專利名稱：水稻蛋白OsSRM及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及功能基因組學領域，尤其涉及一種水稻蛋白as57 M及其 編碼基因與應用。
背景纟支術
土壤鹽漬化對農(nóng)業(yè)的威脅是一個全球性的問題。全世界共有10億公 項的鹽石咸地，約占世界陸地面積7.6%，我國鹽石威地近1億多公項，農(nóng)業(yè) 耕地因鹽漬化引起的減產(chǎn)、棄耕地就近333.5萬公項。近年來，我國設施 農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，特別是蔬菜和花卉大棚生產(chǎn)面積不斷擴大，據(jù)統(tǒng)計，2005 年全國蔬菜、花卉、瓜果等作物設施栽培面積達210萬公項。設施農(nóng)業(yè)的 發(fā)展為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結構調(diào)整和提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益發(fā)揮了重要作用，但是隨著 設施栽培時間延長，土壤次生鹽漬化的問題日益加劇，嚴重影響了設施栽 培作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，效益也隨之下降，從而影響設施農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。 解決設施栽培土壤鹽漬化一般采取以下兩種措施， 一是用石膏和硫磺等化 學方法或用排水和灌溉洗鹽等物理方法改良土壤；二是通過常規(guī)育種或生 物技術手段培育耐鹽作物品種，而前者投入成本高。通過培育適宜在鹽堿 地區(qū)栽培和設施栽培的農(nóng)作物抗鹽新品種將不僅能有效解決設施栽培土 壤鹽漬化問題，而且還能通過有效利用部分鹽漬化土地而大大地緩解我國 土地資源匱乏的問題。
近年來，隨著模式植物擬南芥和水稻基因組測序完成，植物基因組學 研究已轉(zhuǎn)入到功能基因組學。目前一些研究功能基因組學的新方法和實驗 技術體系如cDNA微陣列、基因芯片、基因表達系統(tǒng)分析(serial analysis of gene expression, SAGE )、基因敲除(gene knockout)和RNAi分析均能有 效分析大量基因的表達和功能模式，并在耐鹽性相關功能基因資源發(fā)掘上 取得了一定進展。 一些與滲透調(diào)節(jié)相關基因已從不同植物種類中被成功克 隆并轉(zhuǎn)化應用，如脯氨酸合成相關基因P5CS ( Kishor PBK， Hong Z, Miao G H, Hu CAA, Verma DPS. Overexpression of P5CS increases prolineproduction and confers osmotolemnce in transgenic plants. P/朋/尸/r戶V /, 1995， 108: 1387-1394)和甜菜堿脫氬酶BADH基因(肖崗，張耕扭，劉鳳 華等，山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因研究，科學通報，1995， 40(8): 741-745 )。
植物體內(nèi)Na+離子平衡是植物自身耐鹽調(diào)節(jié)的重要機制。朱健康研究 小組發(fā)現(xiàn)擬南芥SOS基因系列的調(diào)控信號是植物自身調(diào)節(jié)Na+離子平衡的 重要途徑之一。2005年，林鴻宣研究小組與美國欒升教授合作，成功克隆 了水稻耐鹽相關的數(shù)量性狀基因SKC1。該基因能控制水稻植抹地上部鈉 離子和鉀離子的含量，維持鈉和鉀離子平衡，使過量鈉離子不在莖葉等部 位積累，并使鈉離子回流到根部，減輕鈉離子毒害，同時增加營養(yǎng)元素鉀 離子，從而增加水稻耐鹽性。
眾所周知，水稻的基因圖譜已經(jīng)繪制完成，也就是說大部分水稻基因 序列是公開的，但是具體涉及到某個基因的功能是未知的，特別是某個基 因編碼的蛋白以及該蛋白的對水稻產(chǎn)生的功能影響也是未知的。直接鑒定 某個基因的功能是非常困難的，現(xiàn)有手段往往是先分離出植物蛋白，檢測
該蛋白的氨基酸序列，然后再通過氨基酸序列來比對公用數(shù)據(jù)庫中的某個 基因序列，從而確定該基因的功能以及該基因的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻蛋白，名稱為(9^Si M，它是一個受鹽誘導表 達方式的蛋白，有助于提高水稻耐高鹽和耐高溫性能。
