專利名稱：眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的編碼眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素多核苷酸和多肽的用途和制備。
蛇類在地球上出現(xiàn)的時(shí)間大約是在距今1.5億年前的侏羅紀(jì)。在大約3200種蛇中，約有1300種是有毒蛇類。通常，毒蛇被分為五個(gè)科具有小后溝牙的Boignae；前溝牙類的Elapidae和Hydrophiidae；蝰類的Viperidae和Crotalidae。雖然大多數(shù)毒蛇屬于Boignae科，但由于它們的毒牙小并且危害性也小，因此對(duì)該科毒蛇的研究就較少。相反，對(duì)其它科的蛇毒研究就要廣泛得多。
蛇毒是豐富而濃集的多肽類混合物，毒蛇利用它們來(lái)進(jìn)攻或保護(hù)自己。它們包括酶類、多肽毒素和小分子量化合物。
蛇毒含大量的水溶性酶類，其中絕大多數(shù)是起消化作用的水解酶，分子量范圍在13,000～150,000Da。例如，蛋白酶、內(nèi)切多肽酶、外切多肽酶、磷酸二酯酶和磷脂酶。蛇毒中能檢測(cè)到的酶類至少超過(guò)20種，雖然其中有12種經(jīng)常出現(xiàn)在所有的蛇毒中，但在不同蛇毒中明顯顯示出不同的含量。通常，Viperida和Crotalida的酶量占其總干重的80％-95％，而Elapida蛇毒中則為25％～75％(Mebs，1969)。
盡管人們對(duì)蛇毒和科學(xué)研究已有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，但直到20世紀(jì)50代末和60代初，神經(jīng)毒素才從眼鏡蛇(Sasaki，1957)和海蛇(Caney&Wright，1960)中分離得到較純的樣品。隨后幾年，純品神經(jīng)毒素相繼被分離與鑒定(Yong，1965；Tamiya和Arai，1966；Karlsson等，1966)。1967年，來(lái)源于Naja nigricollis的一個(gè)神經(jīng)毒素氨基酸順序首次被確定(Eaker and Porath，1967)。隨后，來(lái)自眼鏡蛇、銀環(huán)蛇，mambas，Australian elapid，sea Kraits和海蛇的一些神經(jīng)毒素氨基酸順序相繼被報(bào)導(dǎo)。
由于蛇毒穩(wěn)定性較好，因此分離純化時(shí)經(jīng)常采用凝膠過(guò)濾和離子交換層析。但在純化較小分子量神經(jīng)毒組分或經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物時(shí)，RP-HPLC仍然是必需的和最有用的手段(Boulain等，1982)。通常，神經(jīng)毒素純化經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾和離子交換步驟后仍會(huì)含有較少的雜質(zhì)，這些會(huì)嚴(yán)重干擾藥理檢測(cè)。RP-HPLC可被用來(lái)確定這些雜質(zhì)并除去它們。用RP-HPLC純化α-bungarotoxin就是一個(gè)很好的例子(Bailey，1986)。
自從1967年Eaker和Porath首先報(bào)道了來(lái)源于Naja nigricollis的神經(jīng)毒素氨基酸序列后，許多神經(jīng)毒素被分離得到并得以測(cè)序。現(xiàn)在已有超過(guò)100個(gè)神經(jīng)毒素序列已知(Endo and Tamiya，1991)神經(jīng)毒素又可被分為短鏈神經(jīng)毒素和長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素。短鏈神經(jīng)毒素含60-62氨基酸殘基和4對(duì)二硫鍵。二硫鍵位置通常位于Cys3-Cys24；Cys17-Cys45；Cys49-Cys60；Cys61-Cys66。另一方面，長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素含70-74氨基酸殘基和5對(duì)二硫鍵，比短鏈神經(jīng)毒素多一對(duì)二硫鍵Cys30-Cys34。此外，長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素在序列上具有其它特點(diǎn)(1)4-16位有氨基酸殘基缺失；(2)32、34、35、和36位則有氨基酸殘基插入；(3)在Cys45和Cys49中插入Ala-46-Ala-47-Thr-48，短鏈神經(jīng)毒素則為Gly-48；(4)C-末端多5-9個(gè)氨基酸殘基。
眼鏡蛇蛇毒除神經(jīng)毒素外，通常還有另一類名為Cardiotoxins或Cytotoxins的基本多肽(60-63氨基酸殘基)。該類多肽在序列上與神經(jīng)毒素高度同源。然而，它們幾乎對(duì)乙酰膽堿受體沒(méi)有親和性，只與細(xì)胞膜作用而導(dǎo)致永久性去極化(Chang，1979)。除去完全不同的藥理作用模式，兩類毒素?fù)碛性S多類似的不可變氨基酸殘基。例如Tyr-25，Gly-44，Pro-50，Leu/Ile/Val/Tyr-58，Ser/Thr-63，Asp/Asn/Glu-64和Asn/Asp-67。四對(duì)二硫鍵Cys3-Cys24；Cys17-Cys45；Cys49-Cys60；Cys61-Cys66的位置也是一致的。該事實(shí)表明一些不變殘基對(duì)神經(jīng)毒素和細(xì)胞毒素(Cytotoxin)在決定它們特殊的三維結(jié)構(gòu)上是至關(guān)重要的。相對(duì)應(yīng)的，一些氨基酸殘基在神經(jīng)毒素家族中是保守的，而在Cytotoxins家族中并非如此。這些殘基包括lys-27，Trp-29，Asp-31，His/Phe/Trp-33，Arg/lys-37，Gly-38，Glu/Asp-42，Val/Ala-52和lys/Arg-53。它們對(duì)神經(jīng)毒性起到直接或間接的作用，但對(duì)細(xì)胞毒并無(wú)影響。同樣有可能一個(gè)殘基既對(duì)神經(jīng)毒性結(jié)構(gòu)起作用又對(duì)神經(jīng)毒性功能起作用。因此，人們?cè)噲D明確每一個(gè)保守殘基的“結(jié)構(gòu)作用”和“功能作用”(Rydenetal，1973；Tamiya，1980)。
神經(jīng)毒素作用的靶位點(diǎn)是N型乙酰膽堿受體，位于骨骼肌或電器官的突觸后細(xì)胞膜，其通過(guò)傳輸化學(xué)信息到電位反應(yīng)來(lái)介導(dǎo)突觸傳遞作用。神經(jīng)遞質(zhì)與乙酰膽堿受體結(jié)合導(dǎo)致受體離子通道的開(kāi)放，增加了突觸細(xì)胞膜對(duì)陽(yáng)離子的通透性，從而使位于神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的終板細(xì)胞膜去極化，最終導(dǎo)致肌收縮。
乙酰膽堿結(jié)合到受體上后，導(dǎo)致離子通道快速開(kāi)放，并且在幾個(gè)毫秒內(nèi)，離子通道又緩慢關(guān)閉。乙酰膽堿受體在對(duì)激動(dòng)劑延長(zhǎng)暴露時(shí)間后，會(huì)轉(zhuǎn)變到另一種狀態(tài)，即增強(qiáng)了對(duì)這些配體的親和力，該過(guò)程持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，需要幾秒到幾分鐘，這種轉(zhuǎn)變可能和功能性脫敏作用(desensitization)有關(guān)。
乙酰膽堿是脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中一個(gè)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，一大批動(dòng)、植物毒素能干擾它的正常功能。例如，來(lái)自煙草植物的葉片的生物堿、煙堿，具有乙酰膽堿類特性，能激活中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿受體。
乙酰膽堿受體可進(jìn)一步分為兩類(1)對(duì)煙堿敏感的煙堿乙酰膽堿受體；(2)對(duì)蘑菇毒素蕈毒堿敏感的蕈毒堿乙酰膽堿受體。乙酰膽堿受體如同存在于脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一樣，也存在于脊椎動(dòng)物的骨骼肌和自主神經(jīng)節(jié)。
