專利名稱：一種低抗原性重組葡激酶突變體及制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬突變或遺傳工程領域。
背景技術：
心肌梗塞對人類健康有較大的危害，且死亡率很高，溶栓治療是臨床急救和常規(guī)治療的主要手段之一。研究表明，在眾多的溶栓藥物中，葡激酶(Staphylokinase，SAK)是目前在溶栓效果和特異性上唯一可與tPA媲美的新型溶栓藥物。天然的SAK是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種單鏈蛋白，由136個氨基酸組成，分子量15.5kDa。20世紀90年代，SAK的纖維蛋白選擇性被發(fā)現(xiàn)，因此引起人們的廣泛關注。國內已有單位獲得新藥證書，而且由于利用原核細胞發(fā)酵和純化生產(chǎn)，其市售價格會相對較低，因此在臨床應用中具有一定的競爭優(yōu)勢。但它與許多具有特殊功能的外源蛋白一樣，SAK在臨床應用中也導致一些免疫反應，尤其是重復使用時其誘導的中和抗體對療效有很大的影響。同時，SAK的免疫原性限制了日常的預防或恢復治療的應用。
因此如何保障rSAK在同類藥品中的優(yōu)勢地位、如何更好地應用于臨床治療、如何擴大rSAK作為溶栓藥物的應用范圍是制藥企業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是利用生物信息學和基因缺失突變技術對SAK分子的抗原分布特性進行了分析，利用缺失和氨基酸替換方法對野生型SAK分子進行定向修飾，最大限度地屏蔽SAK分子中的T、B淋巴細胞表位，同時去除ASK N端的6個氨基酸，構建分子量相對減小，抗原性降低的SAK突變體。利用基因體外重組技術構建高效表達SAK突變體的工程菌，研究進行SAK分子修飾后，可溶性表達的比例有所降低。利用離子交換和分子篩等層析技術純化表達的重組蛋白，制備的重組蛋白純度可達95％以上。
本發(fā)明構建的突變體(SAK-M)序列如下GGA AAA TAT AGA AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGCGly Lys Tyr Arg Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr GlyCCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT GCA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CGT TATPro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp GlyAlaGly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr
GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCAVal Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp AlaTTA GAT GCG ACA GCA TAT CAA GAG TTT AGA GTA GTT GCA TTA GCG CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu Asp Ala Thr Ala TyrGlnGlu Phe Arg Val ValAlaLeuAlaPro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTCTyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val ValCCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA GCG GTT GTT ATA GAA CGT GCGPro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile ThrAlaVal Val Ile GluArgAla注35位賴氨酸lys AAA變?yōu)楸彼酇la GCA；74位賴氨酸lys AAA變?yōu)楣劝滨０盙ln CAA；80位谷氨酸Glu GAA變?yōu)楸彼酇la GCA；82位天冬氨酸Asp GAT變?yōu)楸彼酇la GCG；130位賴氨酸Lys AAG變?yōu)楸彼酇la GCG；135位賴氨酸Lys AAG變?yōu)榫彼酇rg CGT；136位賴氨酸Lys AAA變?yōu)楸彼酇la GCG。
