專利名稱：一種制備重組炭疽保護性抗原的方法及其專用表達質(zhì)粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組蛋白的制備方法及其專用表達質(zhì)粒，特別是涉及制備重組炭疽保護性抗原的方法及其專用表達質(zhì)粒。
背景技術：
炭疽毒素包括三種蛋白因子，即保護性抗原(PA)、致死因子(LF)和水腫因子(EF)，其中PA能誘導機體的保護性免疫，是目前獲美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的炭疽疫苗(anthrax vaccine adsorbed，AVA)的主要免疫活性成分。目前AVA的生產(chǎn)仍沿用傳統(tǒng)工藝，用Al(OH)3從炭疽減毒株的培養(yǎng)物中吸附PA，因此含有微量的其他成分，如LF、EF等，AVA在使用中出現(xiàn)的局部疼痛、水腫等副作用可能與此有關。此外，AVA免疫程序也較繁瑣，需18個月內(nèi)免疫6針，其后每年需加強免疫一次。疫苗生產(chǎn)時需要較高的生物安全設施，也加大了其生產(chǎn)成本。因此，目前各國都在發(fā)展基于重組PA的基因工程疫苗。
PA基因全長2295bp，編碼29個氨基酸的信號肽和735個氨基酸的成熟蛋白(DuesberyNS，Vande Woude GF.Anthrax toxins.Cell Mol Life Sci，1999，55(12)1599-1609.)用基因工程方法表達PA國外已有一些報道，但存在產(chǎn)量低，在表達過程中易降解，或難以純化等問題。研究顯示，用枯草桿菌或桿狀病毒表達重組PA(rPA)產(chǎn)量較低，實用價值不大。用乳酸菌或沙門氏菌表達PA來發(fā)展口服疫苗雖有創(chuàng)新，但短期內(nèi)難以投入實際應用。用pQE30載體系統(tǒng)在大腸桿菌中表達rPA，雖然產(chǎn)量較高，但重組蛋白形成包涵體，在純化過程中需要變性、復性步驟，可能影響蛋白形成天然構象；此外該系統(tǒng)在重組蛋白上融合了6×His標簽，給今后的應用帶來困難，因為作為人用疫苗的成分最好不含外源標簽序列。也有作者在大腸桿菌中分泌表達rPA，但表達量較低，1L培養(yǎng)物只能獲得約3mg rPA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用大腸桿菌高效表達重組炭疽保護性抗原的方法及其專用的質(zhì)粒。
本發(fā)明所提供的重組炭疽保護性抗原的表達質(zhì)粒，其DNA序列為序列表中的序列1或在高嚴謹條件下可以與序列1雜交的序列。質(zhì)粒命名為pAS-PA。
所述高嚴謹條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
制備重組炭疽保護性抗原的方法，是用重組炭疽保護性抗原的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得工程菌株，發(fā)酵得到目的產(chǎn)物；所述表達質(zhì)粒的DNA序列為序列表中的序列1或在高嚴謹條件下可以與序列1雜交的序列。
所述發(fā)酵得到的目的產(chǎn)物經(jīng)過下述步驟得到純化1)細菌外周質(zhì)分離；2)離子交換；3)疏水層析；4)凝膠過濾。
所述發(fā)酵工程菌株的過程是從固體培養(yǎng)基上挑取工程菌單菌落，接入含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至0D600 0.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃250轉(zhuǎn)/分誘導表達5h，離心收集細菌沉淀。
用本發(fā)明的表達質(zhì)粒和制備方法可在大腸桿菌中實現(xiàn)rPA的高效分泌型表達，其優(yōu)點是一方面使rPA以可溶形式表達保持其正確構象；另一方面防止rPA被胞內(nèi)蛋白酶降解。經(jīng)過純化每升培養(yǎng)物可獲得rPA約15mg，純度高于95％，其N端序列與天然炭疽保護性抗原完全一致，并且具有較好的生物學活性和免疫原性，具有廣泛的應用價值和深遠的理論意義。


圖1為質(zhì)粒pAS-PA的結構示意圖。
圖2為本發(fā)明表達與純化不同階段的SDS-PAGE電泳圖。
圖3為Western Blot圖。
圖4為顯示生物學活性的曲線圖。
具體實施例方式
實施例1、表達質(zhì)粒pAS-PA的構建1、表達載體pAS20的構建以通用表達載體pASK84(Skerra A.A general vector，pASK84，for cloning，bacterial production，and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 1994，14179-84.)為模板，將其與通用克隆載體pUC18分別用EcoR I/HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別回收pASK84的載體片段和pUC18的多克隆位點片段，將二者連接后通過TSS法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue，提質(zhì)粒用EcoR I/HindIII酶切鑒定，對多克隆位點插入正確的質(zhì)粒進行序列測定，序列正確的質(zhì)粒命名為pAS18。將pAS18用BamH I/HindIII雙酶切，電泳回收載體片段，用Klenow酶補平后連接，通過TSS法轉(zhuǎn)化XL1-blue菌，提質(zhì)粒進行序列測定，序列正確的質(zhì)粒命名為pAS20。其中，測序引物為P185’-GCTTCCGGCTCGTATAATGTG-3’。
2、PA基因的克隆用常規(guī)分子生物學方法將炭疽保護性抗原PA基因插入表達載體pAS20。PA基因從炭疽桿菌A16R株(購自蘭州生物制品所)中以PCR方法獲得。PCR引物PA 5’端引物5’-AGGAGAACCGGTTATTAAATGAATC-3’PA 3’端引物5’-CGCGAGCTCTTATCCTATCTCATAGCCTTTTTTAG-3’SacI從培養(yǎng)A16R菌株的瓊脂平板上挑取少量細菌，置100μL純水中，煮沸10分鐘，離心后取5μL上清進行PCR反應。反應總體積50μL，含1×Ex Taq buffer，0.2mmol/LdNTPs，引物各0.5μmol/L，2.5U Ex Taq。94℃預變性3min，94℃30s，55℃30s，72℃120s，30循環(huán)，72℃延伸5min。
