一種維生素d抗原包被的反應板的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種維生素D抗原包被的反應板，包括微孔板，所述微孔板的微孔內(nèi)包被有維生素D抗原層，所述微孔中維生素D抗原的包被量為0.1μg～10μg。本實用新型的反應板制備簡單，成本低，操作簡便，可用于檢測維生素D3、維生素D2、25羥基維生素D3與抗體的結(jié)合反應。本實用新型的反應板與普通蛋白分子沒有非特異性的結(jié)合反應，反應板具有較好的穩(wěn)定性，37℃7天保存與常規(guī)4℃保存的反應板抗原抗體結(jié)合效價無明顯變化。
【專利說明】一種維生素D抗原包被的反應板
【技術(shù)領域】
[0001]本實用新型屬于生物檢測【技術(shù)領域】，具體涉及一種維生素D抗原包被的反應板?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在過去的二十多年里，有關維生素D(vitamin D)以及其代謝產(chǎn)物的知識在爆炸性增長。維生素D在維持機體骨骼系統(tǒng)健康，預防以及治療一些自體免疫疾病和腫瘤，已經(jīng)得到廣泛共識。WHO也明確制定了在乳制品中添加vitamin D類輔助品的規(guī)定。由于vitaminD屬于脂溶性維生素類，長期，或者大量應用易引起藥物在體內(nèi)蓄積而產(chǎn)生毒副作用。因此，隨時，準確檢測食品或人體vitamin D含量的需求也越來越突出。
[0003]常規(guī)，并且公認的vitamin D檢測方法是HPLC/LC-MS，但是其一次性投入大，有機溶劑消耗高，環(huán)境污染大，因此不適合中小企業(yè)或臨床單位操作或廣泛推廣使用。隨著ELISA技術(shù)的發(fā)展以及vitamin D抗體的出現(xiàn),近二十年來,應用ELISA方法檢測vitaminD有了長足的發(fā)展。
[0004]在ELISA檢測方法中，目前已知的96孔反應板絕大多數(shù)為維生素D單克隆或多克隆抗體，或D-Binding Protein (維生素D結(jié)合蛋白)包被,個別為維生素D-蛋白分子偶聯(lián)復合物，其代價高，準備過程復雜。
實用新型內(nèi)容
[0005]本實用新型所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種維生素D抗原包被的反應板。該反應板可用于維生素D3、維生素D2、25羥基維生素D3與抗體的結(jié)合反應的檢測。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本實用新型采用的技術(shù)方案是:一種維生素D抗原包被的反應板，包括微孔板，其特征在于，所述微孔板的微孔內(nèi)包被有維生素D抗原層，所述微孔中維生素D抗原的包被量為0.1 μ g?10 μ g。
[0007]上述的一種維生素D抗原包被的反應板，所述微孔板為48孔微孔板、96孔微孔板或384孔微孔板。
[0008]上述的一種維生素D抗原包被的反應板，所述維生素D抗原為維生素D3、維生素D2或25羥基維生素D3。
[0009]本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
[0010]1、本實用新型反應板的維生素D抗原直接包被于微孔板內(nèi)，制備方法簡單，成本低，操作簡便。
[0011]2、本實用新型的反應板可用于檢測維生素D3、維生素D2、25羥基維生素D3與抗體的結(jié)合反應。
[0012]3、本實用新型的反應板與普通蛋白分子沒有非特異性的結(jié)合反應。
[0013]4、本實用新型的反應板具有較好的穩(wěn)定性，37°C 7天保存的反應板與常規(guī)4°C保存的反應板抗原抗體結(jié)合效價無明顯變化。[0014]下面結(jié)合附圖和實施例，對本實用新型的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本實用新型實施例1的反應板的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖2為本實用新型實施例2的反應板的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖3為本實用新型實施例3的反應板的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]附圖標記說明:
