專利名稱：一種抗炭疽pa抗原的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗炭疽單抗的基因和基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備炭疽治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炭疽是由炭疽芽胞桿菌(Bacillus Anthrax)引起的人畜共患重大烈性傳染病。在世界范圍內(nèi)具有廣泛的分布。根據(jù)感染途徑不同，人類炭疽分為皮膚炭疽、胃腸炭疽和吸入性炭疽三種原發(fā)類型。在我國(guó)，肺炭疽因?yàn)椴∷缆矢叨鳛镮類傳染病進(jìn)行管理。炭疽芽孢桿菌包含兩個(gè)主要的毒力因子以Y鍵相聯(lián)結(jié)的聚-D-谷氨酰莢膜(PGA)和由三種蛋白組分構(gòu)成的炭疽毒素。其中莢膜能阻止細(xì)菌被宿主免疫細(xì)胞吞噬，而毒素是造成宿主損傷和死亡的主要原因。炭疽毒素由細(xì)菌質(zhì)粒POXl編碼，包括三種蛋白質(zhì)成分保護(hù)性抗原(Protective antigen,PA)、致死因子(Lethal factor,LF)和水腫因子(Edema factor,EF)。其中PA能誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫，是目前唯一獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的人用炭疽吸附疫苗(anthrax vaccine absorbed,AVA)的主要免疫活性成分。LF具有金屬依賴的蛋白酶活性，能夠分解MAPKK (mitogen-activated protein kinase kinase,有絲分裂原激活蛋白激酶激酶)并使巨噬細(xì)胞溶解；EF具有鈣調(diào)蛋白依賴的腺苷酸環(huán)化酶活性，可使靶細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度升。致宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路損傷，防御能力下降，打破體液平衡導(dǎo)致水腫。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，炭疽毒素是一種AB (active-binding)的模式。PA是復(fù)合物中的“B”，與
細(xì)胞膜上的炭疽毒素受體(anthrax toxin receptor, ATR)-腫瘤肉皮細(xì)胞標(biāo)志8 (TEM8)
或2型毛細(xì)血管形成蛋白(CMG2)結(jié)合，由位于細(xì)胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD片段(PA63)發(fā)生寡聚化，在膜上形成七聚體((PA63)7)。LF和EF是“A”，能夠結(jié)合七聚體形成的復(fù)合物通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)吞小體酸性pH的環(huán)境下，PA七聚體發(fā)生構(gòu)象改變，形成一個(gè)管道，使EF和LF進(jìn)入胞液，分別發(fā)揮毒性作用。這三個(gè)蛋白本身都是無(wú)毒的,但PA和LF的混合物稱為致死毒素(Lethal toxin,LT),可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致死性休克。PA和EF的混合物稱為水腫毒素(Edema toxin, ET)，在注射處可引起水腫。炭疽的醫(yī)學(xué)防護(hù)措施主要有預(yù)防和治療二大方面。目前有效的預(yù)防措施主要是接種炭疽疫苗，接觸前I 2個(gè)月進(jìn)行預(yù)防性接種，能為人員提供免疫防護(hù)。有效的治療措施主要有二大類一類是炭疽桿菌的抑菌劑和殺菌劑，其中包括抗菌素和噬菌體的溶菌成分；另一類是依據(jù)炭疽病理模型設(shè)計(jì)的毒素抑制劑，主要包括炭疽毒素中和抗體、可溶性受體、毒素突變體和小分子拮抗劑。目前炭疽的治療主要依靠抗菌素，多種抗菌素對(duì)炭疽有效，但如出現(xiàn)以下情況，臨床上往往不能奏效。I、未能及時(shí)服用抗菌素抗菌素一般需要在機(jī)體接觸炭疽芽孢后的48小時(shí)內(nèi)使用，即繁殖體階段使用，可以有效治療。但炭疽感染的潛伏期可以持續(xù)數(shù)小時(shí)甚至幾天，這一階段的癥狀表現(xiàn)類似流感，易誤診，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)；
2、人體產(chǎn)生耐藥性抗菌素濫用是目前嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題，一些個(gè)體對(duì)許多抗菌素已產(chǎn)生抗藥性，使得抗菌素治療無(wú)效；3、炭疽桿菌人為改構(gòu)將抗菌素抗性基因?qū)胩烤覘U菌，使外用抗菌素失效，這在現(xiàn)今基因操作技術(shù)上已完全可能?？咕貙?duì) 吸入性炭疽的治療雖然有效，但必須在感染初期立即使用，抗菌素只能殺死人體組織內(nèi)的部分炭疽熱孢子和細(xì)菌，卻不能抵抗孢子和細(xì)菌在體內(nèi)產(chǎn)生的大量毒素，而在感染晚期由于毒素的大量產(chǎn)生，仍會(huì)導(dǎo)致患者死亡。目前國(guó)外的研究主要集中在發(fā)現(xiàn)能抵抗炭疽毒素的藥物方面，包括中和單抗、可溶性受體、PA突變體和小分子抑制劑等。中和單抗因?yàn)榫哂斜Ｗo(hù)性高，半衰期長(zhǎng)，性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為目前最有前景的炭疽毒素抑制劑。不管是抗菌素還是中和單抗，單獨(dú)用藥均存在不足，設(shè)想在特殊情況下，聯(lián)合應(yīng)用抗菌素和中和性單抗可以相互彌補(bǔ)，最大可能的發(fā)揮治療作用。目前單抗和抗菌素聯(lián)合用藥處于臨床研究階段。Pharmathene公司2009年開(kāi)展的環(huán)丙沙星和Valortim(單抗)以及Doxycycline和Valortim(單抗)聯(lián)合用藥的I期臨床試驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，抗LF/EF抗體能阻斷LT/ET發(fā)揮活性，保護(hù)動(dòng)物抵抗炭疽毒素或者炭疽芽孢的攻擊。但是無(wú)論是被動(dòng)免疫還是治療，效果均不及抗PA抗體。而抗PA中和性抗體的作用要比針對(duì)炭疽毒素其他組分的中和性抗體更加重要。①在感染初期，因莢膜表面有PA的存在，抗PA抗體能與芽孢結(jié)合，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，抑制出芽或通過(guò)氧化殺死正在出芽的芽孢，因此，抗PA抗體具有抗芽孢的活性。②芽孢被巨噬細(xì)胞吞噬后，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞裂解，釋放繁殖體，并伴有一定量的PA，LF及EF的分泌表達(dá)，蛋白酶水解PA，裝配成七聚體，結(jié)合LF和EF后內(nèi)吞入細(xì)胞發(fā)揮毒素作用?？筆A抗體可以通過(guò)抑制PA裝配或與細(xì)胞結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。國(guó)內(nèi)外的研究表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗體，能夠起到預(yù)防炭疽感染保護(hù)機(jī)體的作用。而且，在攻毒后一定時(shí)間內(nèi)給藥(24 48h)仍能夠起到保護(hù)作用，即使是在出現(xiàn)體征(如休克)后給藥也可以起到一定的治療作用。