一種水稻蛋白，具有序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列。
該蛋白能夠上調(diào)超氧物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶等 抗氧化酶活性，清除因高鹽或低溫脅迫產(chǎn)生的過多的活性氧(超氧離子或 過氧化氫)，維持細胞體內(nèi)活性氧水平在正常范圍內(nèi)，保護幼苗、植林免 遭因高鹽或高溫引發(fā)的氧化損傷，提高植物抗逆能力。
根據(jù)上述水稻蛋白Os57 M的氨基酸序列，通過NCBI和TIGER數(shù)據(jù) 庫搜索，比對到一個編碼7JC稻質(zhì)膜蛋白的基因Os5^M(^y加《加V" Salt Responsiveness Membrane protein )，基因Os5^M的基因號為Os07g0608300 (ID 4343867),該基因的開放閱讀框(ORF )為963 bp，具有序列表中 SEQIDN0.2所述的核苷酸序列；mRNA長度為1613 bp，具有序列表中SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。
上述基因可以應用于提高植物耐高鹽和耐高溫的性能，具體操作如
下
(1) 將上述基因連接Superl300載體中，當然也可以選擇其它載體， 如pCAMBIA1300等；
(2) 將上述重組載體通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化到目標植物；
(3 )以潮霉素B為抗性標記，結合高鹽(200 mM NaCl以上)和高 溫(46。C)處理為選擇壓進行篩選，得到具有耐高鹽和耐高溫性能的植物。 本發(fā)明水稻蛋白可以提高水稻耐高鹽和耐高溫性能，將編碼該蛋白的 基因?qū)肫渌参锂斨?，如草莓、辣椒、茄子?一串紅、非洲菊等，也有 可能提高這些植物的耐高鹽和耐高溫性能。通過上述手段， 一方面可以增 加作物在鹽堿地上的產(chǎn)量，提高我國濱海地區(qū)的鹽堿地的利用；另一方面 可以克服設施條件下蔬菜、花卉等植物因土壤返鹽和夏季高溫引起的生育 障礙，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，增加農(nóng)民收入。
具體實施方式
基因的獲得
(1)以雜交水稻耐鹽組合汕優(yōu)10號和鹽敏感組合兩優(yōu)培九為材料， 將它們的種子播在含100 mM NaCl溶液浸濕濾紙培養(yǎng)亞中，置于30。C培 養(yǎng)箱中發(fā)芽，每天更換鹽溶液，以保持鹽濃度基本一致。待幼苗生長至IO d，分別收集汕優(yōu)10號和兩優(yōu)培九幼苗的葉片。
(2 )用冷丙酮/三氯乙酸沉淀法(Salekdeh G H, Siopongco J， Wade L J, Ghareyazie B， Bennett J. A proteomic approach to analyzing drought- and salt-responsiveness in rice. F/eW Oop 2002， 76 ( 2國3 ) : 199-219 )快速 提取葉總蛋白，具體操作如下
1) 水稻葉片用液氮研磨成細粉，分裝入1.5 ml離心管中，加入1 ml 蛋白提取液I (含10°/。三氯乙酸和0.07。/。p-巰基乙醇的丙酮溶液)在-20。C 沉淀粗蛋白lh，在4。C、 13000 rpm下離心20min，取沉淀，棄上清；
2) 然后往沉淀中加入1 ml蛋白提取液II (含0.07。/。P-巰基乙醇的丙 酮溶液)，在-20。C懸浮粗蛋白丸1 h,在4。C、 13000 rpm下離心20min，取沉淀，棄上清，再重復用蛋白提取液n,在相同條件下懸浮提取3次后，
真空抽干沉淀；
3 )用裂解液(含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% Chaps ( Ameresco 公司，美國)、50 mmol / L DTT ( Promega公司，美國)和0.5% pH3-10 的40%兩性電解質(zhì))溶解沉淀，裂解液用量為25pl裂解液/mg沉淀，然后 在室溫下放置1 h，裂解期間不斷渦旋5-6次。
(2 )才艮才居Bradford法(Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976， 72:248-54)用考馬斯亮蘭G-250 (Sigma公司)測定上述裂解液中的蛋白含量，上述裂解液中的蛋白用雙 向凝膠電泳(第一向釆用17 cm pH7-10的IPGs干膠條(Bio-Rad公司) 聚焦，第二向采用變性/SDS-2D-PAGE分離)分離。
