專利名稱：天花粉蛋白突變體及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域中一種天花粉蛋白突變體及其編碼基因。
背景技術：
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是中藥天花粉的有效成分，提取自多年生宿根草質藤本植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)的塊根，具有引產(chǎn)、調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒等多種生物學活性。臨床上很早就發(fā)現(xiàn)TCS用于治療滋養(yǎng)層細胞的異常增殖，如葡萄胎、惡性葡萄胎和絨毛膜上皮癌等，都具有顯著療效。特別是1989年發(fā)現(xiàn)TCS具有抗HIV活性，引起了人們廣泛的關注。
天花粉蛋白(GeneBank Accession number AY669811)由247個氨基酸殘基組成，分子量27kD，等電點9.4，是一個簡單蛋白，沒有糖基或其它基團修飾。天花粉蛋白屬于I型核糖體滅活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)，能夠專一水解真核細胞核糖體28S rRNA 4324位的腺苷酸與核糖環(huán)間的N-C糖苷鍵，阻止蛋自質翻譯。在體外條件下能夠切割超螺旋DNA、通過caspase途徑誘導癌細胞凋亡等。其中，核糖體滅活活性和誘導癌細胞凋亡的活性是天花粉蛋白抑制腫瘤細胞的主要原因。
天花粉蛋白需要進入細胞才能發(fā)揮對細胞的殺傷作用，但是I型核糖體滅活蛋白進入細胞的途徑尚不十分清楚。近來有文獻指出，低密度脂蛋白受體家族在介導TCS入胞中起重要作用，但TCS分子中與受體蛋白的相互作用區(qū)域的研究仍為空白。
由于天花粉蛋白具有重要的藥用價值，因此臨床應用前景廣闊。但由于天花粉蛋白是一種植物源蛋白，對人體的免疫反應和毒副作用較強，在臨床應用時會產(chǎn)生不良反應，包括發(fā)熱、風疹、水腫、肌肉疼痛等，嚴重的還會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這種反應限制了天花粉蛋白在臨床上的應用。
天花粉蛋白的這種毒副作用，主要來自兩方面一是天花粉蛋白引起的全身免疫反應，主要與TCS分子表面的抗原決定簇有關；二是天花粉蛋白進入組織細胞發(fā)揮細胞毒性作用而導致的對機體組織器官的損傷作用。為了降低TCS在臨床應用中的毒副反應，可從以下兩個有效途徑對其進行分子改造一是去除TCS分子表面的抗原決定簇；二是限定TCS分子專一性入胞的途徑，即從阻止TCS分子自行進入細胞入手，對TCS分子中與入胞相關的關鍵位點進行改變。由于天花粉蛋白含有多個抗原決定簇，在分子表面分布較廣，因此依靠去除全部的抗原決定簇來消除毒副反應的難度較大；而從TCS分子進入細胞的相關位點或區(qū)域入手，通過消除TCS分子的自行入胞功能，使之聽從于靶細胞特異性的導向分子而專一性地進入腫瘤細胞，不僅可以減小TCS對正常細胞或機體其他組織器官的細胞毒性，而且能夠影響抗原呈遞細胞對TCS分子的攝取，從而降低了TCS引發(fā)的免疫反應，具有雙重功效。
目前國內(nèi)外對TCS的研究大多集中在功能活性相關的結構特點及其改造，而對TCS的免疫原性及毒副作用相關的研究較少，特別是對TCS分子的細胞識別與入胞作用等功能相關的研究仍處于空白。
2002年，Wang JH等將天花粉蛋白Lys120-Ile121-Arg122-Glu123突變成為Ser120-Ala121-Gly122-Gly123，以及得到一個雙突變體TCSE160A/E189A，上述兩個突變體的核糖體滅活(RI)活性大大降低，并且喪失了抗HIV的活性。將122位的Arg突變?yōu)镚ly，保留了抗HIV的活性，但RI活性降低了160倍。2003年，Zhang F等將TCS的C末端7個氨基酸殘基刪除，使TCS的體內(nèi)細胞毒性和體外RI活性同時降低，但RI活性降低的程度更大。
目前，在惡性腫瘤等疾病的臨床治療中，導向藥物顯示出廣泛的應用潛力。導向藥物治療是以針對不同腫瘤細胞或病毒感染細胞的特異性單抗或單抗片段(如ScFv)等作為導向劑，將具有殺傷腫瘤細胞或抗病毒作用的免疫毒素等蛋白作為效應劑(彈頭)，用化學偶聯(lián)或基因融合的方法將導向劑與效應劑組成導向藥物，特異性地殺傷或抑制導向劑所識別的腫瘤細胞或感染細胞中的病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種天花粉蛋白突變體及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的天花粉蛋白突變體，是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸和自N端的第78位天冬氨酸的兩個氨基酸殘基中至少一個突變，且所述自氨基端的第55位的酪氨酸突變?yōu)橹咀灏被?，所述自氨基端的?8位的天冬氨酸突變?yōu)橛H水性較低的氨基酸的蛋白質。
其中，酪氨酸為芳香族氨基酸，天冬氨酸為強親水性氨基酸。
所述脂肪族氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等，優(yōu)選為甘氨酸。所述親水性較低的氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、半胱氨酸等，優(yōu)選為絲氨酸。