已經(jīng)有多家公司或研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行抗炭疽抗體的研究，其中有4家宣布完成I期臨床研究(3家重組，I家為血液提取制品)，2家公司正在進(jìn)行I期臨床(I家重組，I家血液提取的)，(www. clinicaltrial. gov),多家公司正在進(jìn)行臨床前研究。中國(guó)專利200480017547. 7公開(kāi)了一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體(5E8)，但是該單抗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，未能表現(xiàn)出良好的保護(hù)效果，因此距離藥物開(kāi)發(fā)還具有較大的距離。中國(guó)專利200610165844. 7也公開(kāi)了一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體(5E1)，但是發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞水平上，5E1與PA的結(jié)合力偏弱，不能用于以后的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。因此本發(fā)明的目的就是提供具有更高的親合力和良好保護(hù)效果，人源化程度更高的抗炭疽PA毒素的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)單克隆抗體技術(shù)篩選到了對(duì)炭疽PA抗原具有高度親合力的單克隆抗體，并獲取了賦予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的氨基酸和核苷酸序列，并對(duì)所述抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)以及可變區(qū)FR1-4區(qū)進(jìn)行了人源化改造，最終獲得了具有特異的抗原結(jié)合性、優(yōu)異的毒素中和活性以及良好的動(dòng)物保護(hù)功能。
本發(fā)明首先公開(kāi)了一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N02第45_54、69_87、120-129位氨基酸序列所示，在本發(fā)明中，同時(shí)以SEQ ID N012、14和16分別表示重鏈可變區(qū)的⑶R1XDR2和⑶R3區(qū)的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)的⑶R1XDR2和⑶R3區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N018第46-55、71-77、110-118位氨基酸序列所示，在本發(fā)明中，同時(shí)以SEQ ID N028、30、32分別表示輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)的FR1-FR4區(qū)氨基酸序列分別如SEQ ID N04、6、8、10所示，重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N034所示；輕鏈可變區(qū)的FR1-FR4區(qū)氨基酸序列分別如SEQ ID N020、22、24、26所示，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。該抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的FR1-FR4區(qū)以及重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)均是經(jīng)過(guò)人源化改造的序列，而CDR區(qū)未進(jìn)行人源化改造，故稱之為人源化抗體。所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO 2第1_140位氨基酸序列所示，重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO 34所示；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO18第1-128位氨基酸序列所示，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO 36所示。該抗體的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)是經(jīng)過(guò)人源化改造的序列，而重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)未進(jìn)行人源化改造，故稱之為嵌合抗體。在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述單克隆抗體重鏈全長(zhǎng)氨基酸序列如SEQID NO 2所示，輕鏈全長(zhǎng)氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示。該抗體的重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)，輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)未進(jìn)行人源化改造，故稱之為鼠源抗體。本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體重鏈和輕鏈的核酸，在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述人源化抗體的重鏈的可變區(qū)的⑶R1XDR2和⑶R3區(qū)的堿基編碼序列分別如SEQ IDNO I第133-162、184-255、358-387位核苷酸所示，在本發(fā)明中，同時(shí)以SEQ ID N011、13和15分別表示重鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)的堿基編碼序列；FR1_FR4區(qū)堿基序列分別如SEQ ID N03、5、7、9所示，重鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述人源化抗體輕鏈的可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N03第136-165、211-231、328-354所示，在本發(fā)明中，同時(shí)以SEQ ID N027、29和31分別表示輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的堿基編碼序列；FR1_FR4區(qū)堿基序列分別如SEQ ID N019、21、23、25所示，輕鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N035所示。在另一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述嵌合抗體的重鏈可變區(qū)的堿基編碼序列如SEQ IDNOl第1-420位核苷酸所示，重鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述輕鏈可變區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N03第1-384位核苷酸所示，輕鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N035 所示。在又一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述鼠源抗體重鏈的堿基編碼序列如SEQ ID NOl所示，所述輕鏈的堿基編碼序列如SEQ ID NO 17所示。