3、表達質(zhì)粒pAS-PA的構建PCR產(chǎn)物用SacI酶切，形成5’平末端3’粘末端；載體pAS20用PstI切后，用T4DNA聚合酶處理成平末端，再用SacI酶切，也形成5’平末端3’粘末端。載體和片段連接后常規(guī)轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，PCR(引物與條件同步驟2)篩選陽性克隆，提質(zhì)粒進行酶切鑒定和序列測定，測序引物同步驟1。序列正確的質(zhì)粒命名為pAS-PA(如圖1所示)。
實施例2、重組炭疽保護性抗原(rPA)的表達及純化1、表達從固體LB培養(yǎng)基上挑取被質(zhì)粒pAS-PA轉(zhuǎn)化的E.coli DH5α工程菌單菌落，接入含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至0D600＝0.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃250轉(zhuǎn)/分誘導表達5h，離心收集細菌沉淀。
2、細菌外周質(zhì)的分離1L誘導培養(yǎng)物離心后的菌體，用100mL 20％蔗糖溶液(20mmol/L TrispH8.0，1mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF)重懸，冰上放置5min，4℃8000g離心20min。沉淀用100mL 5mmol/L MgSO4(1mmol/L PMSF)重懸，冰上放置10min，4℃10000g離心10min，收集上清液用于純化rPA。
3、離子交換將步驟2中收集的上清液先用Q Sepharose進行粗純化。以平衡緩沖液(20mmol/LTris pH8.0)平衡柱，調(diào)節(jié)樣品鹽濃度至20mmol/L Tris pH8.0后上樣。用含0.5mol/LNaCl的平衡緩沖液進行洗脫。分部收集洗脫液，進行12％SDS-PAGE分析。
含rPA的管合并后用Source 30Q進行下一步純化。以平衡緩沖液(同上)平衡柱，樣品稀釋5倍后上樣。用含0～0.25mol/L NaCl的平衡緩沖液梯度洗脫。
4、疏水層析將步驟3的Source 30Q洗脫液合并后用phenyl sepharose疏水柱進一步純化。以含1.0mol/L硫酸胺的緩沖液(20mmol/L Tris pH8.0)平衡柱，調(diào)節(jié)樣品液至同樣鹽濃度后上樣，用含1.0～0mol/L硫酸胺的同樣緩沖液梯度洗脫。
5、凝膠過濾將步驟4的洗脫液合并后用Centriplus YM-30超濾管(Millipore)濃縮，再過Superdex 200凝膠柱，用PBS洗下rPA，-70℃保存。1L培養(yǎng)物經(jīng)純化后可獲得約15mgrPA，用HPLC方法分析rPA的純度為97％。
6、凝膠電泳與免疫印跡分析將各步純化樣品進行12％SDS-PAGE，觀察純化效果，結果如圖2所示，圖中1，工程菌誘導前；2，工程菌誘導后；3，含rPA的細菌外周質(zhì)；4，Q Sepharose純化后；5，Source 30Q純化后；6，phenyl Sepharose純化后；7，Superdex 200純化后；M，蛋白分子量標準。從圖中可以明顯看出，隨著本發(fā)明工藝步驟的進程，目的蛋白rPA得到表達后，逐步得到了純化。將經(jīng)10％SDS-PAGE后的rPA電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，進行蛋白N端測序，結果前5個氨基酸為EVKQE，與天然PA一致，表明信號序列已被正確切去，得到的產(chǎn)物是正確的。
用抗-PA單克隆抗體(以rPA為抗原，制備方法見《免疫學常用實驗方法》，北京人民軍醫(yī)出版社，200023-50)為一抗，HRP標記羊抗鼠IgG(Sigma)12000稀釋為二抗，按照常規(guī)方法進行Western blot分析，結果如圖3所示，圖中1，工程菌誘導前；2，工程菌誘導后；3，含rPA的細菌外周質(zhì)；4，Q Sepharose純化后；5，Source 30Q純化后；6，phenyl Sepharose純化后；7，Superdex 200純化后，圖中的結果可以證明PA基因確實得到了表達，同時表達產(chǎn)物得到了純化。
實施例3、本發(fā)明方法制備的rPA的生物活性和免疫原性分析1、rPA的生物活性分析炭疽保護性抗原(PA)與致死因子(LF)結合稱為致死毒素(lethal toxin，LT)，在體外可導致敏感細胞(如小鼠巨噬細胞J774A.1)的死亡。
將小鼠巨噬細胞J774A.1以105/ml接種于96孔培養(yǎng)板，長至90％滿，不同濃度的rPA與重組LF(rLF，制備方法見Gupta P，et al.Expression and purificationof the recombinant lethal factor of Bacillus anthracis.Infection and Immunity1998，66(2)862-865.)加入細胞孔中，37℃孵育3h，用MTT法觀察細胞存活率。結果如圖4所示，當固定rPA與rLF其中的一種，增加另一種蛋白的濃度時，細胞存活率明顯下降；而只加入rPA或rLF的細胞孔無明顯變化，表明rPA有較好的生物學活性。
2、rPA的免疫原性分析用rPA免疫健康的家兔(2kg)，采用背部皮下分點注射，免疫時間為第0、3、6周，第4、8周采血。免疫劑量為0.5mg/只/次，首次免疫使用完全弗氏佐劑，后二次使用不完全弗氏佐劑。用ELISA測定抗血清中抗rPA抗體的滴度。結果顯示免疫4周后(兩次)血清中抗rPA抗體滴度達1×106，免疫8周后(三次)抗體滴度達2×106，表明rPA具有良好的免疫原性。