第一向等電聚焦分四步進行，第一步，電壓250V15min;第二步， 電壓10000 V 5 h;第三步，電壓10000 V， 60000 Vh;第四步，電壓500 V直到結束。
在第一向等電聚焦向第二向轉(zhuǎn)換時，需要平衡膠條，分兩步進行，第 一步，在平衡液I (含6.0mol/L尿素、2% SDS (Promega公司，美國)、 0.375mol /L pH 8.8 Tris畫HCl (Promega公司，美國)、20%甘油和130 mmol/L DTT (Promega 7>司，美國))中平4紆10 min; 第二步，在平衡液 II (含6.0 mol/L尿素、2% SDS ( P腿ega公司，美國)、0.375 mol /L pH 8.8 Tris-HCl (Promega公司，美國)、20%甘油和135 mmol /L碘乙酰胺)中 平衡10min,然后轉(zhuǎn)移到第二向SDS-2D-PAGE膠，跑膠采用恒流，每塊 膠的電流24 mA，運行5-6 h。
用500ml固定液(40%曱醇和10%乙酸)固定30min，然后用500 ml 銀氨染色液(含有3.6°/。氫氧化鈉10.5 ml、 20%硝酸銀9ml和5 ml氨水) 染色32-33 min,用雙蒸水沖洗4次，然后用500 ml顯色液(含有1%檸檬 酸2.5ml和曱醛250pl)顯色5-12min，最后用500 ml 5%醋酸終止反應5 min。
掃描后用PDQUEST (Bio-Rad公司)軟件分析膠圖匹配情況，結果 發(fā)現(xiàn)在汕優(yōu)10號幼苗葉片中一個高表達蛋白點，估測其等電點和分子量分別為pI7.0和35 KD左右。
(3 )在膠上切下該高表達蛋白點，加入8pl 10 ng4d胰蛋白酶(Trypsin, Roche,美國)進行膠內(nèi)消化，然后置于4°C冰箱放置40 min使膠片完全 吸收酶液，再補加10 pi 25 mM石灰酸氫銨緩沖液(pH 8.0),于37。C溫育 12 h,膠內(nèi)蛋白質(zhì)被酶解成肽段混合物。
(4)在上述肽賴:混合物中加入30-50iLil5o/oTFA (Merk^^司，德國) 于4(TC提取上述酶切肽萃殳1小時一次，再用相同體積的50% CAN和 2.5%TFA (Merk公司，德國)溶液于3(TC提取1小時一次，最后用25 jil CAN (Fischer公司，美國)超聲提取一次，合并3次提取液。真空干燥， 然后用4 0.5%三氟乙酸溶解，將0.6|il溶解物用基質(zhì)輔助激光解吸離子 化飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS )分析，獲得肽質(zhì)量指紋(Peptide Mass Fingerprint, PMF)圖譜，查詢Mascot數(shù)據(jù)庫，以一定分值(65 )顯著(比 對分高于60 )比對到水稻Os5^M蛋白，匹配序列占總氨基iM"列37 °/o。 根據(jù)已有的水稻as5/ M的氨基酸序列，通過NCBI和TIGER數(shù)據(jù)庫 搜索，比對到編碼水稻鹽響應膜蛋白基因，基因號為Os07g0608300 (ID 4343867)。該基因的開放閱讀框(ORF )為963 bp， mRNA長度為1613 bp。
基因克隆與轉(zhuǎn)化
以汕優(yōu)10號幼苗(播后10天)總mRNA為模板，利用RT-PCR方法 擴增到as57^M基因的編碼序列。
具體操作如下首先，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，所用反轉(zhuǎn)錄 試劑盒為TaKaRa公司的High Fidelity PrimerScript RT-PCR Kit,反應體 系20 jxl，依次加入1 (xl 20M隨機引物(Random 6 mers )、 1 pi 10 mM dNTP、 2|il總RNA和DEPC水至10 pl，在65。C變性5分鐘，迅速在冰上冷卻2 分鐘，稍;微離心，然后依次加入4 pi 5x PrimerScript RT buffer、 0.5^1 RNase inhibitor 、 0.5^1 PrimerScript RTase和5|il DEPC水。輕微混合均勻，30°C 反應10分鐘，42。C反應30分鐘，95°C 5分鐘使酶失活。為了去掉與cDNA 互補的RNA鏈，加入1 |il RNase H在37。C溫育20min， -20。C保存。然后 以第一鏈cDNA為摸板擴增目的基因C^SAM，所用擴增配對引物