上述天花粉蛋白突變體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突變?yōu)楦拾彼岬牡鞍踪|(名稱為TCSY55G)時，其編碼基因(名稱為tcsY55G)具有序列表中序列1的核苷酸序列；自N端的第55位甘氨酸的密碼子除序列1中的自5′端第163位-165位的GGC外，還可為其它簡并密碼子，如GGA、GGT、GGG。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突變?yōu)楸彼岬牡鞍踪|(名稱為TCSY55A)時，其編碼基因(名稱為tcsY55A)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位為GCA、GCT、GCC或GCG(代表丙氨酸)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突變?yōu)槔i氨酸的蛋白質(名稱為TCSY55V)時，其編碼基因(名稱為tcsY55V)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位為GTA、GTT、GTC或GTG(代表纈氨酸)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突變?yōu)榱涟彼岬牡鞍踪|(名稱為TCSY55L)時，其編碼基因(名稱為tcsY55L)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位為CTA、CTT、CTC、CTG、TTA或TTG(代表亮氨酸)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬牡鞍踪|(名稱為TCSY55I)時，其編碼基因(名稱為tcsY55I)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位為ATT、ATC或ATA(代表異亮氨酸)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸的蛋白質(名稱為TCSD78S)時，其編碼基因(名稱為tcsD78S)具有序列表中序列2的核苷酸序列；自N端的第78位絲氨酸的密碼子除序列2中的自5′端第232位-234位的TCC外，還可為其它簡并密碼子，如TCA、TCT、TCG、AGT、AGC。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)樘K氨酸的蛋白質(名稱為TCSD78T)時，其編碼基因(名稱為tcsD78T)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位為ACA、ACT、ACC或ACG(代表蘇氨酸)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)樘於０返牡鞍踪|(名稱為TCSD78N)時，其編碼基因(名稱為tcsD78N)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位為AAT或AAC(代表天冬酰胺)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)楣劝滨０返牡鞍踪|(名稱為TCSD78Q)時，其編碼基因(名稱為tcsD78Q)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位為CAA或CAG(代表谷氨酰胺)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)楸彼岬牡鞍踪|(名稱為TCSD78A)時，其編碼基因(名稱為tcsD78A)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位為GCA、GCT、GCC或GCG(代表丙氨酸)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬牡鞍踪|(名稱為TCSD78C)時，其編碼基因(名稱為tcsD78C)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位為TGT或TGC(代表半胱氨酸)的核苷酸序列。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位的酪氨酸突變?yōu)楦拾彼?，和自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸的蛋白質(名稱為TCSY55G/D78S)時，其編碼基因(名稱為tcsY55G/D78S)具有序列表中序列3的核苷酸序列。自N端的第55位甘氨酸的密碼子除序列3中的自5′端第163位-165位的GGC外，還可為其它簡并密碼子，如GGA、GGT、GGG；而且，自N端的第78位絲氨酸的密碼子除序列3中的自5′端第232位-234位的TCC外，還可為其它簡并密碼子，如TCA、TCT、TCG、AGT、AGC。