幾乎所有與乙酰膽堿受體作用的蛇毒神經(jīng)毒素有選擇地與煙堿受體作用，只有開(kāi)始觀察到的與蕈毒堿受體結(jié)合的mamba蛇毒是有作用的(Adem etal.，1988)。煙堿受體根據(jù)它們所處位置及藥理特性可以被進(jìn)一步分類。
蛇神經(jīng)毒素由于其結(jié)合乙酰膽堿受體的高親和性而對(duì)神經(jīng)藥理學(xué)家十分重要。通常，這種結(jié)合只是緩慢可逆，使得電生理學(xué)家有足夠的時(shí)間來(lái)進(jìn)行詳細(xì)的生化和定位研究已鑒定的受體，蛇神經(jīng)毒素是鑒定神經(jīng)元受體的功能特點(diǎn)和能區(qū)分的受體亞型的有價(jià)值探針。
神經(jīng)毒素結(jié)合到乙酰膽堿受體上后，阻斷了乙酰膽堿的結(jié)合，但并沒(méi)有誘導(dǎo)離子通道的開(kāi)放，結(jié)果阻斷了神經(jīng)傳導(dǎo)，對(duì)乙酰膽堿受體四種亞基分別進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，只有α-亞基能夠與α-bungrotoxin結(jié)合(Haggerty abd Froehner，1981；Gershonietal.，1983).
乙酰膽堿受體上的兩個(gè)α-亞基的結(jié)合位點(diǎn)似乎并不等價(jià)，因?yàn)槠渲幸粋€(gè)在靠近結(jié)合位點(diǎn)的二硫鍵被還原后對(duì)親和標(biāo)記更敏感(Wolosin，1980)。這種不等價(jià)可能是因?yàn)?41位N-天冬酰胺糖基化程度的差異或者是因?yàn)橐阴Ｄ憠A受體兩個(gè)α-亞基不對(duì)稱的四級(jí)結(jié)構(gòu)。這種不等價(jià)現(xiàn)象在神經(jīng)毒素和拮抗劑中都有發(fā)生(Conti-Tronconi etal.1984)。
神經(jīng)毒素是分子量相對(duì)較小的蛋白質(zhì)，在蛇毒中相對(duì)含量較高，容易分離和純化，并且存在大量天然的同系物，另外它們還具有強(qiáng)而專一的生理功能等特點(diǎn)，因此一直以來(lái)是生物學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。從1975年Sasaki從海蛇蛇毒中首次分離出相對(duì)純化的神經(jīng)毒素后，生物學(xué)家對(duì)神經(jīng)毒素已進(jìn)行了廣泛而深入的研究。包括采用圓二色譜、激光拉曼光譜、X-射線晶體衍射和NMR等技術(shù)，以及現(xiàn)代經(jīng)常應(yīng)用的基因工程、定點(diǎn)突變等技術(shù)手段，來(lái)對(duì)神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行詳細(xì)的研究。
神經(jīng)毒素也是研究受體的極好工具。α-bungrotoxin為受體的發(fā)現(xiàn)以及受體學(xué)說(shuō)的證明提供了關(guān)鍵的證據(jù)，至今仍是研究乙酰膽堿受體結(jié)構(gòu)、功能及其關(guān)系的良好材料。神經(jīng)毒素也是研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等的工具。
神經(jīng)毒素還具有很高的醫(yī)用價(jià)值，變構(gòu)神經(jīng)毒素是目前治療重癥肌無(wú)力最有效的藥物之一。而研究神經(jīng)毒素免疫學(xué)特性，則對(duì)蛇傷的治療至關(guān)重要。中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所熊郁良等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒素有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)和一定的戒毒功能。
近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒素cardiotoxin具有抗腫瘤作用，而且Newman，R.A.(1993)等人發(fā)現(xiàn)cardiotoxin與crotoxin(屬磷酸脂酶A2)合用能增強(qiáng)其抗癌效果。1997年，Costa，L.A.等人將該復(fù)合物應(yīng)用于一期臨床試驗(yàn)，在1998年首次報(bào)道兩名患者(皮膚癌和乳腺癌)用該復(fù)合物治療后腫瘤明顯縮小，其中一例腫瘤消失。
由于蛇類的神經(jīng)毒素神經(jīng)毒素具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，因此，本領(lǐng)域迫切需要研究和開(kāi)發(fā)新的蛇類神經(jīng)毒素。
本發(fā)明的目的是提供一種新的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素多肽，它包含具有SEQ ID NO2或4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼上述眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列具有SEQ ID NO1中所示的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素作為活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是RT-PCT產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為DNA分子量標(biāo)記物；泳道2為眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的cDNA產(chǎn)物。
圖2顯示了質(zhì)粒pT7ZZa-SNT的構(gòu)建過(guò)程。
圖3是大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的15％SDS-PAGE電泳圖。泳道1、2和3分別為誘導(dǎo)1.5、2、和2.5小時(shí)的樣品，泳道4是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物(94、67、43、30、20、14.5kDa)，泳道5為未誘導(dǎo)的對(duì)照。箭頭所指之處為目的基因的表達(dá)條帶。
圖4是酵母陽(yáng)性克隆GS115經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后培養(yǎng)基上清液的16.5％SDS-PAGE電泳圖。泳道1為陰性對(duì)照，泳道2、3、4、5為酵母陽(yáng)性克隆GS115的培養(yǎng)上清液，泳道6為分子量標(biāo)記物。
圖5是純化的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的RP-HPLC圖。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素或多肽”是指眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ IDNO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的DNA序列能用幾種方法獲得。例如用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離DNA。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源性核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。
編碼眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的特異DNA片段序列產(chǎn)生也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