本發(fā)明還提供了含有上述編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的核苷酸編碼的表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述載體為pMH3S分泌型真核表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細(xì)胞為CHO-S細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了上述任一單克隆抗體在制備炭疽治療藥物中的應(yīng)用。所述單克隆抗體可以作為藥物分子特異性識(shí)別和結(jié)合炭疽PA抗原，從而抑制PA裝配或與細(xì)胞結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，預(yù)防炭疽感染或者治療炭疽感染性疾病。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述組合物含有上述任一單克隆抗體，以及可藥用的載體。本發(fā)明還提供了一種含有上述任一單克隆抗體的免疫交聯(lián)物，其特征在于，所述單克隆抗體與效應(yīng)分子連接。所述單克隆抗體在免疫交聯(lián)物中起靶向作用，可以將具有特殊生化效應(yīng)的效應(yīng)分子遞送至炭疽病原體上，發(fā)揮治療效應(yīng)，細(xì)胞毒素、或者放射性同位素均可以作為效應(yīng)分子與上述單克隆抗體形成免疫交聯(lián)物。本發(fā)明提供的單克隆抗體由于在重鏈和輕鏈可變區(qū)具有獨(dú)特的CDR1-3區(qū)序列，使所述抗體對(duì)炭疽桿菌具有特異的識(shí)別和結(jié)合能力。在ELISA檢測(cè)PA與單抗的結(jié)合活性 的實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的人源化單抗靈敏度為8ng/ml，可以用于藥物代謝研究。而鼠源單抗的靈敏度為4-8ng/ml。顯示本發(fā)明提供的抗炭疽PA抗原的單克隆抗體具有高度特異的PA結(jié)合活性。本發(fā)明提供的單克隆抗體也顯示出了優(yōu)異的毒素中和活性。人源化抗體的EC5tl為O. 063ug/ml，嵌合抗體的EC5tl為O. 070ug/ml，而中國(guó)專利200610165844. 7公開(kāi)的抗炭疽PA抗原的單克隆抗體5E1的EC5tl為O. 167ug/ml (EC50值越低保護(hù)效果越好)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明的單抗較以前的5E1單抗在細(xì)胞水平顯示更好的保護(hù)效果。本發(fā)明提供的單克隆抗體還顯示了在制備炭疽治療藥物中的用途。在大鼠毒素模型上(PA+LF)抗體的保護(hù)效果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明所提供的嵌合單抗存活達(dá)到83% (5/6)，人源化單抗的存活達(dá)到80% (4/5)，而中國(guó)專利200480017547. 7所公開(kāi)的人源單抗組大鼠全部死亡。該實(shí)驗(yàn)顯示了本發(fā)明提供的單克隆抗體具有良好的動(dòng)物保護(hù)功能，可以應(yīng)用于制備炭疽治療藥物。


圖I人源化抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)基因克隆的電泳鑒定圖；圖2人IgGl重鏈恒定區(qū)基因(Ch)和人Kappa輕鏈恒定區(qū)基因(Ck)克隆的電泳鑒定圖；圖3人源化抗體重鏈基因(H)和輕鏈基因(L)克隆的電泳鑒定圖；圖4pMD_H和pMD_L的酶切鑒定結(jié)果圖；圖5pMH3S的構(gòu)建流程圖；圖6pMH3S_H酶切鑒定結(jié)果圖；圖7pMH3S_L酶切鑒定結(jié)果圖；圖8pMH3S_H的構(gòu)建流程圖；圖9pMH3S_L的構(gòu)建流程圖；圖10純化的人源化抗體的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖；圖11單克隆抗體對(duì)PA抗原敏感性的ELISA檢測(cè)圖；圖12體外細(xì)胞毒素模型上三種類型抗體的EC5tl曲線圖；圖13大鼠毒素模型上三種類型抗體的動(dòng)物存活曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍構(gòu)成進(jìn)一步的限定。實(shí)施例I.鼠源單抗基因的克隆I. I鼠源單抗的制備以重組炭疽保護(hù)性抗原為免疫原，采用常規(guī)單克隆抗體制備方法獲得的I株高親和力、高特異性的鼠源性抗PA單抗5E11雜交瘤細(xì)胞株，分泌的抗體分子亞型為IgGl，輕鏈為Kappa亞型。I · 2單抗5E11輕重鏈基因的克隆單抗由可變區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)成，因?yàn)槭髥慰沟目勺儏^(qū)基因變異大，而恒定區(qū)的基因序列非常保守，因此采用5' -RACE方法進(jìn)行克隆，其基本原理是在未知序列的5'端添加引物序列，與3'端的保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得的鼠源單抗基因可用于構(gòu)建表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，最終獲得表達(dá)產(chǎn)物，以便與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗體和人源化抗體進(jìn)行功能比較研究。操作步驟如下包括A :總RNA的提??；B RNA的去磷酸化；C :去帽子反應(yīng)；D 5' -RACE適配子連接；E :反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；F :外引物PCR反應(yīng)；G :內(nèi)引物反應(yīng)；H :瓊脂糖凝膠電泳:切膠回收特異性PCR產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行DNA序列測(cè)定J =BLAST檢索分析序列的正確。具體參考說(shuō)明書(TaKaRa，D315)。簡(jiǎn)單描述如下A總RNA的提取取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5E11雜交瘤細(xì)胞(5 X IO6)，采用Trizol —步法提取總RNA，取少量進(jìn)行紫外分光光度計(jì)定量及I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。B RNA 的去磷酸化使用 CIAP (TaKaRa，D315)，反應(yīng)體系 50ul，包括總 RNA2ul (lug/ul)，NRAse 抑制劑 Iul (40U/UL)，10 X 緩沖液 5ul，CIAPO. 6ul, (16U/ul)，50°C反應(yīng) I 小時(shí)。C去帽子反應(yīng)CIAP處理過(guò)的RNA7ul，NRAse抑制劑Iul (40U/ul)，IOX緩沖液lul, TAPlul, (O. 5U/ul)，37°C反應(yīng) I 小時(shí)。05; -RACE適配子連接連接體系40ul，依次加入CIAP/TAP處理過(guò)的RNA5ul，51 RACE適配子(15uM) lul, NRAse的水4ul ;65°C反應(yīng)5分鐘后，冰上放置2分鐘，然后依次加入 NRAse 抑制劑 lul(40U/UL)，5X 連接緩沖液 8ul，40% 的 PEG600020ul，T4RNA 連接酶lul，16°C反應(yīng)I小時(shí)。E反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系包括連接后的RNA為6ul，隨機(jī)引物O. 5ul，55X緩沖液2ul, dNTPlul, NRAse 抑制劑 O. 25ul (40U/UL)，MMLVO. 25ul (200U/ul)。混勻，3(TC IOmin,50°C 60min,5°C 5min。反應(yīng)產(chǎn)物置于_20°C備用。F外引物PCR反應(yīng)反應(yīng)體系為Ex Taq聚合酶(5U/μ L) O. 25 μ L ; 10 XEx TaqBuffer5 μ L ；dNTP Mixture (各 2. 5mM)4 μ L ;模板 cDNA2. 5 μ L ；5/ RACE 外引物 2ul，特異性外引物2ul，加滅菌蒸餾水至50 μ L，混勻，瞬時(shí)離心后，置PCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3分鐘，接著940C 30s, 520C 30s, 72°C lmin，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。G內(nèi)引物反應(yīng)除模板為外引物反應(yīng)液，引物使用內(nèi)引物外，其余反應(yīng)液體同外引物PCR反應(yīng)。
H瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物H和L經(jīng)瓊脂糖凝膠(1% )電泳后，切膠分離靶片段。通過(guò)凝膠純化試劑盒(BIO BASIC INC)回收純化后，凝膠電泳鑒定。I切膠回收特異性PCR產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行DNA序列測(cè)定將回收后的PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體。連接反應(yīng)體系為pMD18-T載體lul，PCR產(chǎn)物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水Iul，連接緩沖液5ul，混勻后16°C過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選重組克隆，然后采用通用測(cè)序引物測(cè)序。獲得的質(zhì)粒命名為pMD-mouse-H和pMD-mouse-L。測(cè)序后，對(duì)獲得的基因序列用Vector NTI軟件進(jìn)行分析，鼠源單抗重鏈全長(zhǎng)為1392個(gè)堿基，其中1-420位堿基編碼可變區(qū)，421-1392位堿基編碼恒定區(qū)?？勺儏^(qū)包括4個(gè)框架區(qū)(Fragment region, FR)和 3 個(gè) CDR(Complementary determinant region, CDR),其中1-57位堿基編碼信號(hào)肽，58-129位堿基編碼FRl，133-162堿基編碼CDRl ; 163-183堿 基編碼FR2，205-261堿基編碼CDR2 ;256_357堿基編碼FR3，358-387堿基編堿基碼CDR3 ；388-420堿基編碼FR4。鼠源單抗輕鏈全長(zhǎng)為708個(gè)堿基，包括1-384位堿基編碼可變區(qū)和385-708位堿基編碼的恒定區(qū)。對(duì)可變區(qū)進(jìn)行注釋，1-66位堿基編碼信號(hào)肽，67-135位堿基編碼FR1，136-165堿基編碼CDRl ; 166-210位堿基編碼FR2，211-231位堿基編碼CDR2 ;232_327堿基編碼FR3 ; 328-354堿基編碼CDR3 ; 355-384堿基編碼FR4。實(shí)施例2.嵌合抗體基因的克隆鼠源抗體相對(duì)于人體，屬于異源蛋白應(yīng)用于人體具有明顯的抗宿主抗體反應(yīng)，因此常采用人源化改造的策略降低免疫原性，簡(jiǎn)單方便的方法是進(jìn)行恒定區(qū)的人源化，用人的恒定區(qū)替換鼠的恒定區(qū)，即構(gòu)建嵌合抗體。2. I人恒定區(qū)的密碼子優(yōu)化及全基因合成采用優(yōu)化的密碼子可以提高蛋白的表達(dá)，首先采用軟件對(duì)人IgGl重鏈恒定區(qū)(GenBank登錄號(hào)Z17370)和人Kappa輕鏈恒定區(qū)基因(GenBank登錄號(hào)GI :341915149)按照鼠密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的兩條基因序列(基因序列分別為SEQ ID N033和SEQID N035，委托博邁德進(jìn)行全基因合成，并克隆到T載體上(分別命名為T-0PTI_hu-IgGl-CH和T-0PTI_hu-CKAPPA)進(jìn)行序列測(cè)定。2. 2嵌合抗體基因全分子的克隆根據(jù)擴(kuò)增獲得基因序列和密碼子優(yōu)化后恒定區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)引物，5Ell-VH_up 5' -GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3' ; 5E11-Vh-lower 5-/ TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGAGAGTGG-3' ；0p-IgGl-up 5-/ AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3' ；0p-IgGl-down 5-/ GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3'。其中，5E1 I-Vh-UP 和 5E1 l-VH_lower 用于擴(kuò)增可變區(qū)，Op-IgGl-up和Ορ-IgGl-down用于擴(kuò)增人IgGl重鏈恒定區(qū)。5Ell_VH_up和Op-IgGl-down用于擴(kuò)增嵌合抗體全長(zhǎng)重鏈。輕鏈引物5EI l-VL-up 5/ -GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3' ；5E11-Vl-lower 5-' GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3' ；0p-kappa-up 5-1 ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3' ；0p-kappa-down 5-/ GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCTTG-3'。其中，5E11_VL-up 和 5E11_VL-lower 用于擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)，Op-kappa-up和Op-kappa-down用于擴(kuò)增人Kappa亞型輕鏈恒定區(qū)。5E11-Vl-Up和Op-kappa-down用于擴(kuò)增輕鏈全長(zhǎng)。GAATTC為Eco RI的酶切位點(diǎn)，GCGGCCGC為Not I的酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系50μ I 反應(yīng)體系中含有10Xbuffer5ul ；dNTP(O. 2mM)4ul ；Pyrobest Taq 酶 0. 25ul ;上下游引物各 O. 5ul (重鏈恒定區(qū) Op-IgGl-up 和 Op-IgGl-down,輕鏈恒定區(qū)用Op-kappa-up和Op-kappa-down);輕重鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增使用模板為pMD-mouse-H和pMD-mouse-L,恒定區(qū)的擴(kuò)增使用模板為T-OPTI-hu-1gGI-Ch和T-0PTI-hu-CKappa，各取O. Iul質(zhì)粒作為模板；用純水補(bǔ)足到50 μ I。PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性940C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin20s ;25 循環(huán)。最后 72°C 5min。PCR產(chǎn)物回收純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠并用BBI公司的回收試劑盒回收。