OsSRM畫F ， 5 ,國TCTAGAATGGTGGGCTGGCTGAAGG畫3',OsSRM-R， 5 ，-GGTACCTCACTCTTCAGCTTCATCATCA-3 ，， PCR反應體系為50 依次加入2x PCR buffer 25 pl、 2.5 mM dNTPs 4^1、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2pl、 20pM正向引物(OsSRM-F) 1 pl 、 20pM反向 引物(OsSRM-R) l|il、 2.5U/|ilTagDNA聚合酶0.5^1,最后加水至50^1。 PCR反應條件預變性94。C3min,變性98。Cl0s，退火55°C 15s，延伸 72。Clmin, 30個循環(huán)，最后延伸72°C 10 min, 4。C保存。
擴增后將as57 M基因裝入pMD19-T載體中pMD19-T載體由 TakaRa公司生產(chǎn)。將回收純化的adWM基因的DNA與pMD19-T載體 進行連接反應，連接體系10^1，各組分分別為0.5jilpMD19-T載體、4.5^1 純化的Os57 M基因的DNA、 5^1 Solution I。在14。C-16。C下連接8-12小 時，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中。將Os^S7 M基 因裝入pMD19-T載體后經(jīng)測序正確，用TakaRa 7>司生產(chǎn)的EcoRI和 HindIII酶切，操作如下酶切體系40 pl，包括4 pl 10xbuffer、 8 pl已插 入Os5^M基因的pMD19-T載體、lpl Xbal、 1 (il Kpnl和26jil水，在37°C 水浴中溫育6h。
用北京博大泰克生物技術公司生產(chǎn)的Glassmilkkit回收基因片段，操 作如下上述混合DNA經(jīng)凝膠電泳以后，從凝膠上切下所需DNA片段， 放在1.5 ml的Eppendorf管中。加入3倍體積的溶膠液，室溫下放置5 min， 期間輕搖Eppendorf管幾次使膠完全溶化。加入10|^1玻璃奶，顛倒混勻， 水浴下放置10 min。每隔2-3 min混勻1次，12000 rpm離心30 s,吸棄上 清。加入250jxl漂洗液，用移液器吹打漂洗液，輕柔地將玻璃奶懸浮混勻， 12000 rpm離心30 s,吸棄上清。重復漂洗1次。用4全頭將剩余的漂洗液 吸干凈。然后，放置于37。C溫箱干燥15-20 min。加入20 pl的無菌蒸餾水， 混勻，60。C水浴5min, 12000 rpm離心1 min,回收上清液，即為純化的 基因Os朋M。
將回收的基因片段連入Superl300載體中，操作如下連接體系10 pl， 包括2 pl Superl300載體、6 pl純化的OWi M基因的DNA、 1 pl 10xT4 連接酶buffer和1 pl T4連接酶，在4-l(TC下連接12 h，然后將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒進行鑒定。
基因片段連入Superl300載體后再轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌中，操作如下取200^d農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，加入5-10iul構建好的質(zhì)粒DNA， 30。C水浴 30 min,液氮中速凍1 min， 37。C水浴5 min，然后加入1 ml YEB培養(yǎng)基 (1升YEB培養(yǎng)基含1 g酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗 糖和0.5 g MgS04.7H20, pH 7.0 ), 28。C恢復培養(yǎng)4 h; 10000 g離心30 s, 棄上清，加入O.lmlYEB培養(yǎng)基重新懸浮細胞，涂布于含有100嗎/ml卡 那霉素和125嗎/ml利福平的YEB平板(1升YEB培養(yǎng)基含1 g酵母提取 物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗并唐、0.5gMgSCV7H20和12g瓊脂， pH7.0)上，28。C培養(yǎng)約48h。
