專利名稱：熱休克蛋白65－人sars冠狀病毒表位抗原重組融合蛋白(hsp65－sars/3cl的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組融合蛋白，具體地是涉及一種預(yù)防和/或治療人SARS冠狀病毒感染的重組融合蛋白，該重組融合蛋白(HSP65-SARS/3CL161-264)是由熱休克蛋白65(heat shockprotein 65，HSP65)和SARS/3CL161-264表位抗原多肽融合所構(gòu)成；本發(fā)明提供了該重組融合蛋白的氨基酸序列及編碼該重組融合蛋白的核苷酸序列、含有該核苷酸序列的表達載體、含有該表達載體的宿主細胞，該重組融合蛋白的制備方法；本發(fā)明還涉及含有該重組融合蛋白的疫苗制品及該重組融合蛋白在制備用于治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物和/或試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2002年11月16日，我國廣東省出現(xiàn)了第1例有記錄的非典病例，短短3個月的時間內(nèi)，廣東省出現(xiàn)305人感染SARS，其中5位感染者死亡。從2003年2月下旬開始，非典型性肺炎蔓延至香港特別行政區(qū)、越南、加拿大、新加坡和美國等地。2002～2003年爆發(fā)流行的傳染性非典型性肺炎具有傳染性強、危害性大的特點，共造成29個國家的8,098例感染，774例感染者死亡[Stadler K，Masignani V，Eickmann M，etal.SARS-beginning to understanda new virus.Nat Rev Microbiol.2003，1(3)209-18.]。WHO將傳染性非典型性肺炎命名為重癥急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)?？茖W(xué)家們用了幾個月的時間才分離出SARS的病原體，繼加拿大首先公布了病毒Tor2的基因組序列后，美國、香港、新加坡、北京等都相繼報道了相應(yīng)病毒的基因組序列。2003年4月16日WHO正式將其命名為SARS冠狀病毒(SARS Coronavirus，SARS CoV)。
SARS冠狀病毒是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，為有包膜的單正鏈RNA病毒。SARS病毒經(jīng)負染后在透射電子顯微鏡下直徑為60～130nm、有包膜，大部分病毒粒子表面都能見到冠狀病毒特征性的突起。[Ksiazek TG，Erdman D，Goldsmith CS，et al.A novel coronavirusassociated with severe acute respiratory syndrome.N Engl JMed，2003，348(20)1953-1966.，Drosten C，Gunther S，Preiser W，et al.Identificationof a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.N EnglJ Med，2003，348(20)1967-1976.，Peiris JS，Lai ST，Poon LL，et al.Coronavirusas a possible cause of severe acute respiratory syndrome.Lancet，2003，361(9366)1319-1325.]。SARS病毒對環(huán)境因素的抵抗力較強。室溫條件下，在正常人的尿中至少存活24h，在糞便中至少存活48h。在4℃和-80℃，21天后病毒滴度只有輕微下降。10％甲醛和多聚甲醛、10％次氯乙酸、75％乙醇等常用的固定劑和消毒劑在5分鐘內(nèi)即可將其完全滅活[WHO First data.First data on stability and resistance of SARS coronaviruscompiled by members of WHO laboratory network.http//www.who.int/csr/gars/survival-2003-05-04/en/print.html]。
由于SARS CoV的危害性極大，科學(xué)人員正在加緊研究防治該病毒的藥物和疫苗。病毒疫苗大致分為滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗和核酸疫苗4個類型。滅活疫苗的研制最經(jīng)典、最簡單、最快捷，是將培養(yǎng)的病毒滅活，以超過濾、柱層析等方法制備純化后用于臨床應(yīng)用。經(jīng)過我國科技人員的共同努力，2004年1月19日，SARS CoV滅活疫苗已經(jīng)獲得國家批準進入I期臨床研究。滅活疫苗的優(yōu)點是研制周期短。缺點是對生產(chǎn)的安全條件要求極高，病毒大規(guī)模培養(yǎng)時，一旦泄漏將發(fā)生巨大災(zāi)難。所以滅活疫苗和減毒活疫苗將會被基因工程疫苗所取代(例如基因工程乙型病毒肝炎疫苗代替了滅活疫苗應(yīng)用于臨床)?；蚬こ桃呙绲耐怀鰞?yōu)點是具有良好的安全性，可以大規(guī)模生產(chǎn)，成本低，而且可根據(jù)需要進行設(shè)計。我們在研制SARS基因工程疫苗時，選擇了SARS冠狀病毒的主要蛋白質(zhì)加工酶3CLpro作為靶抗原。3Clpro的主要功能之一是對冠狀病毒復(fù)制所必需的RNA聚合酶和解旋酶進行加工，這已為許多3CLpro突變體及其抑制劑等實驗所證實(Marra MA，Jones SJM，Astell CR，et al.The genome sequence of the SARS-associated coronavirus.Science，2003，3001399.，Pinon JD，Teng H，Weiss SR.Further requirements for cleavage by the murine coronavirus3Clike proteinasedentification of a cleavage site within ORF1b.Virology，1999，263(2)471-484.，Kim JC，Spence RA，Currier PF，Lu X，Deni son MR.Coronavirusprotein processing and RNA synthesis is inhibited by the cysteine proteinaseinhibitor E64d.Virology，1995，208(1)1-8.)，而且3Clpro在所有的冠狀病毒中都非常保守(Anand K，Ziebuhr J，Wadhwani，P，et al.2003.Coronavirus main proteinase(3CLpro)structureBasis for design of anti-SARS drugs.Science 3001763-1767.)，為SARSCoV疫苗的研制提供了很好的細胞免疫的靶點。