嵌合抗體L、H鏈基因的擴(kuò)增將5E11Vh和人IgGl亞類Ch基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50ul進(jìn)行純化，回收后備用。取純化后產(chǎn)物各Iul為模板，以擴(kuò)增嵌合抗體重鏈基因；將5E11Vl和人KAPPA型基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50ul進(jìn)行純化，回收后備用進(jìn)行嵌合抗體L鏈基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性3min，接著擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性25s，50。。復(fù)性 25s，72。。延伸 60s，最后 72°C延伸 5min。嵌合抗體L、H鏈基因PCR產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行DNA序列測(cè)定將回收后的PCR產(chǎn)物連入PMD18-T載體。連接反應(yīng)體系為pMD18-T載體lul，PCR產(chǎn)物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水Iul，連接緩沖液5ul，混勻后16°C過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選重組克隆，然后采用通用測(cè)序引物測(cè)序。獲得的質(zhì)粒命名為pMD-chimeric-H和pMD-chimeric-L。實(shí)施例3.人源化單抗基因的克隆3. I人源化單抗基因設(shè)計(jì)嵌合抗體即用人的恒定區(qū)基因替換掉鼠的恒定區(qū)基因，相比鼠源抗體人源化程度達(dá)到75%。進(jìn)一步人源化的方法是對(duì)可變區(qū)進(jìn)行人源化。基本的策略是保持互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸系列不變，將框架區(qū)氨基酸序列依次檢索人源的抗體庫(kù)，獲得最大同源性的序列，將相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行突變。重鏈可變區(qū)的FRl，F(xiàn)R2 和 FR4 分別與 gb AAS85990. 1，gb ADW08153. I, emb CAK50646. I具有100%的同源性，不改變氨基酸序列。FR3與emb CAR62720. I具有88%的同源性，在4個(gè)氨基酸位置存在差異，進(jìn)行定點(diǎn)突變。共改變4個(gè)氨基酸。輕鏈可變區(qū)的FRl與emb CAA80562. I具有74%的同源性，突變6個(gè)氨基酸。FR2與gb :ABB54406. I具有80%的同源性，有3個(gè)氨基酸的差異，改變其中的2個(gè)氨基酸，與⑶R相鄰的I個(gè)氨基酸未進(jìn)行改變。FR3與gb AAQ21830. I具有84%的同源性，對(duì)差異的3個(gè)氨基酸進(jìn)行突變。共進(jìn)行11個(gè)氨基酸突變。3. 2抗PA單抗人源化可變區(qū)基因的化學(xué)合成設(shè)計(jì)好的可變區(qū)人源化序列委托博邁德生物技術(shù)公司人工合成全基因，并克隆到T載體上，分別命名為pMD-humanized_VH和pMD-humaniZed-Vlj,測(cè)序正確后進(jìn)行后續(xù)的研究。3. 3人源化全分子基因的克隆根據(jù)人源化后的輕重鏈可變區(qū)基因序列和密碼子優(yōu)化后人恒定區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)引物，因?yàn)橥蛔兊陌被嵛挥趦?nèi)部所以使用的引物同嵌合抗體的構(gòu)建。重鏈引物5EIl-VH-up 5/ -GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3'；5Ell-VH-lower 5-/ TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGAGAGTGG-3'；Op-IgGl-up 5-/ AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3'；Op-IgGl-down 5-/ GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3'。其中，5EII-Vh-UP和5EIl-VH_lower 用于擴(kuò)增可變區(qū)，Op-IgGl-up 和 Op-IgGl-down用于擴(kuò)增人IgGl重鏈恒定區(qū),5EIl-VH-up和Op-IgGl-down用于擴(kuò)增嵌合抗體全長(zhǎng)重鏈。
輕鏈引物5EIl-VL-up 5/ -GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3;；5Ell-VL-lower 5- ' GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3/ ；Op-kappa-up :5-' ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3'；Op-kappa-down 5-/ GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCTTG-3'。其φ, 5EIl-VL-up 和 5Ε1 l-VL-lower 用于擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)，Op-kappa-up 和Op-kappa-down用于擴(kuò)增人Kappa亞型輕鏈恒定區(qū)，5Ell-VL-up和Op-kappa-down用于擴(kuò)增輕鏈全長(zhǎng)。GAATTC為ECo RI的酶切位點(diǎn)，GCGGCCGC為Not I的酶切位點(diǎn)。50 μ I PCR 反應(yīng)體系含有10Xbuffer5ul ;dNTP(0. 2mM)4ul ;PyrobestTaq 酶0. 25ul ;上下游引物各0. 5ul (重鏈恒定區(qū)Op-IgGl-up和Op-IgGl-down,輕鏈恒定區(qū)用Op-kappa-up和Op-kappa-down);輕重鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增使用模板為pMD-mouse-H和 pMD-mouse-L，恒定區(qū)的擴(kuò)增使用模板為 T-OPTI_hu_IgGI-Ch 和 T-0PTI_hu-CKAPPA，各取
O.Iul質(zhì)粒作為模板；用純水補(bǔ)足到50 μ I。PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性94°C 5min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C lmin20s ；25 循環(huán)。最后 72°C 5min。PCR產(chǎn)物回收純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠并用BBI公司的回收試劑盒回收。電泳結(jié)果見(jiàn)(見(jiàn)附圖1，圖2)。圖I中M泳道為分子量標(biāo)記，I泳道和2泳道分別為人源化的Vh和人源化的Vk片段。圖2中，M泳道為分子量標(biāo)記，I泳道和2泳道分別SCi^PCk片段。人源化抗體L、H鏈基因的擴(kuò)增將5E11Vh和人IgGl亞類Ch基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50ul進(jìn)行純化，回收后備用。