本發(fā)明SAK突變體的制備方法1.實驗材料和設備1.1菌株金黃色葡萄球菌(Staphlococcus aureus 1.1476)購自國家菌種保藏中心，E.coliDH5，BL21等為軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基因工程研究室保存菌種。
1.2質粒T載體購自美國Promega公司，pBV220表達載體大小為3.66kb，是一種溫敏型高效表達載體，含有PRPL串聯(lián)的啟動子，cIts857溫敏調控基因與PRPL的存在，使該載體可以轉化任何受體菌，SD序列的后面緊跟多個克隆位點，為基因的操作提供了便利，為軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基因工程研究室保存。pT-SAK-M為軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基因工程研究室保存。
1.3酶與生化試劑BamH I、EcoR I、Taq酶和T4 DNA連接酶、小提、大提質粒試劑盒、DNA及蛋白分子量標準等購自美國Promega公司。
1.4實驗器材PCR儀為美國PE公司產(chǎn)品。電泳儀、層析儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品。超凈工作臺、搖床等為國產(chǎn)。
2、制備過程2.1SAK突變體的構建和鑒定從Staphlococcus aureus 1.1476株菌體中提取染色體DNA，設施PCR引物，首先獲得其N端缺失6個氨基酸SAK突變體基因，然后以它為模板，通過PCR方法將SAK分子中的一些B淋巴細胞表位區(qū)段進行修飾，主要包括第35、74、80、82、130、135和136位氨基酸。通過合成相關的引物序列定點改變這些位點的核苷酸序列，然后通過PCR和退火反應獲得預期的突變體基因(圖1)。利用雙酶切和PCR對構建的突變體進行鑒定(圖2)。然后進行核酸序列分析(圖3)2.2SAK突變體表達載體的構建和鑒定利用EcoRI和BamHI雙酶切表達載體pBV220和利用PCR拼接的SAK突變體片段，利用T4DNA連接酶連接，轉化宿主細菌，利用酶切鑒定篩選陽性克隆。構建表達載體pBV220-SAK-M2.3重組SAK突變體蛋白的表達將含有重組質粒的克隆菌株接種于含氨芐青霉素(Ap+)的LB培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜，次日再以5％的濃度接種于LB培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)2小時至OD600為0.4-0.6之間，將培養(yǎng)物迅速移至42℃水浴中，震蕩培養(yǎng)，誘導表達4小時，同時以含有空載體的BL21菌株作為對照，誘導結束后，以12000rpm離心20秒，收取誘導表達的菌體，加入80μl TE緩沖液懸浮菌體，再加入等體積的2X載樣緩沖液混勻，100℃煮沸處理5分鐘，然后進行SDS-PAGE檢測2.4重組SAK突變體蛋白的純化將誘導表達菌以PB緩沖液(50mM PB pH7.6，2mM EDTA)洗滌菌體兩次，再以2-5倍體積的PBE緩沖液懸浮，置于冰浴中，利用超聲破碎儀破碎細菌，破碎結束后，將菌體破碎液倒于離心管中，在4℃條件下12000rpm離心20分鐘，取上清備用。利用離子交換負吸附的原理，將破碎后的上清穿過陰離子交換柱(Q Sephrose FF)，使rSAK衍生體蛋白穿過，菌體蛋白吸附于柱上，收集穿過液。經(jīng)過純化后，去掉一部分雜蛋白，使rSAK的純度得到提高，從而達到初步純化的作用。
將經(jīng)過陰離子交換純化的蛋白溶液，調pH為6.2，然后經(jīng)過陽離子交換(SP SephroseFF)的純化，使rSAK衍生體蛋白的純度進一步提高。然后，選擇Amersham-Phamacia公司生產(chǎn)的Sephacryl S-200為凝膠過濾介質，將陽離子交換洗脫液上樣，收集洗脫峰。利用SDS-PAGE電泳進行純度分析(圖)，重組蛋白的純度＞95％。
本發(fā)明的活性測定結果顯示，突變體的溶栓活性良好，與野生型相當。利用ELISA方法對其抗原性進行了初步的檢測，結果表明，我們構建的SAK突變體具有較低的抗原活性。這一研究結果提示，該突變體可能成為新的溶栓候選藥物，為SAK在常規(guī)治療中的重復應用提供了可能性，同時也為SAK在臨床上的使用提供了更好的安全保障。其研制成功可使rSAK由單一的急救性藥物轉變成一種兼急救、恢復性和預防治療等多用途溶栓藥物，使其應用范圍大大拓寬，需求量呈數(shù)十倍的提高，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。