本發(fā)明是根據(jù)SARS冠狀病毒主要蛋白酶3Clpro的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic TLymphocytes，CTL)表位的預(yù)測結(jié)果而構(gòu)建的CTL表位重組融合蛋白。CTL是機體抗感染的重要免疫細胞。病毒感染細胞后，病毒基因編碼的病毒蛋白作為內(nèi)源性蛋白在細胞內(nèi)加工成短肽，運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHC I類分子結(jié)合，CTL通過受體(TCR)識別與MHCI類分子結(jié)合的病毒相關(guān)肽，并特異性地殺傷病毒感染細胞。這些與MHCI類分子結(jié)合并能夠被TCR所識別的多肽被稱為CTL表位。CTL表位肽與MHCI類分子結(jié)合形成的復(fù)合體是T細胞激活和發(fā)揮免疫作用的第一活化信號，臨床試驗已經(jīng)證實CTL表位疫苗能夠誘生表位特異性CTL反應(yīng)(Muderspach L，Wilczynski S，Roman L，et al.A phase I trial of a human papillomavirus(HPV)peptide vaccine for women with high-grade cervical and vulvar intraepithelialneoplasia who are HPV 16 positive.Clin Cancer Res.2000；6(9)3406-16.)，因此我們可以通過CTL表位重組融合蛋白來激活病毒抗原特異性的CTL，達到清除病毒的目的。
由于SARS Cov是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前還沒有CTL表位鑒定的研究報道。如果通過傳統(tǒng)方法篩選CTL表位，盲目性大、成本高、耗時費力。計算機表位預(yù)測法是篩選表位的一種新技術(shù)，首先通過預(yù)測選擇潛在的表位，再利用實驗進行篩選鑒定，由于該技術(shù)目標明確、方法先進，現(xiàn)在已經(jīng)取得了令人矚目的成就。因此本研究采用了這種計算機表位預(yù)測的方法來預(yù)測SARS Cov主要蛋白酶3Clpro的CTL表位。由于表位預(yù)測的軟件很多，各個軟件的理論依據(jù)也不完全相同，為了達到取長補短的目的，我們在研究中選用了三個權(quán)威網(wǎng)站提供的軟件(http//bimas.dcrt.nih.gov HLA Peptide Binding Predictions；http//www.syfpeithi.deSYFPEITH；http//www.bioinformatics.leeds.ac.uk)分別進行了預(yù)測，根據(jù)預(yù)測結(jié)果選取表位分布密集、評分較高的3Clpro蛋白質(zhì)序列中第161位氨基酸至第214位氨基酸(SARS/3CL161-264)作為重組融合的主要成分。
通常情況下，外源性的蛋白質(zhì)主要進入MHCII類遞呈途徑，激活體液免疫反應(yīng)，不能有效地激活CTL，因此，必須設(shè)法使重組融合蛋白進入MHC I類抗原加工提呈途徑才能發(fā)揮其激活特異性CTL的作用。
HSP65是熱休克蛋白家族中的一員，在免疫應(yīng)答的過程中，可以協(xié)助外源的抗原性物質(zhì)進入抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)；并協(xié)助外源性抗原進入MHC I類加工遞呈途徑，進而激活特異性CTL；同時HSP65還能刺激APC分泌細胞因子和表達協(xié)同刺激分子，提供強效的T細胞活化的第二信號。
因此，本發(fā)明創(chuàng)造性將HSP65和SARS/3CL161-264融合在一起構(gòu)成重組融合蛋白，利用HSP65將SARS/3CL161-264攜帶入MHCI類加工遞呈途徑，特異性地激活SARS特異性的CTL，達到殺傷感染SARS病毒細胞的目的。在本發(fā)明中，為了優(yōu)化結(jié)構(gòu)有利于重組蛋白的表達，在SARS/3CL161-264的上游添加無關(guān)氨基酸D(天冬氨酸)、E(谷氨酸)，下游添加無關(guān)氨基酸E、D、D、E、D，下文簡稱為SARS/3CL161-264。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組融合蛋白，該重組融合蛋白是將熱休克蛋白65(HSP65)和SARS/3CL161-264表位抗原多肽融合在一起所構(gòu)成的，該重組融合蛋白(下文簡稱為HSP65-SARS/3CL161-264)對人的SARS病毒感染有預(yù)防和/或治療作用。本發(fā)明還提供了一種含有該核苷酸序列的表達載體。本發(fā)明同時提供了一種含有該表達載體的宿主細胞。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備該重組融合蛋白的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有該重組融合蛋白的疫苗制品及該重組融合蛋白在制備用于治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物和/或試劑中的應(yīng)用本發(fā)明提供了一種重組融合蛋白，該重組融合蛋白是本發(fā)明人首次開拓性地將HSP65和3Clpro蛋白質(zhì)序列中第161位氨基酸至第214位氨基酸(SARS/3CL161-264)融合形成了全新的基因工程重組融合蛋白，從而賦予SARS/3CL161-264表位抗原能夠特異性地激活特異性SARS/3CL161-264CTL的性質(zhì)，被激活的特異性SARS/3CL161-264CTL能夠殺傷感染SARS病毒的細胞，能夠?qū)ARS病毒感染進行有效的預(yù)防和治療。
本發(fā)明還提供編碼該重組融合蛋白的核苷酸序列和該重組融合蛋白的氨基酸序列。該重組融合蛋白基因具有SEQ ID NO5所示的核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。該核苷酸序列中SARS/3CL161-264表位抗原可以是1-5個拷貝，一個拷貝的SARS/3CL161-264表位抗原具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其核苷酸編碼序列如SEQ ID NO1所示；一個拷貝優(yōu)化的SARS/3CL161-264表位抗原具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，其核苷酸編碼序列如SEQ ID NO3所示。