當所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，并且自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)樘K氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸或半胱氨酸的蛋白質時，其編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列3中的自5′端第163位-165位選自如下密碼子之一GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；GTA、GTT、GTC、GTG(代表纈氨酸)；CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG(代表亮氨酸)；ATT、ATC、ATA(代表異亮氨酸)；2)序列3中的自5′端第232位-234位選自如下密碼子之一ACA、ACT、ACC、ACG(代表蘇氨酸)；AAT、AAC(代表天冬酰胺)；CAA、CAG(代表谷氨酰胺)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；TGT、TGC(代表半胱氨酸)；3)序列3中的自5′端第163位-165位選自如下密碼子之一GGA、GGT、GGG或GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；GTA、GTT、GTC、GTG(代表纈氨酸)；CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG(代表亮氨酸)；ATT、ATC、ATA(代表異亮氨酸)；且序列3中的自5′端第232位-234位為TCA、TCT、TCG、AGT、AGC或ACA、ACT、ACC、ACG(代表蘇氨酸)；AAT、AAC(代表天冬酰胺)；CAA、CAG(代表谷氨酰胺)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；TGT、TGC(代表半胱氨酸)。
本發(fā)明利用TCS的靶細胞--人絨毛膜上皮癌細胞(JAR)，確定了55和78位氨基酸為TCS識別與入胞相關的氨基酸位點，利用基因工程定點突變法對該位點進行改造，得到了喪失入胞功能、毒副作用下降，而抗腫瘤等其他藥物學活性保留的突變體天花粉蛋白，其中TCSY55G，TCSD78S和TCSY55G/D78S為優(yōu)選。
實驗證明TCSY55G，TCSD78S和TCSY55G/D78S等幾種天花粉蛋白突變體在非細胞體系中仍保留有TCS的核糖體失活活性、蛋白質翻譯抑制活性等，保留了誘導細胞內(nèi)caspase-3活性升高從而導致細胞凋亡等生物學功能，而消除了TCS自身的細胞識別與入胞功能，特別是TCS引起的免疫原性及毒副作用顯著下降，具有優(yōu)良的免疫毒素蛋白的性狀。該位點的改變不影響TCS的藥物學功能，只消除了TCS自行進入細胞的能力，從而不能直接殺傷腫瘤細胞，同時也消除了對正常組織細胞的非選擇性殺傷作用，極大的降低了TCS的免疫原性和細胞毒性，具備了導向藥物彈頭的優(yōu)良特性。
本發(fā)明的TCS突變體蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S等具有制備方法簡單、產(chǎn)量高、純化簡便，表達產(chǎn)物為可溶性蛋白等特點。突變體均保留原有核糖體失活活性、細胞凋亡活性等，保留了抗病毒和抗腫瘤的功能，而極大地降低了TCS自行入胞引起的全身性毒副作用。本發(fā)明所產(chǎn)生的天花粉蛋白突變體已喪失自行入胞的功能，對正常細胞的毒性減弱，引起免疫反應的能力降低等，是極好的效應物，即“彈頭”，對患者全身性毒副作用小，用藥更加安全有效，可以長期反復使用。本發(fā)明的TCS突變體將在治療惡性腫瘤、AIDS等疾病的臨床應用中發(fā)揮重要作用。


圖1為天花粉蛋白突變體tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S的核糖體滅活活性曲線圖2為天花粉蛋白突變體tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S抑制JAR細胞活性的柱狀3為天花粉蛋白突變體tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S誘導JAR細胞凋亡活性的柱狀4a為PBS處理的小鼠肝臟照片圖4b為nTCS處理的小鼠肝臟照片圖4c為TCSY55G處理的小鼠肝臟照片圖4d為TCSD78S處理的小鼠肝臟照片圖4e為TCSY55G/D78S處理的小鼠肝臟照片圖5為天花粉蛋白突變體進入JAR細胞內(nèi)部能力的熒光分析照片具體實施方式
實施例1、天花粉蛋白突變體的表達與純化根據(jù)天花粉蛋白成熟肽基因、氨基酸序列及其肽鏈走向、以及三維結構的模擬分析，利用軟件分析預測了可突變位點55位和78位。利用TCS的靶細胞——人絨毛膜上皮癌細胞(JAR)，確定了55和78位氨基酸為TCS識別與入胞相關的氨基酸位點。
利用定點突變技術將TCS成熟肽基因55位的酪氨酸突變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，將78位天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、半胱氨酸，以及將兩個位點同時突變，得到tcsY55G、tcsD78S、tcsY55G/D78S等突變體基因。其中，定點突變的PCR模板為野生型tcs(序列表中的序列4)；各PCR反應體系中所采用的反應體系和循環(huán)程序如下反應體系去離子水 39μldNTP 2μl