經(jīng)鑒定正確后(挑取陽性克隆作為模板，用菌落PCR方法進行鑒定)， 通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化模式植物水稻，操作如下接種含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿 菌菌落于10 ml YEB培養(yǎng)基(含0.1。/。酵母提取物、0.5%牛肉浸膏、0.5% 蛋白胨、0.5%蔗糖、0.05%MgSO4'7H2O、 1.2%瓊脂、100 |ug/ml卡那霉素 和125嗎/ml利福平)中28°C、 200 rpm震蕩培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)化前一天按1:50 接種于200 ml含相同抗生素的YEB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)至OD600為 0.6-0.8。取菌液，按1°/。~2%的比例，轉(zhuǎn)入新配制的無抗生素的YEB液 體培養(yǎng)基中，6小時后，菌液OD600為0.2-0.5時即可用于轉(zhuǎn)化。
取粳稻品種愛知旭((9^y加^"va L cv Aichi Asahi)幼胚，用70%酒精浸 泡lmin，然后用0.1%升汞溶液滅菌30min,再用無菌水沖洗3次，置無 菌濾紙上吸干，接種于誘導培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基外加2 mg丄"2， 4-D)上 誘導愈傷組織11-13 d后繼代，繼代后4 d用于共培養(yǎng)。愈傷組織在含有 100 mol丄"乙酰丁香酮和含目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 20 min，用濾紙吸去多余的菌液后，轉(zhuǎn)到含乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基上 26T:暗培養(yǎng)2 d, 經(jīng)共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基外 加2 mg丄"2, 4-D 、 50 mg丄"潮霉素B和頭300 mg丄"頭孢瘞將)上。 10 d后挑選成活的愈傷組織進行復篩，抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(NB 培養(yǎng)基外加2 mg丄"2， 4國D 、 3 mg丄"、6國BA、 0.5 mg丄"NAA、 4 mg丄"KT、 50 mg丄"潮霉素B和頭300 mg丄"頭孢遂將)上誘導出苗。培養(yǎng)溫度26°C, 每天光照15 h?？剐灾仓贽D(zhuǎn)到含1/2 N6大量元素(1415 mg丄"KN03、 231.5 mg丄"NH4S04、 83 mg丄"CaCl2.2H20、 92.5 mg丄"MgSO4'7H20、 200 mg.L/1 KH2P04、 200 mg丄"FeSO4.7H20和2.2 mg丄"MnS04.4H20 )的無激素培養(yǎng)
9基上使其生根。當試管苗長到約8cm高并有發(fā)達的根系時，即可移栽入 土。單抹收獲T1代種子。繁種并鑒定至T3代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因93個 林系。
通過農(nóng)桿菌介導浸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，操作如下接種含有目 的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落于10mlYEB培養(yǎng)基(含0.1。/。酵母提取物、0.5% 牛肉浸膏、0.5%蛋白胨、0.5%蔗糖、0.05%MgSO4.7H2O、 1.2%瓊脂、100 Hg/ml卡那霉素和125 jig/ml利福平)中28°C、 200 rpm震蕩培養(yǎng)過夜， 轉(zhuǎn)化前一天按l:50接種于200 ml含相同抗生素的YEB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng) 至OD600為1.2-1.6,約6h， 5000 g離心15 min集菌，重懸于滲透緩沖 液，使OD600為0.8, 200 ml重懸液可使用3次。轉(zhuǎn)化所用浸泡液含有 0.5xMS大量元素、0.5xMS微量元素、0.5mg/LVB5、5。/。蔗糖、44nM6-BA (Sigma公司，美國)和0.03% Silwet L-77 (LEHLE SEEDS公司，美國)。 將200 ml含目的農(nóng)桿菌的滲透轉(zhuǎn)化液置于一容器中，翻轉(zhuǎn)種有擬南芥的 花盆，使植抹浸入含有待轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的滲透緩沖液中，浸5分鐘，緩慢取 出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑塑料布避光24小時，第二天取下塑料布， 直立放置花盆。