與SEQ ID NO1-6具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％同源性的核苷酸序列或氨基酸序列，或在核酸分子雜交條件下與上述核苷酸序列或上述氨基酸序列的編碼核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或上述序列人工點突變或以插入、在兩側(cè)連接其它序列的方式進行改造所得的序列也可與上述序列起到等同的作用。在本發(fā)明中所指的核酸分子雜交條件可以如下所述，但不只局限于此5×SSC，20mmol/L磷酸緩沖液，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸匍聚糖及100μg/ml變性鮭精DNA片段，在65℃雜交8-16小時，并在2×SSC和0.5％SDS溶液中室溫下清洗5分鐘，接著于2×SSC和0.1％SDS溶液中室溫下清洗15分鐘，然后于0.1×SSC和0.1％SDS溶液中65℃下清洗30-60分鐘，最后于0.1×SSC室溫下稍稍漂洗濾膜。
本發(fā)明還提供了一種以本發(fā)明重組融合蛋白作為有效成分的疫苗制品，將本發(fā)明的重組融合蛋白選擇性地與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑等結(jié)合，通過適當?shù)慕o藥途徑和有效劑量施加于被施用者，從而達到治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的目的。
本發(fā)明的“藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑”是指當分子本體和組合物適當?shù)亟o予被施用者時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本發(fā)明所指的“藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑”應(yīng)當與本發(fā)明的重組融合蛋白相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果。可作為藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的一些物質(zhì)的具體例子有糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；片壓劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明的疫苗制品可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)被施用者的種類、年齡、體重和給藥方式等因素確定對被施用者有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以采用注射和其它治療方式。
本發(fā)明的重組融合蛋白可通過已知的方法進行生產(chǎn)。
熱休克蛋白65是一種來源于卡介苗的蛋白質(zhì)，它在與SARS/3CL161-264表位抗原融合形成融合蛋白后，可以協(xié)助SARS/3CL161-264表位抗原多肽進入包括樹突狀細胞在內(nèi)的抗原提呈細胞并進入MHC I類加工提呈途徑，進而激活針對表達SARS/3CL161-264表位抗原細胞的CTL。此外，熱休克蛋白65還可刺激包括樹突狀細胞在內(nèi)的抗原提呈細胞表達協(xié)同刺激分子(如B7等)和分泌細胞因子，這些協(xié)同刺激分子(如B7等)和細胞因子可協(xié)助激活CTL。
由于SARS病毒的強致病性和高傳染性，只能在具有特殊設(shè)備的實驗室中才可以直接用SARS病毒進行試驗，因此，我們構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的真核細胞表達質(zhì)粒pcDNA3-GFP，把合成的SARS/3CL161-264基因構(gòu)建于GFP基因的下游，使GFP和SARS/3CL161-264基因處于同一個閱讀框架，得到真核細胞重組表達質(zhì)粒pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264。用這種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了小鼠黑色素瘤細胞株B16，獲得了表達GFP-SARS/3CL161-264的轉(zhuǎn)染細胞。對轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264的B16細胞的CTL反映的是SARS/3CL161-264特異性的CTL對感染SARS病毒細胞的殺傷。本發(fā)明的HSP65-SARS/3CL161-264抑制轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264基因的B16細胞在小鼠體內(nèi)生長反映的是由本發(fā)明提供的HSP65-SARS/3CL161-264在小鼠體內(nèi)誘生了特異性的CTL，CTL殺傷了表達SARS/3CL161-264特異性抗原的B16細胞，導(dǎo)致B16數(shù)量減少，說明本發(fā)明中的HSP65-SARS/3CL161-264在小鼠能夠誘生SARS/3CL161-264特異性的CTL，這種CTL具有較強的殺傷SARS病毒感染細胞的能力。
另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它具有實質(zhì)性特點的方面和創(chuàng)造性的有益效果對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。


圖1SARS病毒表位預(yù)測利用三種軟件預(yù)測分析SARS/3CL表位，161-264氨基酸位點之間表位分布密集(SYFPEITH預(yù)測結(jié)果中表位評分相差懸殊，范圍從0～2500000000，為了更直觀的了解表位分布情況，把這一部分結(jié)果分解為兩部分即value＞100與value＜30分別作圖)圖2HSP65-SARS/3CL161-264重組蛋白結(jié)構(gòu)分析從圖中可見，蛋白的α螺旋、β片層、疏水性和親水性結(jié)構(gòu)分布均勻，蛋白的N、C末端均為親水性結(jié)構(gòu)(DNA