正向引物1μl反向引物1μl模板1μl10×Taq酶反應緩沖液 5μlTaq酶 1μl總體積 50μl循環(huán)程序預變性 94℃60秒變性94℃50秒退火58℃70秒延伸72℃60秒循環(huán)次數(shù)35次終末延伸72℃600秒再利用常規(guī)分子克隆方法，將上述突變體基因分別克隆到高效原核表達載體pT7-7(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)的NdeI和HindIII酶切位點之間，通過CaCl2法轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株。取單菌落在LB培養(yǎng)基內(nèi)37℃培養(yǎng)12小時后，1∶100轉接至新鮮培養(yǎng)基放大培養(yǎng)，當菌液在600nm下0D值為0.6-0.8時，加IPTG至終濃度0.5mM誘導蛋白表達，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時，收集菌體，經(jīng)超聲波破碎后離心取上清液，經(jīng)CM-Sepharose Fast Flow柱層析分離純化，分別收集主峰得到天花粉蛋白突變體。天花粉蛋白突變體分別表達純化后，經(jīng)SDS-PAGE以及westernblot檢測正確，蛋白純度可達99％。蛋白產(chǎn)率高，每升培養(yǎng)物可達13-14mg。
其中，為將突變體基因的5’端插入pT7-7載體的NdeI位點，在PCR的引物設計時引入NdeI酶切位點序列CATATG；為將突變體基因的3’端插入pT7-7載體的HindIII位點，在PCR的引物設計時引HindIII酶切位點序列AAGCTT，同時引入終止密碼子TAA。引物設計具體如下引物15’-GGCATCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA-3’；引物25’-GGGAAGCTTATGCCATATTGTTTCGATT-3’；引物35’-CATCGGCGCCATTTGTGAG-3’(斜體堿基代表甘氨酸)；(其他的第55位突變的一端引物分別為將上述引物3的斜體堿基替換成為CCT、CCA、CCC(代表甘氨酸的簡并堿基)；CGT、CGA、CGG、CGC(代表丙氨酸)；CAT、CAA、CAG、CAC(代表纈氨酸)；GAT、GAA、GAG、GAC、AAT、AAC(代表亮氨酸)；TAA、TAG、TAT(代表異亮氨酸))引物45’-CTCACAAATGGCGCCGATG-3’(斜體堿基代表甘氨酸)；(其他的第55位突變的另一端引物分別為將上述引物4的斜體部分替換成為GGA、GGT、GGG(代表甘氨酸的簡并堿基)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；GTA、GTT、GTC、GTG(代表纈氨酸)；CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG(代表亮氨酸)；ATT、ATC、ATA(代表異亮氨酸))引物55’-AGGATGTGGAGCCAGCGCG-3’(斜體堿基代表絲氨酸)；(其他的第78位突變的一端引物分別為將上述引物5的斜體部分替換成為AGT、AGA、AGC、TCA、TCG(代表絲氨酸的簡并堿基)；TGT、TGA、TGG、TGC(代表蘇氨酸)；TTA、TTG(代表天冬酰胺)；GTT、GTC(代表谷氨酰胺)；CGT、CGA、CGG、CGC(代表丙氨酸)；ACA、ACG(代表半胱氨酸))引物65’-CGCGCTGGC TCCACATCCT-3’(斜體堿基代表絲氨酸)；(其他的第78位突變的另一端引物分別為將上述引物6的斜體部分替換成為TCA、TCT、TCG、AGT、AGC(代表絲氨酸的簡并堿基)；ACA、ACT、ACC、ACG(代表蘇氨酸)；AAT、AAC(代表天冬酰胺)；CAA、CAG(代表谷氨酰胺)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；TGT、TGC(代表半胱氨酸))下面以制備tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S為例制備tcsY55G第一階段PCR模板序列為序列表中的序列4，引物為引物1和引物3，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs55-a片斷；第二階段PCR模板序列為序列表中的序列4，引物為引物2和引物4，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs55-b片斷；第三階段PCR模板為tcs55-a片斷和tcs55-b片斷的1∶1混合溶液，引物為引物1和引物2，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcsY55G。
制備tcsD78S第一階段PCR模板序列為序列表中的序列4，引物為引物1和引物5，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs78-a片斷；第二階段PCR模板序列為序列表中的序列4，引物為引物2和引物6，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs78-b片斷；第三階段PCR模板為tcs78-a片斷和tcs78-b片斷的1∶1混合溶液，引物為引物1和引物2，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcsY55G。