上述方法中，分離基因組DNA最不常用。當(dāng)需要的多肽產(chǎn)物的整個(gè)氨基酸序列已知時(shí)，DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。或者，選用的方法是分離cDNA序列。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫(kù)。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫(kù)也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫(kù)，如Clontech公司的不同cDNA文庫(kù)。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時(shí)，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的核苷酸序列的測(cè)定可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)。這類核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。為了獲得全長(zhǎng)的cDNA序列，測(cè)序需反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測(cè)定多個(gè)克隆的cDNA序列，才能拼接成全長(zhǎng)的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素多肽(Science，1984；2241431)。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明的多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細(xì)胞可以用來(lái)作為抗原以生產(chǎn)抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。多克隆抗體可以通過(guò)將此多肽直接注射動(dòng)物的方法得到。制備單克隆抗體的技術(shù)包括雜交瘤技術(shù)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。
可以將本發(fā)明的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。本發(fā)明的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素很容易制成水劑或凍干制劑，其中后者更易于長(zhǎng)期保存。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過(guò)局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來(lái)給藥。施用于患者的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。一般，本發(fā)明眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素用于鎮(zhèn)痛時(shí)，其使用劑量為1-1000ug/kg/天，較佳地為10-200ug/kg/天；用于抗腫瘤時(shí)，其使用劑量為50-1500ug/kg/天，較佳地為100-500ug/kg/天。
本發(fā)明的人眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是本發(fā)明眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素長(zhǎng)度僅62個(gè)氨基酸。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素。本發(fā)明的多核苷酸是從眼鏡蛇(Na ja Na jaatra)的cDNA文庫(kù)中分離出的。它包含的開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)度252個(gè)堿基(含終止密碼子)，編碼21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和由62個(gè)氨基酸構(gòu)成的成熟的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素。本發(fā)明的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的分子量是約23千道爾頓。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素cDNA的克隆一 材料與方法1 材料眼鏡蛇(Naja Naja atra，福建)和購(gòu)于上海市銅川路蛇市場(chǎng)；總RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、T4 DNA連接酶、pGEM-T質(zhì)粒、核酸Marker均購(gòu)自Promega公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Gibco公司；X-gal、IPTG購(gòu)自華美公司；宿主菌E.coli JM109為常用菌株。
2 方法2.1 總RNA的提取眼鏡蛇活殺取頭，迅速取出毒腺(去除毒腺周圍結(jié)締組織)；剪碎，加液氮研磨成粉末，加入變性溶液后，離心，取上清；其余步驟均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，抽提總RNA，以2％瓊脂糖電泳來(lái)判斷總RNA的質(zhì)量。RNA樣品用BECKMAN DU-7000進(jìn)行定量后，置于-20℃，備用。
2.2 RT-PCR反應(yīng)2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA合成)首先去除樣品中殘留DNA，反應(yīng)體系如下總RNA 10μg1μl10×PCR緩沖液2μl25mM MgCl22μlDNase I 1μlddH2O 9μl混合后，置于37℃水浴，15分鐘，除去樣品中的殘留DNA。
然后，置于70℃水浴，15分鐘，使DNase I失活，置于冰浴1分鐘以上。然后，再加入Oligo(dT) 1μldNTP 1μlDTT 2μl置于42℃，5分鐘，加入1μl M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，置于42℃，50分鐘。
而后轉(zhuǎn)到70℃水浴，15分鐘，轉(zhuǎn)入冰浴，加入1μl RNase H，置于37℃水浴，20分鐘。備用。
2.2.2 PCR反應(yīng)參考GenBank中已發(fā)表的蛇毒神經(jīng)毒素基因序列，經(jīng)微機(jī)分析后設(shè)計(jì)以下三對(duì)引物引物15′AAGATGGAAACTCTGTTGCTGACC 3′引物25′AAGTCAAAGACAGTAGTGGAGAAGG 3′各引物分別在ABI DNA自動(dòng)合成儀上合成，用合成引物分別進(jìn)行以下PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下
PCR反應(yīng)按下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)94℃變性70秒；50℃復(fù)性60秒；72℃延伸60秒，最后一個(gè)循環(huán)延長(zhǎng)10分鐘。
2.3 cDNA的克隆及其DNA序列分析將上述PCR產(chǎn)物用酚∶氯仿抽提純化后，用T4DNA連接酶將它們分別直接克隆到pGEM-T載體上。連接反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物 2μlT4連接酶1μl緩沖液 1μlddH2O 6μl16℃，反應(yīng)進(jìn)行4小時(shí)。
將以上連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli細(xì)胞(JM109)，將連接產(chǎn)物與200μl感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘，然后42℃水浴中放置90秒，最后，將混合溶液鋪到含Amp、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆。
挑選陽(yáng)性克隆，接種LB斜面，37℃培養(yǎng)。抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，反應(yīng)體系如下質(zhì)粒DNA5.00μl10×緩沖液 2.00μlSac I 0.25μlApa I 0.25μlddH2O 12.5μl37℃，反應(yīng)1小時(shí)。2％瓊脂糖電泳檢測(cè)。
將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒分別用DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序。