取純化后產(chǎn)物各Iul為模板，以擴(kuò)增人源化抗體重鏈基因；將5E11Vl和人KAPPA型基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50ul進(jìn)行純化，回收后備用進(jìn)行人源化抗體L鏈基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性3min，接著擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性25s，50°C復(fù)性25s，72°C延伸60s，最后72°C延伸5min。PCR電泳結(jié)果(見(jiàn)附圖3)。圖3中，M泳道為分子量標(biāo)記，I泳道和2泳道分別為人源化的L和人源化的H片段。人源化抗體L、H鏈基因PCR產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行DNA序列測(cè)定將回收后的PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體。連接反應(yīng)體系為pMD18-T載體lul，PCR產(chǎn)物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水lul，連接緩沖液5ul，混勻后16°C過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α ,篩選重組克隆,然后采用通用測(cè)序引物測(cè)序。獲得的質(zhì)粒命名為pMD-humanized-H和pMD-humanized-L。酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4，M泳道為分子量標(biāo)記，I泳道和2泳道分別為pMD-humanized-H單酶切(Not I)和雙酶切(EcoRI/Not I) ;3泳道和4泳道分別為pMD-humanized-L 單酶切(Not I)和雙酶切(Eco RI/Not I)。實(shí)施例4.鼠單抗，人-鼠嵌合抗體和人源化抗體基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建4. I構(gòu)建策略不管是輕鏈還是重鏈，在5'端設(shè)計(jì)引物時(shí)引入Eco R I的酶切位點(diǎn)，在3'端引ANot I酶切位點(diǎn)，克隆到pMD-T載體上，經(jīng)過(guò)DNA序列測(cè)定正確后，用Eco R I/Not I酶切 pMD-mouse-H(pMD-Chimeric-H 或 pMD-humanized-H)得到約 I. 4kb 的片段，亞克隆到PMH3S的相應(yīng)位點(diǎn)，得到鼠源抗體的重鏈表達(dá)質(zhì)粒pMH3S-mouSe-H(嵌合抗體重鏈表達(dá)質(zhì)粒pMH3S-Chimeric-H或人源化抗體的重鏈表達(dá)質(zhì)粒pMH3S-humanized_H)；同樣的方法,用EcoRI/Notl 酶切 pMD-mouse-L (pMD-Chimeric-L 或 pMD-humanized-L)得到約 O. 7 片段，亞克隆到pMH3S的相應(yīng)位點(diǎn)，得到鼠源抗體輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒pMH3S-mouse-L (嵌合抗體輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒pMH3S-Chimeric-L或人源化抗體輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒pMH3S-humanized_L)。4. 2pMH3S分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建以常用的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+) (Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)V790-20)為基本骨架，將Kozak序列(GCCGCCACCATGA/G)和修改后的人組織纖溶酶原信號(hào)肽序列融合基因(見(jiàn)SEQ ID N03)克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建成pMH3S分泌型真核表達(dá)載體。修改后的基因中，通過(guò)將融合基因核苷酸序列5'端第70-78位的TCGAACAGC(編碼氨基酸S-N-S)，突變成TCGAATTCT (編碼氨基酸S-N-S)，在保證氨基酸序列不改變的前提下引AEco RI的酶切位點(diǎn)(GAATTC)方便目的基因直接通過(guò)Eco RI位點(diǎn)連接到pMH3S載體上，信號(hào)肽與目的基因之間沒(méi)有多余的氨基酸，目的蛋白可以分泌到上清中，方便下游的純化。構(gòu)建過(guò)程I)首先人工合成Kozak序列(CCACCATG (A/G))和修改后的人組織纖溶酶原信號(hào)肽序列的融合基因；2)將 PCDNA3. I (+)用 EcoRI 酶切后，用 Klenow 酶(TaKaRa，產(chǎn)品目錄號(hào)D2140)補(bǔ)平，然后用小腸堿性磷酸酶CIP (NEB公司，產(chǎn)品目錄號(hào)M0290V)去磷酸化避免自連；3)將合成的基因和酶切后的載體用T4DNA連接酶(NEB公司，產(chǎn)品目錄號(hào)M0202V)進(jìn)行連接；4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，挑選具有氨芐青霉素抗性的克隆；5)用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序鑒定后獲得預(yù)期的pMH3S載體(pMH3S的構(gòu)建流程見(jiàn)圖5。)4. 3重鏈表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRI 和 NotI(NEB 公司)雙酶切 pMD-mouse-H(pMD-chimereic_H 或pMD-humanized-H),用膠回收試劑盒(中國(guó),BBI公司)回收H片段(長(zhǎng)度約I. 4kb)連接到用EcoRI和Not I雙酶切的pMH3S上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，在100 μ g/ml的氨芐青霉素LB平板上培養(yǎng)，挑選抗性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)(PCR條件同實(shí)施例I中的步驟(3))，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)陽(yáng)性后，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日用質(zhì)粒提取試劑盒(中國(guó)，OMEGA公司)提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(EcoRI/Not I)鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6中，M泳道為分子量標(biāo)記，I泳道為質(zhì)粒PMH3S-H用Not I進(jìn)行單酶切線性化后的結(jié)果，2泳道為EcoRI/Notl雙酶切后的結(jié)果。表達(dá)載體構(gòu)建流程見(jiàn)圖8。