制備tcsY55G/D78S第一階段PCR模板序列為序列表中的序列1，引物為引物1和引物5，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs55/78-a片斷；第二階段PCR模板序列為序列表中的序列1，引物為引物2和引物6，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs55/78-b片斷；第三階段PCR模板為tcs55/78-a片斷和tcs55/78-b片斷的1∶1混合溶液，引物為引物1和引物2，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcsY55G/D78S。(或者采取另一方法第一階段PCR模板序列為序列表中的序列2，引物為引物1和引物3，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs78/55-a片斷；第二階段PCR模板序列為序列表中的序列2，引物為引物2和引物4，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcs78/55-b片斷；第三階段PCR模板為tcs78/55-a片斷和tcs78/55-b片斷的1∶1混合溶液，引物為引物1和引物2，按上述PCR體系和循環(huán)程序得到產(chǎn)物tcsY55G/D78S)。
其它天花粉蛋白突變體編碼基因的制備方法除引物3、4、5和6為其相對應的引物序列外，其它同tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S的制備方法。
實施例2、天花粉蛋白突變體的生物學活性a)TCS突變體的蛋白質合成抑制活性的測定利用promega公司生產(chǎn)的兔網(wǎng)織紅細胞體外翻譯系統(tǒng)試劑盒，檢測突變體作為核糖體滅活蛋白抑制蛋白質合成的能力，方法按說明書進行，[35S]甲硫氨酸為PerkinElmer Life Sciences公司產(chǎn)品。天花粉蛋白突變體的IC50值如表1所示，表明除TCSD78C的IC50值為20nM＜IC50≤50nM，TCSD78A和TCSD78T的IC50值均為10nM＜IC50≤20nM外，其它突變體與天然提取的TCS(nTCS)正對照(1.31×10-9M)的IC50均在1nM＜IC50≤10nM之間。
b)TCS突變體抑制JAR細胞的活性測定在96孔細胞培養(yǎng)板中，以1×104個細胞/孔的接種量接入體外培養(yǎng)的人絨毛膜上皮癌細胞(JAR)，分別加入25μg/ml的天花粉蛋白突變體和作為正對照的nTCS，37℃培養(yǎng)48小時，用MTT法檢測JAR細胞存活率。另將上述天花粉蛋白突變體和nTCS分別用脂質體轉染試劑lipofectAMINE轉入JAR細胞內(nèi)部(方法參考Invitrogen公司lipofectAMINE轉染試劑的說明書)，48小時后用MTT法檢測JAR細胞存活率。測定結果如表1所示，表明直接外加突變體蛋白，細胞相對存活率≥90％，不能抑制JAR細胞生長；分別經(jīng)轉染試劑轉入細胞內(nèi)部以后，除TCSY55G、TCSY55A、TCSY55L、TCSD78S和TCSD78N的細胞存活率為40％＜細胞相對存活率≤50％外，其它突變體的細胞存活率為50％＜細胞相對存活率≤60％，能夠抑制JAR細胞生長。
c)TCS突變體蛋白誘導JAR細胞凋亡活性的測定利用ApoAlertCaspase-3 Colorimetric Assay Kit(Clontech公司)，按說明進行。細胞培養(yǎng)和蛋白濃度設置同b)，轉染方法也同b)，測定時間為給藥后12小時。測定結果如表1所示，表明外加突變體蛋白時不能誘導JAR細胞的caspase-3活性(caspase-3酶活力單位≤1.0)，但轉染后均可以誘導caspase-3活性。
表1.天花粉蛋白突變體的生物學活性

注*體外抑制蛋白翻譯能力+++1nM＜IC50≤10nM；++10nM＜IC50≤20nM；+20nM＜IC50≤50nM。
抑制JAR細胞增值能力+++細胞相對存活率≤40％；++40％＜細胞相對存活率≤50％；+50％＜細胞相對存活率≤60％；-細胞相對存活率≥90％。
誘導JAR細胞caspase-3酶活性的能力+++caspase-3酶活力單位≥5.0；++3.5≤caspase-3酶活力單位＜5.0；+2.0≤caspase-3酶活力單位＜3.5；-caspase-3酶活力單位≤1.0。
本實施例表明TCS經(jīng)過上述單個位點或雙位點突變之后，仍保留有核糖體滅活活性，而未表現(xiàn)出對腫瘤細胞的抑制作用，但經(jīng)脂質體轉染至腫瘤細胞內(nèi)部后，可恢復對腫瘤細胞的抑制活性和以caspase-3為特征的誘導凋亡活性。
進一步分析表明為消除酪氨酸的苯環(huán)基團影響而將55位酪氨酸突變?yōu)槠渌?種脂肪族氨基酸，為消除78位天冬氨酸的強親水性而將78位突變?yōu)槭杷詷硕仍谡?.0之間的6種氨基酸(Asp-2.5，Ser-0.3，Thr0.4，Asn-0.2，Gln-0.2，Gly0，Cys1.0，疏水性標度數(shù)據(jù)來自Nozaki-Tanford和Levitt)，其中55位突變成甘氨酸、78位突變成絲氨酸后對蛋白體外翻譯抑制活性和轉染后抑制腫瘤細胞能力影響最小，因此Y55G和D78S以及雙突變體Y55G/D78S為天花粉蛋白優(yōu)選突變體，具有良好的研究與應用前景。