star.INC)圖3合成SARS/3CL161-264表位抗原基因第一輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道1箭頭所示為PCR產(chǎn)物99bp泳道2DL2000marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)圖4合成SARS/3CL161-264表位抗原基因第二輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道1箭頭所示為PCR產(chǎn)物183bp泳道2DNA2000marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)圖5合成SARS/3CL161-264表位抗原基因第三輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道1箭頭所示為PCR產(chǎn)物267bp泳道3DNA2000marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)圖6合成SARS/3CL161-264表位抗原基因第四輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道1箭頭所示為PCR產(chǎn)物357bp泳道2DNA2000marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)圖7pMD-18T-SARS/3CL161-264重組質(zhì)粒的酶切鑒定泳道1箭頭所示為質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶消化后釋放的345bp片段泳道2完整pMD18T-SARS/3CL161-264質(zhì)粒泳道3DNA2000marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)圖8HSP65編碼基因的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道1marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)泳道2通過PCR獲得的熱休克蛋白65(HSP65)編碼基因(1638bp)圖9真核細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264的酶切鑒定泳道1完整pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264質(zhì)粒泳道2質(zhì)粒用HindIII單酶切鑒定釋放出約1100bp片段泳道3DNA2000marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)圖10穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-SARS/3CL161-264基因B16細胞的鑒定10a共聚焦顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染細胞發(fā)出綠色熒光10b FACS鑒定與未轉(zhuǎn)染的細胞相比，有熒光的轉(zhuǎn)染細胞右移圖11表達質(zhì)粒pET28a-HSP65-SARS/3CL161-264的酶切鑒定泳道1箭頭所示為質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切釋放的345bp片段泳道2完整pET28a-HSP65-SARS/3CL161-264質(zhì)粒泳道3DNA2000marker(2000/1000/750/500/250/100bp)(Takara)圖12表達、純化后的重組融合蛋白HSP65-SARS/3CL161-264SDS-PAGE鑒定及Western blot鑒定分析12a HSP65-SARS/3CL161-264的Western blot鑒定泳道1箭頭所示為HSP65-SARS/3CL161-264表達帶，80KD泳道2Protein marker，14、20、33、45、66、90KD(Takara)泳道3箭頭所示為HSP65-SARS/3CL161-264蛋白Western blot，一抗為his-tag單抗12b表達、純化后HSP65-SARS/3CL161-264SDS-PAGE泳道1箭頭所示為Ni2+親和層析獲得純化的HSP65-SARS/3CL161-264，80KD泳道2Protein marker，33、45、66、90KD(Takara)泳道3箭頭所示為純化前的HSP65-SARS/3CL161-264圖13HSP65-SARS/3CL161-264在小鼠體內(nèi)激發(fā)的特異性抑制作用圖14HSP65-SARS/3CL161-264實驗組和PBS對照組小鼠腫瘤重量的比較 PBS注射組 HSP65-SARS/3CL161-264免疫組圖15HSP65-SARS/3CL161-264免疫后小鼠SARS/3CL161-264特異性的CTL誘生效應(yīng)細胞為小鼠的脾細胞，靶細胞為轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264表位抗原的B16細胞、未轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264表位抗原的B16細胞，效靶比為200∶1、100∶1、50∶1、25∶1時對靶細胞的特異性殺傷率均高于PBS對照組。
HSP65-SARS/3CL161-264免疫鼠脾細胞殺傷轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264基因的B16細胞 HSP65-SARS/3CL161-264免疫鼠脾細胞殺傷B16細胞 PBS注射鼠脾細胞殺傷轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264基因的B16細胞 PBS注射鼠脾細胞殺傷B16細胞圖16HSP65-SARS/3CL161-264對SARS/3CL161-264小鼠記憶性淋巴細胞的刺激作用 HSP65-SARS/3CL161-264免疫組□PBS注射組圖17HSP65-SARS/3CL161-264體外人殺傷性T淋巴細胞的誘生效應(yīng)細胞為用CD4，CD14，CD56，HLA-DR，TCR，Glycoglin A磁珠相繼純化CD8+T細胞。靶細胞為用HPV抗原肽裝載12h的T2細胞。CD8+T細胞經(jīng)100ug/mlHSP65-SARS/3CL161-264或細胞因子刺激的人成熟樹突狀細胞體外免疫。
裝載HSP65-SARS/3CL161-264的人成熟樹突狀細胞。
陰性對照為細胞因子刺激的人成熟樹突狀細胞。
具體實施例方式
在如下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，例如Molecular Cloning一書(Joseph.Sambrook，David W.Russell.Molecular cloningALaboratory Manual，3rded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)所述的方法。