4. 4pMH3S-L 質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRI 和 Not I(NEB 公司)酶切 pMD-mouse-L(pMD-chimereic-L 或pMD-humanized-L),用膠回收試劑盒(中國(guó),BBI公司)回收L片段(長(zhǎng)度約O. 7kb)連接到用EcoRI和Not I雙酶切的pMH3S上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，在100 μ g/ml的氨芐青霉素LB平板上培養(yǎng)，挑選抗性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)(PCR條件同實(shí)施例I中的步驟(3))，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)陽(yáng)性后，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日用質(zhì)粒提取試劑盒(中國(guó)，OMEGA公司)提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(Eco RI/Not I)鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7中，M泳道為分子量標(biāo)記，I泳道為質(zhì)粒pMH3S-L用NotI進(jìn)行單酶切后線性化后的結(jié)果，2泳道為EcoRI/Not I雙酶切后的結(jié)果。表達(dá)載體構(gòu)建流程見(jiàn)圖9。實(shí)施例5.電轉(zhuǎn)及細(xì)胞克隆的篩選從液氮中取CHO-S細(xì)胞復(fù)蘇，在T25方瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM/F12+10% FBS,置于37 °C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma)中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿后傳入T75方瓶中。在T75方瓶 中長(zhǎng)滿后，加入3ml胰酶消化30s，吸棄胰酶，用PBS洗細(xì)胞兩次離心后，取I. 5 X IO7細(xì)胞用0.5ml PBS (pH7. 2)重懸，取10 μ I鮭精，線性化的表達(dá)質(zhì)粒IOyg(輕鏈質(zhì)粒pMH3S-humanized-L3. 3 μ g 和的重鏈質(zhì)粒 pMH3S-humanized_H6. 7 μ g 二者比例為 1:2)，加入到準(zhǔn)備好的細(xì)胞當(dāng)中，混勻后加入到預(yù)冷的2mm電轉(zhuǎn)杯中冰浴，用電轉(zhuǎn)儀160V電擊。電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞分成兩份置于直徑IOcm的塑料培養(yǎng)皿中，分別加入IOml的含有10% FBS、無(wú)雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。置于37°C、5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換新鮮的IOml的含有10% FBS、無(wú)雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。待細(xì)胞長(zhǎng)至50 60%滿時(shí)，加入
I.8mg/ml的G418,隔天換液,洗掉死細(xì)胞,G418濃度始終維持在I. 8mg/ml,直至細(xì)胞不再死亡，克隆形成。將形成的克隆轉(zhuǎn)移至96孔板中，用含有10% FBS、無(wú)雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，G418濃度為O. 6mg/ml，置于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測(cè)表達(dá)量，篩選高表達(dá)的細(xì)胞克隆。實(shí)施例6.發(fā)酵和純化從液氮中取出5Ell-hu_lF3工程細(xì)胞復(fù)蘇，在T25方瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM/F12+10% FBS，長(zhǎng)滿后傳入T75方瓶中，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma)中懸浮培養(yǎng)。在T75方瓶中長(zhǎng)滿后，用胰酶消化，換自制懸浮培養(yǎng)基重懸，開(kāi)始懸浮培養(yǎng)，每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度及狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞密度及狀態(tài)補(bǔ)加培養(yǎng)基，不斷增加培養(yǎng)體積。當(dāng)培養(yǎng)體積達(dá)到30ml時(shí)，將其轉(zhuǎn)入150ml搖瓶中，搖瓶置于37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)速度為lOOrpm。繼續(xù)增加培養(yǎng)體積，使細(xì)胞密度維持在2-3 X 106/ml。當(dāng)培養(yǎng)體積達(dá)到150ml時(shí)，將其轉(zhuǎn)入3L搖瓶中，搖瓶置于37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)速度為lOOrpm。繼續(xù)增加培養(yǎng)體積，使細(xì)胞密度維持在 2-4 XlOVml ο當(dāng)培養(yǎng)體積達(dá)到4L，將其轉(zhuǎn)入10L的Wave反應(yīng)器中。溫度控制在36. 5°C，10L的Wave反應(yīng)器的搖速為10轉(zhuǎn)/分。當(dāng)Wave反應(yīng)器中的培養(yǎng)體積達(dá)到7L，不再補(bǔ)加細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，根據(jù)葡萄糖消耗情況，細(xì)胞采用流加(Fed-batch)方式培養(yǎng)，每日添加濃縮培養(yǎng)基，根據(jù)PH值情況隨時(shí)補(bǔ)充Na2CO3,使pH值維持在7. 2左右，并將溫度降低至34°C，使細(xì)胞能夠持續(xù)高密度生長(zhǎng)。發(fā)酵完畢，使用Mab select sure介質(zhì)進(jìn)行純化,裝填的層析柱體積為40ml，結(jié)合容量為30 50mg/ml。平衡緩沖液20mM PBS, pH7. 2 ;洗滌緩沖液0. IM檸檬酸緩沖液PH4. 6 ;洗脫緩沖液0. IM檸檬酸緩沖液pH3. 8和0. IM檸檬酸緩沖液pH3. 6 ;再生緩沖液O. IM檸檬酸緩沖液PH3. O。純化的5E11-人源化進(jìn)行非還原SDS-PAGE檢測(cè)見(jiàn)圖10，泳道M顯示低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道I顯示純化后的人源化單抗，分子量與預(yù)期相符。實(shí)施例7. ELISA檢測(cè)PA與單抗的結(jié)合活性重組PA稀釋成2 μ g/ml，IOOul/孔包被酶聯(lián)板，4°C過(guò)夜，次日用封閉液(20mM PB，O. 15M NaCl，5%的奶粉)37°C封閉Ih后洗板，加入樣品后37°C孵育Ih洗板，加入I :1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人Fe (Sigma, A0170)(或HRP標(biāo)記的羊抗鼠,用于檢測(cè)鼠單抗，Sigma,A3673)，37°C孵育Ih后洗板，OPD顯色，酶標(biāo)儀測(cè)OD45tl。ELISA結(jié)果比較檢測(cè)的靈敏度比較見(jiàn)圖11 :5E1-人源化大于lug/ml (即使?jié)舛葹閘ug/ml時(shí),不能顯示是陽(yáng)性結(jié)果,OD45tl值不 能達(dá)到陰性對(duì)照的2. I倍，圖11未顯示)，不能用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究；5E11-人源化單抗靈敏度為4_8ng/ml，可以用于藥物代謝研究。5E11-鼠源單抗的靈敏度為4_8ng/ml。實(shí)施例8.