菌血癥中出血病況。較佳地，本發(fā)明的可溶性P-選擇素可用于治療出血性登革熱、出血性蛇毒及炭疽病。出血性登革熱系多次感染登革熱后所產(chǎn)生的全身性出血病況。第一次感染登革熱時，多半只有感冒癥狀并沒有生命危險。然而，在多次感染登革病毒之后，會有一定比例的病人產(chǎn)生有致命危險的全身性出血病況。登革病毒的第一非結構蛋白(dengue non-structural protein 1，NS1)可誘導宿主自體免疫抗體的產(chǎn)生，其效價將因為多次感染登革熱而增高。此等自體免疫抗體可導致凝血速度變慢并產(chǎn)生可能的其它的血管病變。出血性毒蛇咬傷是臺灣及其它熱帶地區(qū)常見的戶外傷害，唯一有效的治療方式是注射抗蛇毒血清。然而，毒蛇種類繁多，為治療蛇毒中毒，必須針對每一種蛇準備特定的抗蛇毒血清；此對偏遠地區(qū)而言是不易達成的負擔。炭疽病則是炭疽桿菌(Bacillus anthracis)感染所引起的疾病，炭疽桿菌所產(chǎn)生的致死毒素(anthrax lethal toxin)是主要的毒力因子(virulence factor)。炭疽病死亡的病例中發(fā)現(xiàn)死者均有大量的內出血。本發(fā)明驚訝地發(fā)現(xiàn)可溶性P-選擇素對于出血性登革熱、出血性蛇毒及炭疽病具有良好的治療效果，且不引發(fā)任何副作用。
炭疽致死毒素的新穎用途本發(fā)明另提供一種炭疽致死毒素于制造治療抗血栓疾病藥物的應用。血栓疾病可能造成心肌梗塞及腦中風等并發(fā)癥，此等血栓栓塞所造成的心血管疾病在已開發(fā)國家的十大死亡原因排行榜中幾乎名列前茅。常用的抗血栓藥物包括血小板抑制劑、組織型血纖維溶原活化因子(tPA)、尿激酶(uPA)及鏈霉菌激酶(SK)等。然而，目前仍缺乏非常有效的抗血栓藥物。本發(fā)明驚訝地發(fā)現(xiàn)炭疽致死毒素可有效的抑制血小板凝集，藉此可作為治療抗血栓疾病的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，用語”炭疽致死毒素”包括天然存在的炭疽致死毒素及其遺傳工程重組體或多形性(polymorphic)或對偶(allelic)變體或其它異構體(isoform)。根據(jù)本發(fā)明，適合治療抗血栓疾病的任何形式的炭疽致死毒素均可用于本發(fā)明。較佳地，本發(fā)明炭疽致死毒素為天然存在的炭疽致死毒素或炭疽致死毒素的重組體。本發(fā)明根據(jù)本發(fā)明，炭疽致死毒素系一般技藝人士可易于獲得者，例如分離自天然來源，購自商業(yè)來源或化學合成或藉分子生物學技術合成。
根據(jù)本發(fā)明，治療上有效量的本發(fā)明炭疽致死毒素或醫(yī)藥組合物可用藥至罹患抗血栓疾病的哺乳動物，包括人類及非人類哺乳動物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明炭疽致死毒素或醫(yī)藥組合物的用藥可藉各種一般方式進行，如口服或靜脈內注射；較佳為靜脈內用藥。較佳地，本發(fā)明炭疽致死毒素的有效用藥量預期為每公斤體重應用藥約0.1毫微克至約100毫克。
本發(fā)明炭疽致死毒素可大幅抑制血小板的凝集，并降低產(chǎn)生心肌梗塞及腦中風等并發(fā)癥的風險。
實施例實例1 出血性登革熱及炭疽毒素的血漿凝集試驗血漿凝集實驗系將小鼠C57BL/6J的血液在1,500×g的條件離心25分鐘以獲取小鼠的“血小板缺乏的血漿(platelet-poor plasma，PPP)”。將所得血漿加入等體積20毫莫耳濃度氯化鈣(CaCl2)后，在800rpm及37℃，以凝集測定儀(aggregometermodel 600B，Ion-Trace，Stouffville，Canada)計錄其因凝集造成的吸光值的變化并測得血漿凝集時間(plasma clotting time)。