二、結(jié)果在抽提眼鏡蛇毒腺總RNA后，經(jīng)2％瓊脂糖電泳檢查后可看到28S和18S兩條rRNA條帶，說(shuō)明總RNA無(wú)明顯降解。
參考已報(bào)道的神經(jīng)毒素基因序列，設(shè)計(jì)RT-PCR引物時(shí)主要考慮將引物1分別設(shè)計(jì)在信號(hào)肽位點(diǎn)前，引物2分別設(shè)計(jì)在基因3′端非編碼區(qū)的互補(bǔ)序列。
用相應(yīng)的引物分別進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖電泳初步鑒定，可明顯看到相應(yīng)條帶(見(jiàn)
圖1)，其中在383bp處有一短鏈神經(jīng)毒素cDNA。
將以上cDNA克隆入pGEM-T載體上后，對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果如下1.眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的cDNA序列TTAGATGGAA ACTCTGTTGC TGACCTTGCT GGTGGTGACA ATCGTGTGCC TGGACTTAGGATACACCCTG GAATGTCACA ACCAACAATC ATCGCAAACT CCAACCACTA CAGGTTGTTCAGGTGGGGAG ACCAATTGCT ATAAAAAGCG TTGGCGTGAT CACCGTGGAT ATAGAACCGAGAGGGGATGT GGTTGCCCTA TAGTGAAGAA CGGCATTGAA AGTAACTGTT GCACAACAGACAGATGCAAC AATTAGCTCT CCGAGTGGCT AAATTCCTTG AGTTTTGCTC TCATCCATCATGGACCATCC TTGAAAATTT ATGCTTGTGG CCTTTAGCAC CAGATGGTCC ATCATTCCTTCTCCACTACT GTCTTTGACT T(SEQ ID NO3)經(jīng)BLAST在GenBank中查詢序列同源性后，未見(jiàn)報(bào)道，登記號(hào)為AF161797(因保密關(guān)系，在本申請(qǐng)之前未公開(kāi))。編碼序列示于SEQ ID NO1。
經(jīng)分析后，得出以下結(jié)論該cDNA序列是短鏈神經(jīng)毒素，ATG→TAG為編碼區(qū)。
其中，ATG→ACC信號(hào)肽區(qū)域；CTG→TAG蛋白功能區(qū)。
根據(jù)其cDNA序列，推導(dǎo)出相應(yīng)的蛋白序列如下(含信號(hào)肽的全序列示于SEQ IDNO4)信號(hào)肽METLLLTLLVVTIVCLDLGYT功能區(qū)LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPIVKNGIESNCCTTDRC NN(SEQ ID NO2)來(lái)源于眼鏡蛇毒腺的短鏈神經(jīng)毒素(62個(gè)氨基酸殘基)功能區(qū)與Chu.R.C和Yang.C.C報(bào)道的中華眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素cDNA有很高的同源性，只有很少幾個(gè)氨基酸差別(45位和52位)。62個(gè)氨基酸殘基的短鏈神經(jīng)毒素與另兩個(gè)基因的同源性不高。
LECHNQQSSQTPTTTGCSGGETNCYKKRWRDHRGYRTERGCGCPIVKNGIESNCCTTDRCNN實(shí)施例2眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素在大腸桿菌中的表達(dá)生產(chǎn)隨著基因工程的迅速發(fā)展，目的基因的表達(dá)已經(jīng)可以選擇多種表達(dá)系統(tǒng)。為獲得足夠量的蛋白，人們根據(jù)不同研究目標(biāo)，既可以選擇原核表達(dá)系統(tǒng)，也可以選擇真核表達(dá)系統(tǒng)，在該實(shí)施例中，選擇的原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)。
一 材料與方法1. 材料表達(dá)載體pT7ZZa和宿主菌E.coli BL21(DE3)為常用質(zhì)粒。
BamH I、Sac I、Sma I和Klenow等工具酶購(gòu)自Promega公司；IPTG購(gòu)自華美公司；pSK質(zhì)粒購(gòu)自Stratagene公司；各引物分別在ABI DNA自動(dòng)合成儀上合成。
LB培養(yǎng)基配方如下細(xì)菌胰蛋白胨 10g細(xì)菌-酵母提取物 5gNaCl 10g將以上溶質(zhì)溶于950ml去離子水中，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，再用去離子水定容到總體積為1L，15磅高壓蒸氣滅菌20分鐘。
全細(xì)胞裂解液(Cracking buffer)配方如下Tris-HCl(pH6.8) 50mMSDS 1％EDTA 2mM糖 400mM溴酚藍(lán) 0.1％2 方法2.1 大腸桿菌表達(dá)載體pTTZZa-SNT的構(gòu)建經(jīng)微機(jī)分析基因序列后，設(shè)計(jì)引物如下，引入酶切位點(diǎn)BamH I和Sac I。5′ 3′ (BamH I)5′ 3′ (Sac I)將克隆在質(zhì)粒pGEM-T中的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素基因，利用以上引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為按下列參數(shù)循環(huán)35次，94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸50秒，最后一個(gè)循環(huán)72℃反應(yīng)10分鐘。
經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，去除該短鏈神經(jīng)毒素基因的信號(hào)肽序列，得到兩端帶BamHI和Sac I酶切位點(diǎn)的短鏈神經(jīng)毒素功能區(qū)基因，然后將PCR產(chǎn)物用Klenow酶補(bǔ)平。將其與pSK(Sma I預(yù)先酶切)連接，DNA測(cè)序確認(rèn)無(wú)序列錯(cuò)誤。
用BamH I和Sac I對(duì)pSK重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收目的基因。用BamH I和SacI對(duì)表達(dá)載體pT7ZZa進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，將短鏈神經(jīng)毒素功能區(qū)基因克隆到表達(dá)載體pT7ZZa質(zhì)粒上，構(gòu)建T7啟動(dòng)子控制下的含有短鏈神經(jīng)毒素功能區(qū)基因的表達(dá)質(zhì)粒pT7ZZa-SNT(見(jiàn)圖2)。
2短鏈神經(jīng)毒素基因融合蛋白在大腸桿菌中(E.coli BL21(DE3))的融合表達(dá)將重組pT7ZZa-SNT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，37℃平板培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)8小時(shí)左右，以2％接種量轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)至OD 600 0.4-0.6加終濃度1mmol/l的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。
取不同時(shí)間段的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞裂解反應(yīng)，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖3)。具體操作按分子克隆手冊(cè)(SambrooK，J.et al.，Molecular Cloning， ALaboratory Manual 2nd，1989，Cold Spring Harbor Press，NeW York)進(jìn)行。
含質(zhì)粒PT7ZZa-SNT大腸桿菌E.coli BL21(DE3)于2000年1月17日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)，武漢)，保藏號(hào)為CCTCC No.M200001，名稱為Escherichia coli BL(DE3)Cai Qin SNT.