體外細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)抗體對(duì)致死毒素的中和活性J774A. I細(xì)胞以105/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。將用培養(yǎng)液梯度稀釋的待檢抗體與100ng/mL PA和100ng/ml LF—起于37°C孵育lh，細(xì)胞長(zhǎng)至90%滿時(shí)吸棄原細(xì)胞培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，將孵育Ih后的待測(cè)液體加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，100 μ I/孔，37°C孵育3h，加入20 μ I MTT (5mg/mL)，37°C孵育30min,吸棄上清，每孔加入100 μ I鹽酸異丙醇，振蕩至沉淀溶解。將無(wú)毒素對(duì)照孔記為細(xì)胞100%存活，無(wú)抗體對(duì)照孔(rPA和rLF濃度均為100ng/ml)記為細(xì)胞全部死亡。通過(guò)酶聯(lián)儀測(cè)OD57c!,結(jié)果通過(guò)GraphPad Prism軟件來(lái)測(cè)定 EC5tl(50% effective concentration 半數(shù)有效濃度)。結(jié)果見(jiàn)圖12，對(duì)比中國(guó)專利200610165844. 7公開(kāi)的人源化單抗5E1，本發(fā)明公開(kāi)的鼠源單抗5E11，嵌合的5E11和人源化5E11進(jìn)行毒素中和活性的EC5tl進(jìn)行評(píng)價(jià)。不同單抗的EC5tl如下，值越低保護(hù)效果越好。5E1-人源化0. 167ug/ml ;5E11-嵌合0. 070ug/ml ；5E11-人源化0. 063ug/ml。結(jié)論5E11單抗較以前的5E1單抗在細(xì)胞水平顯示更好的保護(hù)效果。實(shí)施例9.大鼠毒素模型上(PA+LF)抗體的保護(hù)效果評(píng)價(jià)使用體重200 250克的雄性Fisher344大鼠，其中5E11-嵌合單抗組6只大鼠，5E11-人源化和5E8-人源單抗組每組5只大鼠，攻毒劑量為40 μ gPA+10 μ gLF/大鼠，先尾靜脈注射毒素(注射用生理鹽水定容到300 μ I);攻毒后5分鐘尾靜脈注射5Ε11-嵌合單抗，5Ε11-人源化單抗和5Ε8-人源單抗，單抗的劑量為320ug (注射用生理鹽水定容到300 μ I)，觀察大鼠存活情況。結(jié)果見(jiàn)圖13，5Ε11_嵌合單抗組的存活率為83% (5/6)，5Ε11-人源化單抗的存活達(dá)到80% (4/5)，而5Ε8-人源單抗組大鼠全部死亡。該實(shí)驗(yàn)顯示了本發(fā)明提供的單克隆抗體具有良好的動(dòng)物保護(hù)功能，可以應(yīng)用于制備炭疽治療藥物。
權(quán)利要求
1.一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2第45_54、69_87、120-129位氨基酸序列所示；輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N018第46_55、71_77、110-118位氨基酸序列所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)的FR1-FR4區(qū)氨基酸序列分別如SEQ ID N04、6、8、10所示，重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ IDN034所示；輕鏈可變區(qū)的FR1-FR4區(qū)氨基酸序列分別如SEQ ID N020、22、24、26所示，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N02第1-140位氨基酸序列所示，重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N034所示；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N018第1-128位氨基酸序列所示，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體重鏈全長(zhǎng)氨基酸序列如SEQ ID N02所示,輕鏈全長(zhǎng)氨基酸序列如SEQ ID N018所示。
5.一種編碼權(quán)利要求2所述單克隆抗體重鏈或輕鏈的核酸，其特征在于，所述重鏈的可變區(qū)的CDRU CDR2和CDR3區(qū)的堿基編碼序列分別如SEQ ID NOl第133-162、184-255、358-387位核苷酸所示，F(xiàn)R1-FR4區(qū)堿基序列分別如SEQ ID N03、5、7、9所示，重鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述輕鏈的可變區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N03第136-165、211-231、328-354所示，F(xiàn)R1-FR4區(qū)堿基序列分別如SEQID N019、21、23、25所示，輕鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N035所示。
6.一種編碼權(quán)利要求3所述單克隆抗體重鏈或輕鏈的核酸，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID NOl第1-420位核苷酸所示，重鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述輕鏈可變區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N03第1-384位核苷酸所示，輕鏈恒定區(qū)的堿基編碼序列如SEQ ID N035所示。
7.一種編碼權(quán)利要求4所述單克隆抗體重鏈或輕鏈的核酸，其特征在于，所述重鏈的核苷酸編碼序列如SEQ ID NOl所示，所述輕鏈的核苷酸編碼序列如SEQ ID N017所示。
8.一種含有權(quán)利要求5-7所述編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的核苷酸編碼的表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述載體為PMH3S分泌型真核表達(dá)載體。
10.一種含有權(quán)利要求9所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為CHO-S細(xì)包。
12.權(quán)利要求1-4中任一所述的單克隆抗體在制備炭疽治療藥物中的應(yīng)用。
13.一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1-4中任一所述的單克隆抗體，以及可藥用的載體。
14.一種含有權(quán)利要求1-4中任一所述的單克隆抗體的免疫交聯(lián)物，其特征在于，所述單克隆抗體與效應(yīng)分子連接。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有人源化、嵌合和鼠源化形式的抗炭疽PA抗原的單克隆抗體，以及所述抗體在制備炭疽治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)的抗體具有特異的抗原結(jié)合性、優(yōu)異的毒素中和活性以及良好的動(dòng)物保護(hù)功能。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102936286SQ20121036184
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者陳薇, 李建民, 李冰, 張金龍, 侯利華, 宋小紅, 于婷, 徐俊杰, 付玲, 張軍, 劉樹玲, 任軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所