圖1為SAK突變體基因的PCR擴增結果圖，圖中1.子量標準物，2.SAK突變體基因；圖2為pT-SAK-M的酶切鑒定結果圖，圖中1.子量標準物，2.空載體對照3.pT-SAK-M/雙酶切；圖3為構建的SAK衍生體的核酸序列分析圖譜；圖4為重組表達載體pBV220-SAK-M的鑒定圖譜，圖中1.子量標準物，2.空載體對照3.pBV220-SAK-M/雙酶切4.陰性克?。粓D5為重組表達載體外源基因的表達結果圖，圖中1.蛋白分子量標準2.空載體對照3.pBV220-SAK-M/BL21；圖6為重組SAK衍生體蛋白的純化結果圖，圖中1.蛋白分子量標準物2、3純化的rSAK衍生體蛋白；圖7為純化產(chǎn)物的活性測定圖A2、A3、A4測試樣品，B1-5、C1-5參照品的溶圈情況，D2、D3、D4測試樣品A2、A3、A4的重復上樣。
具體實施例方式
重組SAK突變體的活性測定稱取125mg瓊脂糖(Biorad電泳級)，加入23ml生理鹽水，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μl(100IU/ml)，纖溶酶原280μl(0.5mg/ml)，要邊加邊搖勻，加2.2ml人纖維蛋白原(6mg/ml)，不停地搖勻，混濁后馬上倒平板(直徑8cm)，4℃冰箱水平放置至少半小時，充分凝固后待用。
標準品和待測樣品的稀釋標準品按如下方法進行對倍稀釋


待測樣品根據(jù)標示量稀釋至5μg/ml的濃度，待用。
打孔，點樣在形成的纖維蛋白平板內打孔(直徑2mm)，每孔點樣6μl，每個樣品和標準品復孔點樣，濕盒(在飯盒內加少量水以保持一定的濕度)于25℃水平放置16h。
結果計算和檢定報告點樣平板在黑色背景下縱橫兩次量取溶圈直徑，以各個稀釋度的活性的對數(shù)(x)為橫坐標，以溶圈直徑的平均數(shù)(四次量取的數(shù)值)的對數(shù)為縱坐標(y)，采用生物統(tǒng)計軟件分析結果。利用統(tǒng)計學軟件中的回歸分析方法作標準曲線，并求得y＝a+bx中的a和b及線性回歸系數(shù)r值，根據(jù)樣品的溶圈直徑可求得樣品的活性。
結果經(jīng)過計算，其溶栓比活性為4.1×104AU/mg。
重組SAK突變體的抗原性分析SAK多抗由研究室自行制備，采用小鼠的腹腔皮下注射免疫，經(jīng)初步純化后獲得SAK抗體。我們對重組蛋白的抗原性變化進行了初步分析，分別用野生型SAK和構建的SAK衍生體包被96孔板，封閉后洗滌3次，分別加入SAK鼠多抗，37℃溫育1h，洗滌5次，加入辣根酶標記的羊抗鼠抗體，溫育1h，洗滌5次，加入底物顯色，利用2M的H2SO4終止反應，每板作8個復孔，在490nm比較其OD值。
OD(SAK野生型)＝1.23±0.21OD(SAK衍生體)＝0.71±0.32可見衍生體的抗原性有所降低，有關抗體的動態(tài)變化情況的動物實驗正在進行中。
權利要求
1.一種低抗原性重組葡激酶突變體，其特征是GGA AAA TAT AGA AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGCGly Lys Tyr Arg Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr GlyCCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT GCA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CGT TATPro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp GlyAlaGly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg TyrGTC GAG TTT CCT ATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCAVal Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp AlaTTA GAT GCG ACA GCA TAT CAA GAG TTT AGA GTA GTT GCA TTA GCG CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu Asp Ala Thr Ala TyrGlnGlu Phe Arg Val ValAlaLeuAlaPro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTCTyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val ValCCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA GCG GTT GTT ATA GAA CGT GCGPro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile ThrAlaVal Val Ile GluArgAla