本實例使用下列試劑進行血漿凝集試驗重組P-選擇素-Ig Fc蛋白(購自R & D Systems Inc.，Minneapolis，Minnesota，USA)作為P-選擇素來源。登革病毒蛋白則使用登革病毒第一非結構蛋白，其系來自以PCR技術復制合成登革病毒第二型(dengue virus type II)臺灣本土分離株(PL046)的第一非結構蛋白基因(Chang等人，2002，J Infect Dis 186，743-51)。炭疽毒素系使用重組炭疽致死毒素，其系得自美國基因庫資料中DNA以及蛋白質資料(美國NCBI Gene Bank，AF065404 andNC_001496)以人工合成基因技術結合PCR技術合成的DNA(Chang等人，1993，Biochem Biophys Res Commun 190，242-9)。
將對抗登革病毒第一非結構蛋白抗體(anti-dengue non-structureprotein NS1 antibody)以及炭疽毒素(LeTx)施打于小鼠體內后可造成抑制血漿凝集。如圖1所示，將抗-NS1抗體及LeTx進行靜脈施打24小時后，血漿凝集時間顯著增加，顯示凝集速度下降。相反的，將重組可溶性P-選擇素(rP-sel)進行靜脈施打24小時后，老鼠血漿凝集時間顯著減少，顯示凝集速度加快。但如添加抗P-選擇素抗體(抗-P-sel)后，上述rP-sel的作用可被中和。此外，將抗-NS1抗體及可溶性P-選擇素一起進行靜脈施打24小時后，相較于施打抗-NS1抗體，血漿凝集時間顯著減少。
由上述圖1的結果可知，可溶性P-選擇素可促進體內凝血機制的活化，且單獨施打治療性劑量的可溶性P選擇素并不會造成對實驗動物的傷害，卻可大幅提升血液凝集效率。因此，可溶性P-選擇素為一很有潛力的全身性止血用藥選擇。
實例2 炭疽毒素及出血性蛇毒的小鼠保護力試驗在P-選擇素對小鼠的保護力試驗中，將小鼠先施打重組P-選擇素-Ig蛋白。P-選擇素添加中和性單株抗體或對照組人類免疫球蛋白IgG(劑量均為1.2克/克)后4小時，再以靜脈施打炭疽毒素及出血性蛇毒。接著觀察小鼠死亡時間。重組P-選擇素-Ig蛋白及炭疽毒素的來源如實例1所示。出血性蛇毒系使用西部菱背響尾蛇(Crotalus atrox)及東部菱背響尾蛇(Crotalus adamanteus)的毒液(購自Sigma，St.Louis，MissouriUSA)。
如圖2A所示，施打西部菱背響尾蛇(Crotalus atrox)及東部菱背響尾蛇(Crotalus adamanteus)的毒液后，各造成六只小鼠(C57BL/6J)全數(shù)于1小時內死亡。然而，事先施打重組可溶性P-選擇素的小鼠則全數(shù)存活超過三個月，證明可溶性P-選擇素對出血具有保護能力。上開試驗證明出血性蛇毒的毒液傷害可經(jīng)由可溶性P-選擇素的治療而脫離死亡的威脅(圖2A)。因此，可溶性P-選擇素有可能開發(fā)成為單一廣效性的抗出血性蛇毒用藥。
另如圖2B所示，施打炭疽毒素(LeTx)造成六只小鼠(C57BL/6J)全數(shù)于4-5日內死亡。然而，事先施打重組可溶性P-選擇素的小鼠則有一只死于第8天，一只死于第18天，而其余四只則存活超過三個月。上該數(shù)據(jù)證明可溶性P-選擇素對出血具有保護能力。此外，由圖可知該可溶性P-選擇素所提供的保護能力可被P-選擇素專一性的抗體所中和。因此，上開試驗說明可溶性P-選擇素可減少炭疽致死毒素造成的死亡。
實例3 菌血癥的小鼠保護力試驗小鼠保護力試驗的試劑及方法如實例2所示。小鼠菌血癥系將1×108菌數(shù)/克的大腸桿菌液施打于小鼠(C57BL/6J)的血漿中仿真菌血癥。如表1所示，施打大腸桿菌液的6只小鼠于24小時內全數(shù)死亡。然而，事先施打重組可溶性P-選擇素的小鼠平均多存活2日。因此，可溶性P-選擇素對菌血癥小鼠確具保護功效。
表1

實例4 炭疽致死毒素的抑制血小板凝集試驗炭疽致死毒素對抑制凝血的效果系以血小板凝集試驗測試。炭疽毒素系使用重組炭疽致死毒素，其系得自美國基因庫資料中DNA以及蛋白質資料(美國NCBI Gene Bank，AF065404 and NC_001496)以人工合成基因技術結合PCR技術合成的DNA(Chang等人，1993，BiochemBiophys Res Commun 190，242-9)。