實施例1SARS病毒CTL表位的預(yù)測在選擇表位預(yù)測的靶抗原時，我們把控制SARS冠狀病毒復(fù)制的保守蛋白酶3Clpro作為SARS CoV疫苗的靶點。選擇占人口比例最大的HLA-A2限制的表位、用三個網(wǎng)站提供的軟件進行HLA特異結(jié)合的表位預(yù)測(1)http//bimas.dcrt.nih.govHLA Peptide Binding Predictions(2)http//www.syfpeithi.deSYFPEITH(3)http//www.bioinformatics.leeds.ac.uk根據(jù)計算機輔助HLA限制性表位預(yù)測結(jié)果用EXCEL做圖(圖1)，選取表位密集分布的區(qū)域作為候選抗原成分，嘗試設(shè)計了多種方案，并把各種方案用Sequence Analysis Software軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3Clpro的161-264位氨基酸是表位集中的區(qū)域，蛋白二級結(jié)構(gòu)(α螺旋、β片層)分布合理、親疏水區(qū)等生物學(xué)參數(shù)最為理想(圖2)，我們選擇這一段作為靶蛋白，并將其融合于HSP65的下游，進行了重組融合蛋白的表達和功能試驗。為了提高其在大腸桿菌中的表達量，在重組融合蛋白編碼基因設(shè)計中全部應(yīng)用了原核基因偏愛密碼子。同時為了進一步優(yōu)化該蛋白的結(jié)構(gòu)，在SARS/3CL161-264的上游和下游分別添加了2個氨基酸DE和5個氨基酸EDDED。
優(yōu)化后的SARS/3CL161-264的氨基酸序列如下DEYMHHMELPTGVHAGTDLEGKFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMEDDED為了檢測重組融合蛋白的生物學(xué)功能，我們根據(jù)表位預(yù)測的結(jié)果合成了3個SARS/3CL161-264表位肽肽ANH2-vlawlyaav肽BNH2-flnrftttl肽CNH2-ttlndfnlv實施例2單拷貝SARS/3CL161-264表位抗原基因的合成1、第一輪PCR(兩條引物互為模板進行擴增)引物1的序列為(SEQ ID NO.7)5′-ACTATCACTCTTAATgTTCTggCTTggCTgTACgCTgCTgTTATTAACggTgACCgC引物1’的序列為(SEQ ID NO.8)5′-gTTgAAATCgTTCAgggTAgTAgTAAAgCggTTCAggAACCAgCggTCACCgTTAAT第一輪PCR合成的產(chǎn)物的序列是ACTATCACTCTTAATGTTCTGGCTTGGCTGTACGCTGCTGTTATTAACGGTGACCGCTGGTTCCTGAACCGCTTTACTACTACCCTGAACGATTTCAAC第一輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見圖3。
2、以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR引物2的序列是(SEQ ID NO.9)5′-TTCgTTgACCgTCAgACTgCACAggCTgCTggTACTgACACTACTATCACTCTTAATg引物2′的序列是(SEQ ID NO.10)5′-gTCTTgAgTCAgCggTTCgTAgTTgTACTTCATAgCAACCAggTTgAAATCgTTCAg產(chǎn)物的序列是5′TTCGTTGACCGTCAGACTGCACAGGCTGCTGGTACTGACACTACTATCACTCTTAATGTTCTGGCTTGGCTGTACGCTGCTGTTATTAACGGTGACCGCTGGTTCCTGAACCGCTTTACTACTACCCTGAACGATTTCAACCTGGTTGCTATGAAGTACAACTACGAACCGCTGACTCAAGAC3′第二輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見圖4。
3、以第二輪PCR產(chǎn)物為模板進行第三輪PCR引物3序列是(SEQ ID NO.11)5′-gTTCACgCAggTACTgACCTggAAggTAAATTTTATggTCCgTTCgTTgACCgTCAg引物3′的序列是(SEQ ID NO.12)5′-gATACCAgTCTgAgCAgACAgTggACCCAgAATgTCTACgTggTCTTgAgTCAgCgg產(chǎn)物的序列是5′GTTCACGCAGGTACTGACCTGGAAGGTAAATTTTATGGTCCGTTCGTTGACCGTCAGACTGCACAGGCTGCTGGTACTGACACTACTATCACTCTTAATGTTCTGGCTTGGCTGTACGCTGCTGTTATTAACGGTGACCGCTGGTTCCTGAACCGCTTTACTACTACCCTGAACGATTTCAACCTGGTTGCTATGAAGTACAACTACGAACCGCTGACTCAAGACCACGTAGACATTCTGGGTCCACTGTCTGCTCAGACTGGTATC 3′第三輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見圖5。
4、以第三輪PCR產(chǎn)物為模板進行第四輪PCR引物4序列是(SEQ ID NO.13)5′-gAATTCgATgAgTACATgCACCACATggAACTgCCgACCggTgTTCACgCAggTACTg引物4′的序列是(SEQ ID NO.14)5′-CTCgAgTCACTAAAgCTTgTCTTCgTCgTCCTCCATATCCAgAACAgCgATACCAgTCTgAgC產(chǎn)物的序列是5′GAATTCGATGAGTACATGCACCACATGGAACTGCCGACCGGTGTTCACGCAGGTACTGACCTGGAAGGTAAATTTTATGGTCCGTTCGTTGACCGTCAGACTGCACAGGCTGCTGGTACTGACACTACTATCACTCTTAATGTTCTGGCTTGGCTGTACGCTGCTGTTATTAACGGTGACCGCTGGTTCCTGAACCGCTTTACTACTACCCTGAACGATTTCAACCTGGTTGCTATGAAGTACAACTACGAACCGCTGACTCAAGACCACGTAGACATTCTGGGTCCACTGTCTGCTCAGACTGGTATCGCTGTTCTGGATATGGAGGACGACGAAGACAAGCTTTAGTGACTCGAG3′第四輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見圖6。
第四輪PCR產(chǎn)物的5′端帶有EcoRI酶切點，下游引物3′端帶有Hind III、XhoI酶切點。該序列為一個拷貝的優(yōu)化的SARS冠狀病毒表位抗原序列。