3.結(jié)果短鏈神經(jīng)毒素基因在引入酶切位點(diǎn)BamH I和Sac I后，構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pT7ZZa-SNT并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)后，在T7啟動(dòng)子控制下，通過(guò)IPTG的誘導(dǎo)，短鏈神經(jīng)毒素得到表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析，得到一條分子量約為7kDa的表達(dá)條帶。表達(dá)量約為25％左右。
實(shí)施例3眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素在酵母中的表達(dá)生產(chǎn)在該實(shí)施例中，選用的真核表達(dá)系統(tǒng)是畢赤氏酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)。
材料表達(dá)載體pHIL-S1購(gòu)白Novagen公司。宿主菌GS115(his4)為一常用酵母菌。
培養(yǎng)基為MD(Minimal Dextrose)培養(yǎng)基和YEPD(Yeast Extract PeptoneDextrose)培養(yǎng)基。
設(shè)計(jì)如下所示的，引入酶切位點(diǎn)BamH I和Sac I。5’ 3’(EcoR I)5’ 3’(BamH I)將克隆在質(zhì)粒pGEM-T中的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素基因，利用以上引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為按下列參數(shù)循環(huán)35次，94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸50秒，最后一個(gè)循環(huán)72℃反應(yīng)10分鐘。
經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，去除該短鏈神經(jīng)毒素基因的信號(hào)肽序列，得到兩端帶EcoRI和BamH I酶切位點(diǎn)的短鏈神經(jīng)毒素功能區(qū)基因，然后將PCR產(chǎn)物用Klenow酶補(bǔ)平。將其與pSK(Sma I預(yù)先酶切)連接，DNA測(cè)序確認(rèn)無(wú)序列錯(cuò)誤。
用EcoRI和BamH I對(duì)pSK重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收目的基因。用EcoRI和BamHI對(duì)表達(dá)載體pHIL-S1進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，將短鏈神經(jīng)毒素功能區(qū)基因克隆到表達(dá)載體pHIL-S1質(zhì)粒上，構(gòu)建pAOX1啟動(dòng)子控制下的含有短鏈神經(jīng)毒素功能區(qū)基因的表達(dá)質(zhì)粒pHIL-S1-SNT。
將質(zhì)粒pHIL-S1-SNT轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli(TG1)中，大量制備重組質(zhì)粒。然后用SacI酶切pHIL-S1-SNT，使其線性化。再用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母(Pichiapastoris)GS115，在MD平板上篩選His+表型。對(duì)于初篩的陽(yáng)性克隆，將其點(diǎn)于MD平板上，再次篩選，挑選出陽(yáng)性克隆。
對(duì)于陽(yáng)性克隆，通過(guò)抽提克隆染色體DNA并用PCR加以鑒定，證實(shí)眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素編碼序列確已整合入染色體。
將陽(yáng)性酵母單菌接種于25毫升BMGY培養(yǎng)基中，28-30℃搖床培養(yǎng)至OD600為2-6，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期，室溫離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中使之OD600為1，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24小時(shí)添加終濃度為0.5％的甲醇(100％)，誘導(dǎo)表達(dá)3-5。將培養(yǎng)液離心后，取上清液濃縮后取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(圖4)，圖中泳道2-5(陽(yáng)性克隆)在約7千道爾頓處有一條帶，即為表達(dá)的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素。
實(shí)施例4大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的分離純化在分離純化天然神經(jīng)毒素時(shí)，經(jīng)常采用凝膠過(guò)濾和離子交換層析的方法。但是神經(jīng)毒素純化經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾和離子交換步驟后仍會(huì)含有少量的雜質(zhì)，這些雜質(zhì)有可能會(huì)嚴(yán)重干擾藥理檢測(cè)。RP-HPLC仍然是必需的和最有用的手段。雖然神經(jīng)毒素分子較小，只有62個(gè)氨基酸殘基，卻含有4對(duì)二硫鍵。因此，蛋白分子的正確折疊與二硫鍵的正確配對(duì)與否對(duì)功能的影響就十分關(guān)鍵。
一 材料與方法1、材料BIOFLO 3000發(fā)酵罐(5L)，New Brunswick Scientific公司；IgG Sepharose 6Fast Flow，Sephadex G25，SP-Sepharose FF，蛋白分子量Marker均購(gòu)自Pharmacia公司；HPLC儀器，Waters公司(486型)；半制備反相C18柱，PROSPHERE 300(300×7.8mm，φ5μm)，Alltech公司。Urea，β-mercaptoethanol，glutathione(oxidized)均購(gòu)自Sigma公司，其余化學(xué)試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。
2×YT培養(yǎng)基配方如下細(xì)菌胰蛋白胨 16g細(xì)菌-酵母提取物10gNaCl5g用去離子水將溶質(zhì)完全溶解，5N NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，最后定容于1L，15磅蒸氣滅菌20分鐘。
SDS-PAGE(Tris-Tricine)緩沖體系及母液配方
2 方法2.1 發(fā)酵將含pT7ZZ-NT質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)接種于LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)8小時(shí)左右，然后按2％接種量轉(zhuǎn)接于5L發(fā)酵罐，發(fā)酵采用2×YT培養(yǎng)基(配制5L)，發(fā)酵條件如下37℃，300-700rpm；通氣5.3～8.0 L/min(波動(dòng))；Feed 1，消泡泵(泡敵-水混合液)；Feed 2，碳源泵(50％甘油)。
OD600達(dá)6.0左右時(shí)，加終濃度為1mmol/1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(Feed 2暫停約15分鐘)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)(OD600達(dá)8.0左右)。離心，收集菌體。用超聲波破碎儀破菌后，離心分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE證明融合蛋白主要存在于上清。