序列表<160>1<210>1<211>5988<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>序列號acccgacacc atcgaatggc gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 60gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc 120cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa 180aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc 240acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct 300gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag 360cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa 420tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc 480cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca 540gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca 600tctggtcgca ttgggtcatc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc 660ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat 720agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct 780gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc 840aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata 900cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt 960tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt 1020gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa 1080tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 1140ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 1200aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg 1260gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cggattcact ggaactctag 1320ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac tggctggttt 1380cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaaga agttaaacag gagaaccggt tattaaatga 1440atcagaatca agttcccagg ggttactagg atactatttt agtgatttga attttcaagc 1500acccatggtg gttacctctt ctactacagg ggatttatct attcctagtt ctgagttaga 1560aaatattcca tcggaaaacc aatattttca atctgctatt tggtcaggat ttatcaaagt 1620taagaagagt gatgaatata catttgctac ttccgctgat aatcatgtaa caatgtgggt 1680
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權利要求
1.重組炭疽保護性抗原的表達質(zhì)粒，其DNA序列為序列表中的序列1或在高嚴謹條件下可以與序列1雜交的序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒是pAS-PA。
3.一種制備重組炭疽保護性抗原的方法，是用重組炭疽保護性抗原的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得工程菌株，發(fā)酵工程菌株得到目的產(chǎn)物；所述表達質(zhì)粒的DNA序列為序列表中的序列1或在高嚴謹條件下可以與序列1雜交的序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵得到的目的產(chǎn)物經(jīng)過下述步驟得到純化1)細菌外周質(zhì)分離；2)離子交換；3)疏水層析；4)凝膠過濾。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵工程菌株的過程是從固體培養(yǎng)基上挑取工程菌單菌落，接入含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃ 250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至OD6000.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃ 250轉(zhuǎn)/分誘導表達5h得到目的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備重組炭疽保護性抗原的方法及其專用表達質(zhì)粒，本發(fā)明提供的重組炭疽保護性抗原的表達質(zhì)粒，其DNA序列為序列表中的序列1或在高嚴謹條件下可以與序列1雜交的序列。本發(fā)明所提供的制備重組炭疽保護性抗原的方法，是用重組炭疽保護性抗原的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得工程菌株，發(fā)酵工程菌株得到目的產(chǎn)物。用本發(fā)明的表達質(zhì)粒和制備方法可在大腸桿菌中實現(xiàn)rPA的高效分泌型表達，其優(yōu)點是一方面使rPA以可溶形式表達保持其正確構象；另一方面防止rPA被胞內(nèi)蛋白酶降解。經(jīng)過純化每升培養(yǎng)物可獲得rPA約15mg，純度高于95％，其N端序列與天然炭疽保護性抗原完全一致，并且具有較好的生物學活性和免疫原性，具有廣泛的應用價值和深遠的理論意義。
文檔編號C12N15/70GK1746313SQ200410074358
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月10日 優(yōu)先權日2004年9月10日
發(fā)明者陳薇, 徐俊杰, 董大勇, 付玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所