制備MS篩選平板(MS培養(yǎng)基外加80 g/ml潮霉素和50 g/ml氨千青 霉素)，轉(zhuǎn)化收獲的T1代種子經(jīng)消毒后播種于篩選平板，每15cm的平板 上可以篩選lOOing左右的擬南芥種子。4。C春化3天，平放在生長箱中培 養(yǎng)(22。C恒溫，24h光照)，7-10天后挑選在篩選培養(yǎng)基上根系和地上部 生長正常的陽性植抹，移入正常MS培養(yǎng)基緩苗3-5天后移植入土壤，單 抹收獲T2代種子。繁種并鑒定至T3代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因65個抹系。 基因功能鑒定
(1 )耐鹽性能鑒定 取T3代純合轉(zhuǎn)基因抹系和野生型(粳稻品種愛知旭)種子，均勻放 在兩層用蒸餾水潤濕的發(fā)芽紙上，在25。C光照條件下培養(yǎng)10d，觀察幼苗 生長情況。然后將轉(zhuǎn)基因抹系和野生型的水稻幼苗分別移入含200 mM NaCl或正常清水的發(fā)芽盒內(nèi)，置于相同光溫條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，觀察轉(zhuǎn)基因抹系與野生型幼苗在高鹽脅迫下的表型。結果發(fā)現(xiàn)在200 mMNaCl處理下，野生型水稻幼苗葉片出現(xiàn)白化表型，嚴重時幼苗白化
10死亡，而轉(zhuǎn)(9^S層基因林系葉片仍保持綠色。葉片最大光化學效率測定 (Fv/Fm)結果表明，在200mMNaCl下，野生型幼苗地上部最大光化學 效率顯著降低，而轉(zhuǎn)OsSi M基因抹系幼苗地上部最大光化學效率未出現(xiàn) 明顯變化，說明asS/ M基因在水稻中超量表達可以提高水稻幼苗耐鹽性。 T3代純合轉(zhuǎn)基因抹系和野生型(ecotype Columbia)擬南芥種子用1% 次氯酸鈉消毒，在4。C水箱中春化3天，然后置于溫度22。C、濕度50%、 連續(xù)24h光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7d后，觀察幼苗生長情況。待幼苗 子葉完全展開后，將轉(zhuǎn)基因抹系和野生型幼苗移入含200 mM NaCl和正常 的MS固體培養(yǎng)基(含lx大量元素、lx微量元素、lx鐵鹽、3%蔗糖和0.8% 瓊脂)上，然后置于相同光溫條件(22°C、濕度50%、連續(xù)24 h光照) 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12-15d后，觀察轉(zhuǎn)基因抹系與野生型幼苗在高鹽 脅迫下的表型。結果發(fā)現(xiàn)在200mMNaCl下，野生型幼苗全部白化死亡， 轉(zhuǎn)Oy朋M基因抹系幼苗葉片仍保持綠色，說明Os57 M基因超量表達可以 緩解擬南芥鹽害。
(2)耐高溫性能鑒定 取T3代純合轉(zhuǎn)基因抹系和野生型(粳稻品種愛知旭)種子，均勻放 在兩層用蒸餾水潤濕的發(fā)芽紙上，在25。C光照條件下培養(yǎng)10d，觀察幼苗 生長情況。然后將轉(zhuǎn)基因抹系和野生型的水稻幼苗移入46°C高溫培養(yǎng)箱， 處理12h后，再放回到25。C光照條件下培養(yǎng)，4-5 d后野生型幼苗葉片出 現(xiàn)黃化，嚴重時幼苗葉片局部開始白化死亡，而轉(zhuǎn)a^AM基因林系葉片 仍保持正常綠色。葉片最大光化學效率測定(Fv/Fm)結果表明，野生型 幼苗地上部最大光化學效率顯著降低，而轉(zhuǎn)OWi M基因抹系幼苗地上部 最大光化學效率未出現(xiàn)明顯變化，說明a^i M基因在水稻中超量表達可
以提高水稻幼苗耐高溫性能。
取T3代純合轉(zhuǎn)基因抹系和野生型擬南芥種子，播在塑料土盆中，在 22。C溫室內(nèi)培養(yǎng)，取生長到4周的轉(zhuǎn)基因抹系和野生型幼苗，在45。C低溫 培養(yǎng)箱中處理8h，再放回到22。C溫室內(nèi)培養(yǎng)，3-4d后野生型幼苗葉片出 現(xiàn)失水巻曲，嚴重時幼苗葉片開始白化，而轉(zhuǎn)a^疆基因抹系葉片仍保 持正常綠色說明as57 M基因在擬南芥中超量表達可以提高擬南芥幼苗耐 高溫性能。SEQUENCE LISTING