2.2 融合蛋白的親和純化取2.1中上清液，凍干縮小體積。溶于TST(Tris-saline Tween 2050mM Tris緩沖液，pH7.6；150 mM NaCl；0.05％Tween 20)緩沖液中，上樣于IgG Sepharose6 Fast Flow親和柱，用0.5M NH4Ac，pH 5.0的緩沖液洗脫樣品，收集，SDS-PAGE鑒定。
將樣品冷凍干燥后，備用。
2.3 融合蛋白的裂解將上述經(jīng)親和層析后得到的融合蛋白(電泳純)，首先用5％巰基乙醇在pH8.0室溫下處理24小時(shí)，再加入色胺(按每分子甲硫氨酸加5分子的色胺)，然后采用溴化氰裂解。反應(yīng)體系如下
反應(yīng)物混合后，在反應(yīng)容器中充滿氮?dú)?，密封反?yīng)容器口，避光，室溫，預(yù)先摸索最佳反應(yīng)時(shí)間。
融合蛋白定量按以下公式計(jì)算測(cè)定融合蛋白在260nm和280nm下的吸光度，按C(mg/ml)＝1.45A280－0.74A260定量。
預(yù)實(shí)驗(yàn)1.各取50ug脫鹽后的融合蛋白，分裝于7個(gè)1.5ml小離心管中，真空冷凍抽干，備用。
2.在通風(fēng)櫥中新鮮配制裂解液(70％甲酸/50mg/ml CNBr)3.分別在樣品中各加入50ul裂解液，在反應(yīng)管中充氮?dú)?，封口，室穩(wěn)，置于25℃水浴中。
4.分別在反應(yīng)0、2、4、8、12、24、48小時(shí)各取樣品，置于-80度冰箱凍存，終止反應(yīng)。
5.全部反應(yīng)結(jié)束后，將各樣品冷凍抽干。
6.分別溶解于50ul雙蒸水，各取5ul走12.5％的SDS-PAGE(Tris-Tricine)電泳鑒定裂解效果。見(jiàn)下表
*裂解率100％-(LKB激光掃描儀掃描SDS-PAGE中融合蛋白在總蛋白中的百分率含量)，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇24小時(shí)作為融合蛋白裂解反應(yīng)時(shí)間。
以下按照上述實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行大量裂解融合蛋白。將反應(yīng)混合物凍干，備用。
將裂解反應(yīng)物溶解于6M鹽酸胍，0.1M Tris，pH8.5，0.1M DTT的溶液中，備用。
2.5 眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素陽(yáng)離子柱的純化將上述反應(yīng)混合物，用4倍體積的2.5M尿素(pH2.5)稀釋后，上樣于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂SP-Sepharose FF，用2M尿素/10mmol HCl洗滌雜蛋白，然后再用2M尿素/10mmol HCl/100 mmol NaCl洗脫樣品，280nm監(jiān)測(cè)，SDS—PAGE檢測(cè)樣品。凍干，備用。
2.6 脫鹽將上述樣品用分子篩(Sephadex G25)脫鹽。凍干，備用。
2.7 眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素C18反相HPLC的制備上樣于半制備柱(C18μ-Bondapak，Waters)，用線性梯度洗脫40分鐘(A相水/乙氰/三氟乙酸＝95％/5％/0.1％；B相水/乙氰/三氟乙酸＝20％/85％/0.1％)，280nm監(jiān)測(cè)，收集洗脫蜂。凍干，備用。
2.8 蛋白再?gòu)?fù)性將2.7的樣品以1mg蛋白/ml的濃度溶解于0.1M Tris-HCl(pH 8.7)，同時(shí)，該溶液中含2％的β-巰基乙醇和8M的脲，室溫放置1小時(shí)，然后在4℃下，對(duì)0.1MTris-HCl(pH 8.0)緩沖液進(jìn)行透析，后者緩沖液中含10mM氧化型谷胱甘肽，其間換三次以上的緩沖液，48小時(shí)后將樣品凍干，備用。
結(jié)果融合蛋白經(jīng)過(guò)高效率的親和柱純化后達(dá)到電泳純；接著，融合蛋白在進(jìn)行溴化氰裂解反應(yīng)后，分子量約為7000Da的目的蛋白被切離下來(lái)。
目的蛋白在經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附、分子篩脫鹽以及最后C18反相HPLC純化后，得到純品(見(jiàn)圖5，純度大于95％)。
實(shí)施例5酵母表達(dá)產(chǎn)物的分離純化酵母培養(yǎng)上清液，于4℃，在磁力攪拌器緩慢攪拌下，加入硫酸銨至30％飽和度，離心棄去沉淀。在上清液中再加入硫酸銨至60％飽和度，離心取沉淀。然后按實(shí)施例4類似的方式，先用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化目的蛋白，再用反相C18柱用梯度HPLC純化，最后進(jìn)行復(fù)性。
結(jié)果表明，Pichia Pastoris表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和反相C18HPLC純化后，得到了純品(純度＞95％)。使用Pichia Pastoris表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)在于，在表達(dá)質(zhì)粒pHIL-S1上PHO1分泌信號(hào)肽的作用下，目的蛋白被分泌到培養(yǎng)基中，從而給純化工作帶來(lái)很大方便。蛋白純化程序的簡(jiǎn)化顯然增加了對(duì)蛋白質(zhì)本身的保護(hù)。
實(shí)施例6眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的免疫學(xué)測(cè)定初次免疫采用購(gòu)自Sigma公司的α-Bungarotoxin(Bungarus multicinctus)(一種蛇神經(jīng)毒素)，以0.5毫克蛋白/千克的劑量免疫兔子，用弗氏完全佐劑等比例體積混勻乳化后，背部、多點(diǎn)注射。4周后，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，以相同劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。對(duì)免疫后的兔子進(jìn)行耳緣靜脈采血，制備抗血清。經(jīng)測(cè)定，抗血清的抗體效價(jià)達(dá)109。
用如上制備的抗血清進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明(1)大腸桿菌表達(dá)的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素融合蛋白，(2)純化后的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素能與多抗結(jié)合，這表明大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物有明顯的神經(jīng)毒素抗原決定蔟。
類似地，對(duì)眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的酵母表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白免疫印跡測(cè)試，結(jié)果也表明，酵母表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的神經(jīng)毒素抗原決定蔟。
實(shí)施例7眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的理化特性(1)等電點(diǎn)對(duì)實(shí)施例2和3中所制得的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素純樣品，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。結(jié)果表明，眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的pI值為9.47。
(2)分子量分子量測(cè)定委托中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所和生物化學(xué)研究所測(cè)試，大腸桿菌表達(dá)的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素分子量為6949±0.73；Pichia表達(dá)的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素分子量為7380。測(cè)定結(jié)果與理論值相符。