實施例3、天花粉蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S的性質測定天花粉蛋白優(yōu)選突變體的蛋白質合成抑制活性、經(jīng)脂質體轉染前后對JAR細胞的抑制能力、以及轉染前后誘導JAR細胞caspase-3酶活性的能力，方法如上所述。突變體對蛋白質合成抑制活性如圖1所示，TCSY55G、TCS078S和TCSY55G/D78S的IC50值分別為4.67×10-9M、3.88×10-9M和6.62×10-9M，與天然提取的TCS(nTCS)正對照(1.31×10-9M)相比，均具有很強的抑制蛋白質體外翻譯的能力。突變體抑制JAR細胞的活性如圖2所示，表明直接外加nTCS正對照的細胞存活率下降到43.1％，而突變體TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S不能抑制JAR細胞生長，細胞存活率分別為90.0％、94.6％、91.2％；但是，突變體蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S分別經(jīng)轉染試劑轉入細胞內(nèi)部以后，能夠抑制JAR細胞生長，細胞存活率下降到43.5％、41.9％、53.4％。突變體誘導JAR細胞凋亡活性如圖3所示，表明外加突變體蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S(未經(jīng)轉染)時不能誘導JAR細胞的caspase-3活性，但轉染后均可以誘導caspase-3活性，且活性相對于用脂質體單獨處理的對照組顯著升高。同時，用相差顯微鏡觀察，轉染TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S后，JAR細胞出現(xiàn)凋亡小體等典型的細胞凋亡現(xiàn)象，與正對照nTCS一致。
實施例4、天花粉蛋白突變體對動物體毒副作用的降低取15只20g左右的C57BL/6J小鼠，隨機分成3組，分別用天花粉蛋白突變體、nTCS或PBS加鋁釩佐劑進行腹腔注射，每隔2周注射一次，每次10μg蛋白/小鼠。初次給藥后的第35天處死小鼠，取全血，用常規(guī)ELISA法測定血清IgG和IgE水平。同時解剖小鼠，觀察TCS對內(nèi)臟的損傷。結果表明TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S三種突變體組的IgG和IgE水平較正對照nTCS組均下降了近50％；TCSY55A、TCSD78T、TCSD78N、TCSD78C四種突變體組的IgG和IgE水平較正對照nTCS組均下降了近40％；TCSY55V、TCSY55L、TCSY55I、TCSD78Q、TCSD78A五種突變體組的IgG和IgE水平較正對照nTCS組均下降了近30％。在內(nèi)臟形態(tài)上，nTCS組小鼠肝臟萎縮、邊緣鈍化、分葉不明顯，腸粘連嚴重；而在天花粉蛋白突變體組中這種毒性損傷均不明顯，其中TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S三種突變體處理的小鼠內(nèi)臟形態(tài)接近正常的負對照PBS組(圖4a-圖4e)。
實施例5、天花粉蛋白突變體中氨基酸的改變消除了其進入細胞的能力經(jīng)熒光標記物FITC偶聯(lián)的nTCS和天花粉蛋白突變體，按照實施例2中b)所述方法，分別加入培養(yǎng)的JAR細胞中，4-12小時內(nèi)在熒光顯微鏡下觀察分析，發(fā)現(xiàn)TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S等各種突變體蛋白在直接添加處理的情況下，只能在JAR表面的局部出現(xiàn)微弱的綠色熒光，而nTCS對照組可以使JAR細胞全部呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。表明突變體失去了進入JAR細胞內(nèi)部的能力(圖5)。圖5中，1 為未處理的細胞；2為FITC-BSA處理的細胞；3 為FITC-nTCS處理的細胞；4 為FITC-TCSY55G處理的細胞；5 為FITC-TCSD78S處理的細胞；6 為FITC-TCSY55G/D78S處理的細胞。說明所選擇的突變位點Y55和D78對TCS進入靶細胞起決定性的作用，而它們所在的TCS蛋白表面的凹形區(qū)域與TCS經(jīng)由受體介導進入細胞重要相關。
序列表<160>4<210>1<211>741<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gatgttagct tccggttatc aggtgcaaca agcagttcct atggagtttt catttcaaat60ctgagaaaag ctcttccaaa tgaaaggaga ctatacgata tccctctgtt acgttccact120cttcaaggtt ctcaacgcta cgcattgatc catctcacaa atggcgccga tgaaaccatt180tcagtggcca tagacgtaac gaacgtctat attatgggat atcgcgctgg cgatacatcc240tattttttca acgaggcttc tgcaacagaa gctgcaaaat atgtattcaa agacgctatg300cgaaaagtta cgcttccata ttctggcaat tacgaaaggc ttcaaactgc tgcgggcaaa360ataagggaaa atattccgct tggactccca gctttggaca gtgccattac cactttgttt420tactacaacg ccaattctgc tgcgtcggca cttatggtac tcattcagtc gacgtctgag480gctgcgaggt ataaatttat tgagcaacaa attgggaagc