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<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 320
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 1
Met Val Gly Tip Leu Lys Ala Leu Cys Tyr Gly Ala Gly Gly Met Ala 15 10 15
Val Val Gly Leu Ala Ala Leu Val Ala Leu Gin Glu Arg Leu Val Tyr
20 25 30
Val Pro Val Leu Pro Gly lie Ala Arg Ala Tyr Pro He Thr Pro Asp
35 40 45
Arg Leu Arg Leu lie Tyr Glu Asp Val Trp Leu Arg Ala Ala Asp Gly
50 55 60
Val Arg Leu His Ser Trp Phe He Arg His Ser Pro Thr Cys Arg Gly 65 70 75 80
Pro Thr lie Leu Phe Phe Gin Glu Asn Ala Gly Asn lie Ala His Arg85 90 95
Leu Asp Phe Val Arg Leu Met Met Gin Arg Leu Gin Cys Asn Val Phe
100 105 110
Met Leu Ser Tyr Arg Gly Tyr Gly Glu Ser Asp Gly Tyr Pro Ser Gin
115 120 125
Lys Gly He He Asn Asp Ala Gin Ala Ala Leu Asp His Leu Val Gin
130 135 140
Arg Lys Asp He Asp Thr Ser Arg He Val Val Phe Gly Arg Ser Leu 145 150 155 160
Gly Gly Ala Val Gly Ala Val Leu Ala Lys Asn Asn Pro Gly Lys Val
165 170 175
Ser Ala Leu lie Leu Glu Asn Thr Phe Thr Ser lie Leu Asp Met Ala
180 185 190
Gly lie Met Leu Pro Phe Leu Arg Trp Phe lie Gly Gly Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Pro Lys Leu Leu Asn Cys Val Val Arg Ser Pro Trp Ser Thr
210 215 220
Leu Asp lie lie Ala Glu Val Lys Gin Pro He He Phe Leu Ser Gly 225 230 235 240
Leu Gin Asp Glu Leu Val Pro Pro Ser His Met Arg Leu Leu Tyr Glu
245 250 255
Lys Ala Phe Glu His Asn Lys Asn Cys Arg Phe Val Asp Phe Pro Asn
260 265 270
Gly Met His Met Asp Thr Trp Asn Ser Gly Gly Asp Arg Tyr Trp Arg
275 280 285
Thr lie Gin Leu Phe Leu Asp Gin Tyr Ala Pro Glu Val Gin Ser Cys
290 295 300
Asn Thr Ser Cys Lys Ser Glu lie Ala Asn Asp Asp Glu Ala Glu Glu 305 310 315 320
<210> 2<211> 963 <212> DNA <213> 水稻
<400> 2
atggtgggct ggctgaaggc gctgtgctac ggcgcggggg gcatggcggt ggtggggctc 60
gcggcgctcg tggcgctgca ggagcgcctc gtctacgtgc ccgtgctccc ggggatcgcg 120
cgggcgtacc ccatcacccc cgaccgcctc cgcctcatct acgaggacgt ctggctccgc 180