(3)N-末端測(cè)定N-末端用Edman法測(cè)定，儀器為Bechman Proton LF3200測(cè)序儀。N-末端程序結(jié)果與cDNA推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列N-末端一致，即眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素前15個(gè)殘基LECHNQQSSQTPTTT。
(4)圓二色譜測(cè)定將實(shí)施例2和3中所制得的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素純樣品，分別溶于磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)中，在日本JASCO的J-500C型圓二色儀上測(cè)試，光徑為0.1厘米，室溫，掃描波長(zhǎng)為250-190納米，連續(xù)掃描5次。結(jié)果表明，最大值在195納米處，最小值在210納米(單位度·厘米2·摩爾-1)。
實(shí)施例8眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的毒理性質(zhì)按寇氏法，按0.75的比率遞減，將實(shí)施例2和3中所制得的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素純樣品，用生理鹽水分別稀釋至以下5組給藥濃度1200、900、675、506.25、和379.6微克/千克(大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物)；或2750、1925、1347.5、943.25、660.28和462.19微克/千克(酵母表達(dá)產(chǎn)物)。
取昆明小鼠隨機(jī)分組，每組10只，每只動(dòng)物分別在腹腔注射相應(yīng)劑量，注射體積為0.5ml/20g小鼠。注射后觀察7天，死亡動(dòng)物進(jìn)行尸檢和病理觀察。
結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的半致死劑量LD50＝735.7±1.0715ug/千克；酵母表達(dá)的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的半致死劑量LD50＝1298.7±1.122ug/千克。
實(shí)施例9眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的藥理性質(zhì)1、鎮(zhèn)痛作用根據(jù)E.coli和Pichia表達(dá)產(chǎn)物各自LD50的結(jié)果，分別設(shè)計(jì)以下5組濃度(單位ug/kg)。
將雄性昆明種小鼠隨機(jī)分組，每組10只，按上述濃度將樣品及生理鹽水對(duì)照分別給每組小鼠腹腔注射，30分鐘后，分別給各組小鼠腹腔注射0.7％冰乙酸0.2ml，5分鐘后觀察小鼠在10分鐘內(nèi)的扭體次數(shù)，記錄扭體次數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠腹腔注射0.7％冰乙酸后，可以觀察到小鼠腹部收縮、扭體等疼痛現(xiàn)象。
具體數(shù)據(jù)參見(jiàn)下表，鎮(zhèn)痛有效率按以下公式計(jì)算
表1，短鏈神經(jīng)毒素對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)的測(cè)定(扭體法)
*P＜0.01，與對(duì)照組比較鑒于大多數(shù)藥物的治療指數(shù)大于3時(shí)，在動(dòng)物試驗(yàn)中是比較安全的。因此，我們采用各樣品的三分之一LD50值作為最大劑量，同時(shí)也作為用藥的起始劑量。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在起始劑量(高劑量)時(shí)，動(dòng)物活動(dòng)減少，對(duì)醋酸注射引起的疼覺(jué)有很明顯的抑制作用，各樣品的鎮(zhèn)痛效應(yīng)都應(yīng)達(dá)到100％。因此，分別以50％的比例縮小用藥劑量，結(jié)果，各給藥組在低劑量時(shí)的扭體次數(shù)也比對(duì)照組減少，有明顯的劑量關(guān)系，具體為大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物在其劑量為L(zhǎng)D50值的二十分之一時(shí)，仍有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)；同樣，酵母表達(dá)產(chǎn)物在其劑量為L(zhǎng)D50值的十六分之一時(shí)，也有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
2、抗腫瘤作用(1)對(duì)小鼠肉瘤S180(實(shí)體型)的抑瘤作用取生長(zhǎng)良好的小鼠肉瘤S180腹水，用生理鹽水1∶4稀釋后，每只小鼠腋下接種0.2ml，隨機(jī)分組，設(shè)生理鹽水組(陰性對(duì)照)和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(100mg/kg，ip×2)，三個(gè)樣品各分成二個(gè)給藥劑量組，次日起連續(xù)腹腔給藥7天，第10天脫頸處死動(dòng)物，解剖取瘤塊，比較各劑量組瘤重之大小。
根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤抑制率 結(jié)果見(jiàn)下表表2，短鏈神經(jīng)毒素各樣品對(duì)小鼠肉瘤S180(實(shí)體型)的抑制作用組 別劑量 給藥 動(dòng)物體重(g) 瘤重(g) 抑制率ug/kg 方案始終 (x±DS) (％)N.S(陰性對(duì)照) 25ml/kgpo×718.9 25.42.96±0.79短鏈神經(jīng)毒素 75ip×719.0 25.12.36±0.8620.3(E.coli)150ip×719.1 24.82.0±0.92*32.4短鏈神經(jīng)毒素400ip×719.0 25.12.16±0.87*27.0(Pichia)800ip×719.1 21.11.50±0.32*49.3融合蛋白500ip×719.0 23.32.65±1.0810.4(E.coli) 1000ip×719.2 26.82.40±0.7718.9環(huán)磷酰胺 100mg/kg ip×219.1 22.40.51±0.26**82.7(陽(yáng)性對(duì)照)*P＜0.05**P＜0.01(與對(duì)照組比較)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)的和酵母表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素各高劑量組對(duì)小鼠肉瘤S180(實(shí)體型)有明顯的抑瘤作用。而大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白則無(wú)抑瘤作用。
(2)對(duì)小鼠肝癌HAC(實(shí)體型)的抑瘤作用取生長(zhǎng)良好的小鼠肝癌HAC腹水，用生理鹽水1∶4稀釋后，每只小鼠腋下接種0.2ml，隨機(jī)分組，設(shè)生理鹽水組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(100mg/kg ip×2)，Pichia表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素和E.coli表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素各二個(gè)給藥組次日起給予不同的藥物，連續(xù)腹腔給藥7天，第10天脫頸處死動(dòng)物，解剖取瘤塊，比較各劑量組瘤重之大小。