gcgctgacaa aaccttccta540ccaagtttag caattataag tttggaaaat agttggtctg ctctctccaa gcaaattcag600atagcgagta ctaataatgg acagtttgaa actcctgttg tgcttataaa tgctcaaaac660caacgagtcg cgataaccaa tgttgatgct ggagttgtaa cctccaacat cgcgttgctg720ctgaatcgaa acaatatggc a 741<210>2<211>741<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2gatgttagct tccggttatc aggtgcaaca agcagttcct atggagtttt catttcaaat60ctgagaaaag ctcttccaaa tgaaaggaga ctatacgata tccctctgtt acgttccact120cttcaaggtt ctcaacgcta cgcattgatc catctcacaa attacgccga tgaaaccatt180tcagtggcca tagacgtaac gaacgtctat attatgggat atcgcgctgg ctccacatcc240tattttttca acgaggcttc tgcaacagaa gctgcaaaat atgtattcaa agacgctatg300cgaaaagtta cgcttccata ttctggcaat tacgaaaggc ttcaaactgc tgcgggcaaa360ataagggaaa atattccgct tggactccca gctttggaca gtgccattac cactttgttt420tactacaacg ccaattctgc tgcgtcggca cttatggtac tcattcagtc gacgtctgag480gctgcgaggt ataaatttat tgagcaacaa attgggaagc gcgctgacaa aaccttccta540ccaagtttag caattataag tttggaaaat agttggtctg ctctctccaa gcaaattcag600atagcgagta ctaataatgg acagtttgaa actcctgttg tgcttataaa tgctcaaaac660caacgagtcg cgataaccaa tgttgatgct ggagttgtaa cctccaacat cgcgttgctg720ctgaatcgaa acaatatggc a 741<210>3<211>741<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gatgttagct tccggttatc aggtgcaaca agcagttcct atggagtttt catttcaaat60ctgagaaaag ctcttccaaa tgaaaggaga ctatacgata tccctctgtt acgttccact120cttcaaggtt ctcaacgcta cgcattgatc catctcacaa atggcgccga tgaaaccatt180tcagtggcca tagacgtaac gaacgtctat attatgggat atcgcgctgg ctccacatcc240tattttttca acgaggcttc tgcaacagaa gctgcaaaat atgtattcaa agacgctatg300
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<223>
<400>4gatgttagct tccggttatc aggtgcaaca agcagttcct atggagtttt catttcaaat60ctgagaaaag ctcttccaaa tgaaaggaga ctatacgata tccctctgtt acgttccact120cttcaaggtt ctcaacgcta cgcattgatc catctcacaa attacgccga tgaaaccatt180tcagtggcca tagacgtaac gaacgtctat attatgggat atcgcgctgg cgatacatcc240tattttttca acgaggcttc tgcaacagaa gctgcaaaat atgtattcaa agacgctatg300cgaaaagtta cgcttccata ttctggcaat tacgaaaggc ttcaaactgc tgcgggcaaa360ataagggaaa atattccgct tggactccca gctttggaca gtgccattac cactttgttt420tactacaacg ccaattctgc tgcgtcggca cttatggtac tcattcagtc gacgtctgag480gctgcgaggt ataaatttat tgagcaacaa attgggaagc gcgctgacaa aaccttccta540ccaagtttag caattataag tttggaaaat agttggtctg ctctctccaa gcaaattcag600atagcgagta ctaataatgg acagtttgaa actcctgttg tgcttataaa tgctcaaaac660caacgagtcg cgataaccaa tgttgatgct ggagttgtaa cctccaacat cgcgttgctg720ctgaatcgaa acaatatggc a 74權利要求