2.一種實現(xiàn)權利要求1葡激酶突變體的制備方法，其特征是A、實驗材料和設備a、菌株金黃色葡萄球菌Staphlococcus aureus 1.1476購自國家菌種保藏中心，E.coliDH5，BL21為軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基因工程研究室保存菌種；b、質粒T載體購自美國Promega公司，pBV220表達載體大小為3.66kb，是一種溫敏型高效表達載體，含有PRPL串聯(lián)的啟動子，cIts857溫敏調控基因與PRPL的存在，使該載體可以轉化任何受體菌，SD序列的后面緊跟多個克隆位點，為基因的操作提供了便利，為軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基因工程研究室保存，pT-SAK-M為軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基因工程研究室保存；c、酶與生化試劑BamHI、EcoRI、Taq酶和T4 DNA連接酶、小提、大提質粒試劑盒、DNA及蛋白分子量標準購自美國Promega公司；d、實驗器材PCR儀為美國PE公司產(chǎn)品，電泳儀、層析儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品，超凈工作臺、搖床為國產(chǎn)；B、制備過程a)SAK突變體的構建和鑒定從Staphlococcus aureus 1.1476株菌體中提取染色體DNA，設施PCR引物，首先獲得其N端缺失6個氨基酸SAK突變體基因，然后以它為模板，通過PCR方法將SAK分子中的一些B淋巴細胞表位區(qū)段進行修飾，主要包括第35、74、80、82、130、135和136位氨基酸；通過合成相關的引物序列定點改變這些位點的核苷酸序列，然后通過PCR和退火反應獲得預期的突變體基因；利用雙酶切和PCR對構建的突變體進行鑒定，然后進行核酸序列分析；b)SAK突變體表達載體的構建和鑒定利用EcoRI和BamHI雙酶切表達載體pBV220和利用PCR拼接的SAK突變體片段，利用T4DNA連接酶連接，轉化宿主細菌，利用酶切鑒定篩選陽性克隆，構建表達載體pBV220-SAK-M；c)重組SAK突變體蛋白的表達將含有重組質粒的克隆菌株接種于含氨芐青霉素Ap+的LB培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜，次日再以5％的濃度接種于LB培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)2小時至OD600為0.4-0.6之間，將培養(yǎng)物迅速移至42℃水浴中，震蕩培養(yǎng)，誘導表達4小時，同時以含有空載體的BL21菌株作為對照，誘導結束后，以12000rpm離心20秒，收取誘導表達的菌體，加入80μl TE緩沖液懸浮菌體，再加入等體積的2X載樣緩沖液混勻，100℃煮沸處理5分鐘，然后進行SDS-PAGE檢測；d)重組SAK突變體蛋白的純化將誘導表達菌以PB緩沖液50mM PB pH7.6，2mM EDTA洗滌菌體兩次，再以2-5倍體積的PBE緩沖液懸浮，置于冰浴中，利用超聲破碎儀破碎細菌，破碎結束后，將菌體破碎液倒于離心管中，在4℃條件下12000rpm離心20分鐘，取上清備用；利用離子交換負吸附的原理，將破碎后的上清穿過陰離子交換柱Q Sephrose FF，使rSAK衍生體蛋白穿過，菌體蛋白吸附于柱上，收集穿過液；經(jīng)過純化后，去掉一部分雜蛋白，使rSAK的純度得到提高，從而達到初步純化的作用。
全文摘要
本發(fā)明屬突變或遺傳工程領域，本發(fā)明公開了一種葡激酶的低抗原性突變體的制備方法及用途。SAK的前6位氨基酸與溶栓活性無關，但會影響其在一些原核細胞中的穩(wěn)定性。同時，其中35、74、80、82、130、135和136位氨基酸所在的區(qū)段具有多個B淋巴細胞表位，因此通過片段缺失、點突變等方法去除了SAK的前6位氨基酸，構建了N端缺失、中間和C末端區(qū)段多點修飾的SAK突變體。該突變體的溶栓活性沒有明顯變化，而突變體的抗原性顯著降低。本發(fā)明的突變體適合于原核細胞中的表達和制備，給工業(yè)生產(chǎn)帶來了便利。由于其生物學活性與野生型相比沒有顯著差異，可用于溶解血栓，其抗原性降低的特點可能使其多次應用成為可能。
文檔編號C07K1/00GK1948496SQ20051011269
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月14日 優(yōu)先權日2005年10月14日
發(fā)明者徐東剛, 王旻, 鄒民吉, 蔡欣, 徐濤, 劉深, 王園園, 王嘉璽 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所