5、將第四輪PCR產(chǎn)物克隆入載體pMD-18T(Takara)
PCR產(chǎn)物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR產(chǎn)物，方法見(試劑盒，Takara)。
PCR產(chǎn)物的序列分析按常規(guī)方法(Joseph.Sambrook，David W.Russell.Molecular cloningA LaboratoryManual，3rded.SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，27-30.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行序列測定，其氨基酸序列如SEQ IDNO4所示，相應(yīng)的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO3所示。
圖7是酶切鑒定pMD-18T-SARS/3CL161-264重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。
實施例3熱休克蛋白65KD(HSP65)編碼基因的獲得1、卡介苗來源于長春生物制品研究所。采用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)卡介苗，培養(yǎng)的溫度為37-39℃生長出的卡介苗，呈現(xiàn)干皺淺黃色的菌膜。收集菌膜，從中提取卡介苗基因組DNA。
2、提取卡介苗基因組DNA方法參照Molecular Cloning一書(Joseph.Sambrook，David W.Russell.Molecular cloningA Laboratory Manual，3rded.用蛋白酶K和苯酚從哺乳動物細胞中分離高分子質(zhì)量DNA，463-470。Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001))。
3、分離HSP65結(jié)構(gòu)基因采用PCR方法自卡介苗分離HSP65結(jié)構(gòu)基因。采用的5’端引物序列為5’CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3’，3’(SEQ ID NO15)；3’端引物序列為5’ACCGAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3’(SEQ ID NO16)。
PCR操作程序在一500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA(mmol/L)5μl10×PCR緩沖液(含氯化鎂) 5μldNTPs(10mmol/L) 1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl去離子水 加至終體積50μl混合后加入礦物油 3滴反應(yīng)條件94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物的5′端帶有Nco I酶切位點，下游引物3′端帶有EcoRI酶切位點。
4、克隆PCR產(chǎn)物采用TA克隆方法，獲得了攜帶HSP65基因的質(zhì)粒pMD-18T-HSP65。方法見(試劑盒，Takara)。按常規(guī)方法(Joseph.Sambrook，David W.Russell.SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，MolecularcloningA Laboratory Manual，3rded.27-30，Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行序列測定(ABIPrism310TM，USA)。
HSP65編碼基因的序列如下ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG 50GGGCTTGAAC GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG 100GCCGCAACGT CGTCCTGGAA AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC 150GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG CTGGAGGATC CGTACGAGAA 200GATCGGCGCC GAGCTGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC GATGACGTCG 250CCGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC 300GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG 350CGGCATCGAA AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG 400CCAAGGAGGT CGAGACCAAG GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG 450GCGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC GCCGAGGCGA TGGACAAGGT 500GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC TTTGGGCTGC 550AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGCGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG 600TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA 650CATCCTGCTG GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC 700TGCTCGAGAA GGTCATCGGA GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG 750GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG GTCGTCAACA AGATCCGCGG 800CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC GACCGCCGCA 850AGGCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC 900GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA 950GGCCCGCAAG GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG 1000CCGGTGACAC CGACGCCATC GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG 1050ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT 1100GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT GCCGCCACCG 1150ACGTCGAACT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT 1200GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT 1250GTTGCAAGCG GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG 1300CGACCGGCGC CAACATCGTG AAGGTGGCGC TGGAGGCCCC GCTGAAGCAG 1350ATCGCCTTCA ACTCCGGGCT GGAGCCGGGC GTGGTGGCCG AGAAGGTGCG 1400
CAACCTGCCG GCTGGCCACG GACTGAACGC TCAGACCGGT GTCTACGAGG 1450ATCTGCTCGC TGCCGGCGTT GCTGACCCGG TCAAGGTGAC CCGTTCGGCG 1500CTGCAGAATG CGGCGTCCAT CGCGGGGCTG TTCCTGACCA CCGAGGCCGT 1550CGTTGCCGAC AAGCCGGAAA AGGAGAAGGC TTCCGTTCCC GGTGGCGGCG 1600ACATGGGTGG CATGGATTTC CATATGGCTA GCGAATTC用PCR獲得的HSP65基因的瓊脂糖凝膠電泳見圖85、構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-HSP65用NCoI和EcoRI同時消化pET28a(Invitrogen)質(zhì)粒和攜帶HSP65基因的pMD-18T-HSP65質(zhì)粒，分別回收HSP65基因和線性化的pET28a質(zhì)粒，用T4DNA連接酶將HSP65基因和線性化的pET28a質(zhì)粒連接后，形成pET28a-HSP65重組質(zhì)粒。用pET28a-HSP65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，取陽性轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。經(jīng)EcoRI和NCoI酶消化后，在2％瓊脂糖凝膠電泳中對陽性克隆進行鑒定，質(zhì)粒用酶消化后釋放出約1638bp片段。
實施例4重組SARS/3CL161-264表位抗原基因真核細胞表達質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRI和XhoI同時消化實施例1構(gòu)建的pMD-18T-SARS/3CL161-264質(zhì)粒和攜帶GFP基因的pcDNA3-GFP質(zhì)粒，分別回收SARS/3CL161-264基因片段和線性化的pcDNA3-GFP質(zhì)粒，用T4DNA連接酶將SARS/3CL161-264基因片段和線性化的pcDNA3-GFP質(zhì)粒連接后，形成重組質(zhì)粒pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264，用重組質(zhì)粒pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，取陽性轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。經(jīng)酶消化后，在2％瓊脂糖凝膠電泳中對陽性克隆進行鑒定，pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264質(zhì)粒用HindIII單酶消化后釋放出約1100bp片段。酶切鑒定電泳見圖9。DNA測序的結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
實施例5SARS/3CL161-264基因轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16細胞的制備SARS Cov雖然能夠體外培養(yǎng)，但是該病毒的危害性極大，只能在具有特殊裝備的實驗室中擴增培養(yǎng)。由于沒有適合其他實驗室日常研究用的病毒感染細胞模型，因此，我們利用攜帶綠色熒光蛋白GFP基因的真核細胞表達質(zhì)粒pcDNA3-GFP，把合成的SARS/3CL161-264基因構(gòu)建于GFP基因的下游，使GFP和SARS/3CL161-264基因同處于一個閱讀框架中，得到了重組pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264真核細胞表達質(zhì)粒。用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細胞株B16，獲得了表達GFP-SARS/3CL161-264的轉(zhuǎn)染細胞，這種細胞被我們用作SARS Cov感染的細胞模型來檢測HSP65-SARS/3CL161-264的活性。
1、細胞的轉(zhuǎn)染(1)準備下列試劑溶液A含1-2μg質(zhì)粒DNA的100μl無血清IMDM。
溶液B含10-20μl Liposome試劑的100μl無血清IMDM。
(2)將溶液A慢慢加到溶液B中，輕輕混合，室溫(一般為20-25℃左右)孵育45min，此時混合液中可能出現(xiàn)絮狀物，為正?，F(xiàn)象。
(3)在混合液孵育期間，用2ml無血清IMDM培養(yǎng)液將細胞洗一次。
(4)將0.8ml無血清IMDM培養(yǎng)液加到A/B混合液中，輕輕混合。
(5)將A/B混合液輕輕加入到含有細胞的培養(yǎng)孔中。
(6)37℃，5％CO2培養(yǎng)5小時。
(7)直接向培養(yǎng)孔中加入1ml含20％FBS的IMDM，繼續(xù)培養(yǎng)18-24小時。
(8)棄培養(yǎng)液，加入2ml含10％FBS的新鮮IMDM，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，收集細胞，用于重組蛋白質(zhì)的表達鑒定。