[0019]I 一微孔。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]如圖1所示，本實施例的維生素D抗原包被的反應板，包括微孔板，所述微孔板的微孔I內(nèi)包被有維生素D抗原層，所述微孔I中維生素D抗原的包被量為0.1 μ g?10 μ g(優(yōu)選 0.1 μ g、0.25 μ g、0.5 μ g、1.0 μ g、2.5 μ g、5.0 μ g 或 10 μ g)，所述微孔板為 96 孔微孔板。
[0022]本實施例中，所述維生素D抗原為維生素D3、維生素D2或25羥基維生素D3。
[0023]實施例2
[0024]如圖2所示，本實施例的維生素D抗原包被的反應板，包括微孔板，所述微孔板的微孔I內(nèi)包被有維生素D抗原層，所述微孔I中維生素D抗原的包被量為0.1 μ g?10 μ g(優(yōu)選 0.1 μ g、0.25 μ g、0.5 μ g、1.0 μ g、2.5 μ g、5.0 μ g 或 10 μ g)，所述微孔板為 48 孔微孔板。
[0025]本實施例中，所述維生素D抗原為維生素D3、維生素D2或25羥基維生素D3。
[0026]實施例3
[0027]如圖3所示，本實施例的維生素D抗原包被的反應板，包括微孔板，所述微孔板的微孔I內(nèi)包被有維生素D抗原層，所述微孔I中維生素D抗原的包被量為0.1 μ g?10 μ g(優(yōu)選 0.1 μ g、0.25 μ g、0.5 μ g、1.0 μ g、2.5 μ g、5.0 μ g 或 10 μ g)，所述微孔板為 384 孔微孔板。
[0028]本實施例中，所述維生素D抗原為維生素D3、維生素D2或25羥基維生素D3。
[0029]一、本實用新型的反應板的制備方法:
[0030]步驟一、將維生素D晶體溶解于有機溶劑中，得到濃度為1.0 μ g/mL?100 μ g/mL的維生素D溶液；所述有機溶劑可以是乙醇、正己烷或乙腈；所述維生素D晶體為維生素D3，維生素D2或25羥基維生素D3 ；
[0031]步驟二、向微孔板的每個微孔中均加入100 μ L步驟一中所述維生素D溶液，避光，在4°C孵育16?18小時后清空微孔內(nèi)的維生素D溶液，然后常溫下避光干燥IOmin ；
[0032]步驟三、向步驟二中干燥后的每個微孔內(nèi)加入350 μ L濃度為lwt%?10wt%的封閉液，避光，常溫孵育2小時后清空微孔內(nèi)的封閉液，然后采用PBS緩沖溶液清洗微孔板4次；所述封閉液為非蛋白類，如甘氨酸、聚乙二醇等；
[0033]步驟四、向步驟三中清洗后的微孔板的每個微孔內(nèi)加入350 μ L濃度為lwt%?10wt%的蔗糖溶液，避光，常溫孵育2小時后清空微孔內(nèi)的蔗糖溶液，然后在37°C干燥15分鐘，得到維生素D抗原包被的反應板，避光，防潮，4°C保存。
[0034]二、本實用新型的反應板的使用方法:
[0035]通過抗原-抗體特異性結(jié)合反應，本反應板主要用于檢測抗體濃度、和效價反應。實驗的詳細步驟見抗體滴度試驗。
[0036]三、抗體滴度試驗:
[0037]以96孔反應板為例，對本實用新型的反應板進行抗體滴度試驗，方法為:
[0038]步驟一、向包被抗原的反應板的微孔中加入維生素D單克隆抗體溶液或單抗分泌細胞培養(yǎng)上清液，37°C培養(yǎng)60分鐘，棄去孔內(nèi)溶液，PBS清洗3次；
[0039]步驟二、向步驟一中清洗后的反應板的微孔中加入100 μ LI: 5000 (體積比)稀釋的二抗-HRP溶液，37°C培養(yǎng)60分鐘，棄去孔內(nèi)溶液，PBS清洗4次；
[0040]步驟三、向步驟二中清洗后的反應板的微孔加入100 μ L反應底物ΤΜΒ，常溫培養(yǎng)20分鐘，然后向微孔中加入0.1N鹽酸溶液100 μ L終止反應，在450nm讀取OD值，結(jié)果見表
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[0041]表1不同反應板的檢測結(jié)果(每組試驗重復一次)
【權(quán)利要求】
1.一種維生素D抗原包被的反應板，包括微孔板，其特征在于，所述微孔板的微孔(I)內(nèi)包被有維生素D抗原層，所述微孔(I)中維生素D抗原的包被量為0.1yg?10 μ g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素D抗原包被的反應板，其特征在于，所述微孔板為48孔微孔板、96孔微孔板或384孔微孔板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種維生素D抗原包被的反應板，其特征在于，所述維生素D抗原為維生素D3、維生素D2或25輕基維生素D3。
【文檔編號】G01N33/82GK203732548SQ201320655913
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】韓雅君 申請人:韓雅君