gccgccgacg gcgtccgcct ccactcctgg ttcatccgcc actcccccac ctgccgaggt 240
ccaactattc tgttettcca agaaaatgct ggcaatattg cacatcgttt ggactttgtt 300
cgactaatga tgcaacgact acagtgcaat gtatttatgc tttcttacag agggtatggt 360
gagagtgatg gttatccttc tcagaagggc atcataaatg atgcacaggc tgcacttgat 420
catctagttc agaggaagga tattgacaca tccaggatag ttgtttttgg gagatcgtta 480
ggaggtgctg ttggagcagt gcttgcgaaa aacaatcctg gcaaggtgtc agctctaata 540
ctggaaaaca cctttacatc tatattggat atggctggta tcatgctacc cttcttacga 600
tggttcatag gtggcagttc ttcaaaaggt ccaaaacttc tgaactgtgt tgttcgctcc 660
ccatggagta cacttgatat cattgcagag gtcaaacaac ccattatttt cctttctgga 720
ttacaagatg aattagttcc cccttcacac atgaggttac tatatgaaaa agcttttgag 780
cataataaga attgtagatt tgttgatttt cccaatggca tgcatatgga tacctggaat 840
tctggaggag accgttactg gaggacaatc caactgtttc tggaccaata tgctccagaa 900
gtacagagtt gtaataccag ctgcaaaagt gaaattgcta atgatgatga agctgaagag 960
tga 963
<210> 3
<211> 1613
<212> RNA <213>水稻
<400> 3<formula>formula see original document page 15</formula>
權利要求
1、一種水稻蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。
2、 一種編碼權利要求1所述的水稻蛋白的基因，具有序列表中SEQ ID N0.2所述的核苦酸序列。
3、 編碼權利要求1所述的水稻蛋白的基因在提高植物高耐鹽和耐高 溫性能中的應用。
4、 根據(jù)權利要求3所述的應用，包括以下步驟(1) 將編碼所述的水稻蛋白的基因連接到載體中，得到重組載體；(2) 將重組載體通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化到植物中；(3) 篩選得到具有耐高鹽和耐高溫性能的植抹。
5、 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述的載體為Superl300 載體。
6、 根據(jù)權利要求3或4所述的應用，其特征在于所述的植物為水 稻、草莓、辣椒、茄子、 一串紅和非洲菊。
全文摘要
本發(fā)明提供公開了一種水稻耐鹽蛋白OsSRM，具有序列表中SEQ IDNO.1所述的氨基酸序列。本發(fā)明蛋白在水稻幼苗中得到過量表達，可以提高水稻幼苗耐高鹽和高溫能力。若將編碼該蛋白的基因轉(zhuǎn)化擬南芥、辣椒、茄子、草莓、一串紅、非洲菊等蔬菜、花卉等植物，有可能提高其耐高鹽和高溫性能，有助于增加水稻或露地蔬菜、花卉在鹽堿地上的產(chǎn)量，提高我國濱海地區(qū)的鹽堿地的利用；克服設施條件下因土壤返鹽或高溫引起的連作障礙，提高蔬菜、花卉等植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，促進農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收。
文檔編號C07K14/415GK101456906SQ20081016381
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者何俊平, 雅 忻, 來文國, 王世恒, 王淑珍, 白宇杰, 童建新, 鄭桂珍, 阮松林, 馬華升 申請人:杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院