采取小鼠(C57BL/6J)的血液，并在500×g的條件下離心10分鐘獲得富含血小板的血漿(platelet-rich plasma，PRP)。將所得血漿加入血小板激活劑花生四烯酸(arachidonic acid)，在攪拌(800rpm)及37℃的條件下以凝集測定儀(aggregometermodel 600B，Ion-Trace，Stouffville，Canada)計錄其因凝集造成的吸光值的變化并測得血小板凝集時間(platelet aggregation time)。如圖3所示，經(jīng)血小板激活劑處理后，純化的血小板進行正常的凝集反應。然而，添加炭疽致死毒素的實驗組則出現(xiàn)抑制反應。因此，炭疽致死毒素可大幅抑制血小板凝集。
權利要求
1.可溶性P-選擇素在制備治療全身性出血疾病的藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的可溶性P-選擇素選自天然存在的可溶性P-選擇素、其遺傳工程重組體、多形性(polymorphic)變體、對偶(allelic)變體及其它異構體。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的可溶性P-選擇素選自天然存在的可溶性P-選擇素及其遺傳工程重組體。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的可溶性P-選擇素可經(jīng)口服或靜脈內注射用藥。
5.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的可溶性P-選擇素的用藥量為每公斤體重應用藥約0.1毫微克至約100毫克。
6.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的全身性出血疾病選自出血性登革熱、出血性蛇毒及炭疽病。
7.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的全身性出血疾病為菌血癥中的出血病況。
8.一種炭疽致死毒素在制造治療抗血栓疾病藥物的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述的炭疽致死毒素選自天然存在的炭疽致死毒素、其遺傳工程重組體、多形性(polymorphic)變體、對偶(allelic)變體及其它異構體。
10.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述的炭疽致死毒素選自天然存在的炭疽致死毒素及其遺傳工程重組體。
11.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述的炭疽致死毒素可經(jīng)口服或靜脈內注射用藥。
12.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述的炭疽致死毒素的用藥量為每公斤體重應用藥約0.1毫微克至約100毫克。
13.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述的抗血栓疾病選自心臟病及腦中風。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可溶性P－選擇素在制備治療全身性出血疾病藥物的應用。本發(fā)明另提供一種炭疽致死毒素在制造治療抗血栓疾病藥物的應用。
文檔編號A61P7/00GK1565619SQ0314654
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月7日 優(yōu)先權日2003年7月7日
發(fā)明者張新侯, 孫德珊 申請人:張新侯