結(jié)果判定根據(jù)以下公式 結(jié)果見(jiàn)下表表3，短鏈神經(jīng)毒素各樣品對(duì)小鼠肝癌HAC(實(shí)體型)的抑制作用組 別 劑量 給藥 動(dòng)物體重(g) 瘤重(g) 抑制率ug/kg 方案 始終 (x±DS)(％)N.S(陰性對(duì)照) 25ml/kg ip×7 19.224.6 2.90±0.94短鏈神經(jīng)毒素(E.coli)75ip×7 19.025.4 2.62±0.73 9.65150ip×7 19.124.1 1.92±0.51*33.8短鏈神經(jīng)毒素(Pichia) 400ip×7 19.124.3 2.14±0.39 26.2800ip×7 19.121.6 1.52±0.33*47.7環(huán)磷酰胺(陽(yáng)性對(duì)照)100mg/k ip×2 19.222.5 0.16±0.04**94.5g(1.5.)*P＜0.05**P＜0.01(與對(duì)照組比較)。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)和酵母表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素的高劑量組對(duì)小鼠肝癌HAC(實(shí)體型)有明顯的抑瘤作用。
(3)對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用取生長(zhǎng)良好的小鼠Lewis肺癌瘤塊，用生理鹽水1∶5勻漿，每只小鼠腋下接種0.2ml，隨機(jī)分組，設(shè)生理鹽水組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(100mg/kg ip×2)，pichia表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素和E.coli表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素各二個(gè)給藥組次日起給予不同的藥物，連續(xù)灌藥7天，第10天脫頸處死動(dòng)物，解剖取瘤塊，比較各劑量組瘤重大小。結(jié)果判定根據(jù)以下公式 表4，短鏈神經(jīng)毒素各樣品對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用組 別 劑量給藥 動(dòng)物體重(g) 瘤重(g) 抑制率ug/kg 方案 始終 (x±DS) (％)N.S(陰性對(duì)照) 25ml/kg po×718.018.61.88±0.24短鏈神經(jīng)毒素 75 ip×718.018.01.62±0.27 14.8(E.coli)150 ip×718.119.81.38±0.36 27.6短鏈神經(jīng)毒素400 ip×718.218.41.66±0.35 11.7(Pichia)800 ip×718.218.21.34±0.39 28.7環(huán)磷酰胺 100mg/kg ip×218.118.20.40±0.15**78.7(陽(yáng)性對(duì)照) (1.5.)從上表可見(jiàn)，大腸桿菌表達(dá)和酵母表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素的高劑量組對(duì)小鼠Lewis肺癌均無(wú)明顯的抑瘤作用。
討論由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，短鏈神經(jīng)毒素各樣品對(duì)小鼠由醋酸引起的疼痛有明顯的抑制作用，對(duì)小鼠S180肉瘤、肝癌HAC的抑制作用，Pichia表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素有效劑量為800ug/kg，抑制率分別為49.3％和47.7％；E.coil表達(dá)的短鏈神經(jīng)毒素有效劑量為150ug/kg，抑制每分別為32.4％和33.8％。而兩者對(duì)小鼠Lewis肺癌均無(wú)明顯的抑制作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素及其制法和用途(iii)序列數(shù)目4(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度252bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGAAACTC TGTTGCTGAC CTTGCTGGTG GTGACAATCG TGTGCCTGGA 50CTTAGGATAC ACCCTGGAAT GTCACAACCA ACAATCATCG CAAACTCCAA 100CCACTACAGG TTGTTCAGGT GGGGAGACCA ATTGCTATAA AAAGCGTTGG 150CGTGATCACC GTGGATATAG AACCGAGAGG GGATGTGGTT GCCCTTCAGT 200GAAGAACGGC ATTGAAATTA ACTGTTGCAC AACAGACAGA TGCAACAATT 250AG 252(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPSVKNGI 50EINCCTTDRC NN62(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度381bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TTAGATGGAA ACTCTGTTGC TGACCTTGCT GGTGGTGACA ATCGTGTGCC TGGACTTAGG60ATACACCCTG GAATGTCACA ACCAACAATC ATCGCAAACT CCAACCACTA CAGGTTGTTC 120AGGTGGGGAG ACCAATTGCT ATAAAAAGCG TTGGCGTGAT CACCGTGGAT ATAGAACCGA 180GAGGGGATGT GGTTGCCCTA TAGTGAAGAA CGGCATTGAA AGTAACTGTT GCACAACAGA 240CAGATGCAAC AATTAGCTCT CCGAGTGGCT AAATTCCTTG AGTTTTGCTC TCATCCATCA 300TGGACCATCC TTGAAAATTT ATGCTTGTGG CCTTTAGCAC CAGATGGTCC ATCATTCCTT 360CTCCACTACT GTCTTTGACT T381(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度83個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO4METLLLTLLV VTIVCLDLGY TLECHNQQSS QTPTTTGCSG GETNCYKKRW50RDHRGYRTER GCGCPSVKNG IEINCCTTDR CNN 8權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白，其特征在于，它是具有SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，它是由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列編碼的。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQID NO1所示的序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是選自下組的一種宿主細(xì)胞(a)用權(quán)利要求5所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)用權(quán)利要求3所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL(DE3)Cai Qin SNT，保藏號(hào)為CCTCC NOM200001。
8.一種眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素,編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了將眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素用于治療多種疾病如癌癥的方法以及含有眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1337404SQ0011956
公開(kāi)日2002年2月27日 申請(qǐng)日期2000年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月3日
發(fā)明者蔡勤, 楊勝利, 龔毅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心