1.一種天花粉蛋白突變體，是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸和自N端的第78位天冬氨酸的兩個氨基酸殘基中至少一個突變，且所述自氨基端的第55位的酪氨酸突變?yōu)橹咀灏被?，所述自氨基端的?8位的天冬氨酸突變?yōu)橛H水性較低的氨基酸的蛋白質。
2.根據(jù)權利要求1所述的天花粉蛋白突變體，其特征在于所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突變?yōu)橹咀灏被岬牡鞍踪|。
3.根據(jù)權利要求1所述的天花粉蛋白突變體，其特征在于所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突變?yōu)橛H水性較低的氨基酸。
4.根據(jù)權利要求1所述的天花粉蛋白突變體，其特征在于所述天花粉蛋白突變體是天花粉蛋白的自N端第55位酪氨酸突變?yōu)橹咀灏被幔易訬端的第78位天冬氨酸突變?yōu)橛H水性較低的氨基酸的蛋白質。
5.根據(jù)權利要求1或2或4所述的天花粉蛋白突變體，其特征在于所述脂肪族氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸；優(yōu)選為甘氨酸
6.根據(jù)權利要求1或3或4所述的天花粉蛋白突變體，其特征在于所述親水性較低的氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸或半胱氨酸；優(yōu)選為絲氨酸。
7.編碼權利要求1-6中任一所述的天花粉蛋白突變體的基因。
8.根據(jù)權利要求7所述的基因，其特征在于所述天花粉蛋白突變體的編碼基因具有下列核苷酸序列之一1)序列1的核苷酸序列；2)序列1中的自5′端第163位-165位為GGA、GGT或GGG的核苷酸序列；3)序列1中的自5′端第163位-165位為GCA、GCT、GCC或GCG的核苷酸序列；4)序列1中的自5′端第163位-165位為GTA、GTT、GTC或GTG的核苷酸序列；5)序列1中的自5′端第163位-165位為CTA、CTT、CTC、CTG、TTA或TTG的核苷酸序列；6)序列1中的自5′端第163位-165位為ATT、ATC或ATA的核苷酸序列。
9.根據(jù)權利要求7所述的基因，其特征在于所述天花粉蛋白突變體的編碼基因具有下列核苷酸序列之一1)序列2的核苷酸序列；2)序列2中的自5′端第232位-234位為TCA、TCT、TCG、AGT或AGC的核苷酸序列；3)序列2中的自5′端第232位-234位為ACA、ACT、ACC或ACG的核苷酸序列；4)序列2中的自5′端第232位-234位為AAT或AAC的核苷酸序列；5)序列2中的自5′端第232位-234位為CAA或CAG的核苷酸序列；6)序列2中的自5′端第232位-234位為GCA、GCT、GCC或GCG的核苷酸序列；7)序列2中的自5′端第232位-234位為TGT或TGC的核苷酸序列。
10.根據(jù)權利要求7所述的基因，其特征在于所述天花粉蛋白突變體的編碼基因具有下列核苷酸序列之一1)序列3的核苷酸序列；2)序列3中的自5′端第163位-165位為GGA、GGT、GGG、GCA、GCT、GCC、GCG、GTA、GTT、GTC、GTG、CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG、ATT、ATC或ATA的核苷酸序列；3)序列3中的自5′端第232位-234位為TCA、TCT、TCG、AGT、AGC、ACA、ACT、ACC、ACG、AAT、AAC、CAA、CAG、GCA、GCT、GCC、GCG、TGT或TGC的核苷酸序列；4)序列3中的自5′端第163位-165位為GGA、GGT、GGG、GCA、GCT、GCC、GCG、GTA、GTT、GTC、GTG、CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG、ATT、ATC或ATA；且序列3中的自5′端第232位-234位為TCA、TCT、TCG、AGT、AGC、ACA、ACT、ACC、ACG、AAT、AAC、CAA、CAG、GCA、GCT、GCC、GCG、TGT或TGC的核苷酸序列。
11.權利要求1-6中任一所述的天花粉蛋白突變體在制備治療惡性腫瘤藥物和AIDS藥物中的應用。
12.權利要求7-10中任一所述的天花粉蛋白突變體編碼基因在制備治療惡性腫瘤藥物和AIDS藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天花粉蛋白突變體及其編碼基因。本發(fā)明的天花粉蛋白突變體，是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸和自N端的第78位天冬氨酸的兩個氨基酸殘基中至少一個突變，且所述自氨基端的第55位的酪氨酸突變?yōu)橹咀灏被?，所述自氨基端的?8位的天冬氨酸突變?yōu)橛H水性較低的氨基酸的蛋白質。本發(fā)明的TCS突變體將在治療惡性腫瘤、AIDS等疾病的臨床應用中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/29GK1746184SQ20041007432
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權日2004年9月9日
發(fā)明者安成才, 米雙利, 王冶, 高音 申請人:北京大學