2、pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16細胞的鑒定收集pcDNA3-GFP-SARS/3CL161-264轉(zhuǎn)染的B16細胞，用共聚焦顯微鏡和FACS技術(shù)對陽性克隆進行鑒定，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-SARS/3CL161-264基因的小鼠黑色素瘤B16細胞在共聚焦顯微鏡下細胞呈現(xiàn)綠色，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞中有較強的綠色熒光，鑒定結(jié)果見圖10。
實施例6HSP65-SARS/3CL161-264融合基因的構(gòu)建、表達和純化1、重組融合蛋白表達質(zhì)粒pET28a-HSP65-SARS/3CL161-264的構(gòu)建實施例1構(gòu)建的pMD-18T-SARS/3CL161-264質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶消化后，回收345bp的DNA片段。亞克隆連接至用同樣的限制性內(nèi)切酶消化并回收的pET28a-HSP65線性載體。實驗方法見前文。亞克隆重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶消化后，在1％瓊脂糖凝膠中電泳，可見約345bp片段(圖11)，DNA測序證實表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。融合蛋白HSP65-SARS/3CL161-264的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，其相應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。
2、HSP65-SARS/3CL161-264的表達和純化采用10升的發(fā)酵罐培養(yǎng)含HSP65-SARS/3CL161-264編碼基因表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL DE 3(Novagen)，以乳糖為誘導(dǎo)物。在裂菌后，經(jīng)鎳親合層析、除鹽、離子交換層析、除鹽后得到HSP65-SARS/3CL161-264。取10μl樣品上樣進行12％SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色后，HSP65-SARS/3CL161-264出現(xiàn)為一個單一區(qū)帶，無雜帶。取10μl樣品做HPLC分析，HSP65-SARS/3CL161-264的純度為96.1％。HSP65-SARS/3CL161-264的SDS-PAGE和Western Blot鑒定見圖12。
實施例7感染SARS病毒細胞的特異性生長抑制1、方法設(shè)立PBS對照組和5、15、30μg不同劑量的HSP65-SARS/3CL161-264實驗組，每組8只6-8周齡、雌性C57BL/6小鼠。于第0天給實驗組和對照組小鼠接種轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264的B16細胞，1.5×105個細胞/小鼠，接種部位是小鼠的背部右側(cè)皮下。于第2天和第16天，給3個實驗組小鼠分別注射HSP65-SARS/3CL161-264，注射劑量分別為5、15、30μg，注射部位是小鼠四肢向心端皮下。對照組小鼠注射PBS。于第25天，處死長腫瘤的小鼠，分離腫瘤并稱重。
2、實驗結(jié)果同PBS組小鼠相比，3個不同劑量的HSP65-SARS/3CL161-264實驗組小鼠體內(nèi)SARS/3CL161-264陽性腫瘤生長慢，體積小，平均重量為0.52g，PBS組小鼠腫瘤的平均重量為4.01g。HSP65-SARS/3CL161-264實驗組小鼠和PBS對照組小鼠腫瘤重量的比較見圖14。實驗結(jié)果表明HSP65-SARS/3CL161-264在小鼠體內(nèi)激活了SARS/3CL161-264表位抗原特異性的CTL，抑制了表達的SARS/3CL161-264表位抗原細胞的生長(圖13)。
3、結(jié)論HSP65-SARS/3CL161-264可抑制小鼠體內(nèi)表達SARS/3CL161-264細胞的生長。HSP65-SARS/3CL161-264可抑制感染SARS病毒細胞的生長。
實施例8小鼠SARS/3CL161-264特異性CTL的誘生1、方法設(shè)立HSP65-SARS/3CL161-264實驗組和PBS對照組，每組8只6-8周齡、雌性C57BL/6小鼠，于第0、14、21天，給實驗組小鼠免疫HSP65-SARS/3CL161-264，免疫部位是小鼠四肢向心端皮下，免疫劑量為每只小鼠10μgHSP65-SARS/3CL161-264；給對照組小鼠注射PBS，注射部位同實驗組小鼠。免疫結(jié)束后第5天，分離小鼠的脾細胞作為效應(yīng)細胞，轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264的B16細胞及未轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264的B16細胞作為靶細胞，按常規(guī)方法進行CTL殺傷試驗。
2、結(jié)果同PBS組小鼠相比，HSP65-SARS/3CL161-264免疫組小鼠脾T淋巴細胞能夠特異性地殺傷轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264的靶細胞，而不能殺傷未轉(zhuǎn)染SARS/3CL161-264的靶細胞。這表明HSP65-SARS/3CL161-264免疫使小鼠產(chǎn)生了針對表達SARS/3CL161-264表位抗原細胞的CTL。
3、結(jié)論HSP65-SARS/3CL161-264可誘生小鼠SARS/3CL161-264特異性CTL。
HSP65-SARS/3CL161-264誘生的CTL可特異性地殺傷SARS病毒感染細胞。
圖15表達SARS/3CL161-264表位抗原的B16細胞的體外特異性殺傷實驗結(jié)果。
實施例9HSP65-SARS/3CL161-264對小鼠記憶性淋巴細胞的刺激作用入侵機體的病毒抗原能夠誘導(dǎo)體內(nèi)記憶性的淋巴細胞，當機體再次遇到相同抗原刺激時會發(fā)生免疫回憶反應(yīng)。
為了觀察HSP65-SARS/3CL161-264是否具有這樣的功能，分別取兩只經(jīng)HSP65-SARS/3CL161-264免疫小鼠和兩只PBS注射小鼠的淋巴結(jié)細胞，制成淋巴細胞懸液，設(shè)立HSP65-SARS/3CL161-264蛋白、SARS/3CL161-264合成表位肽、培養(yǎng)液3組，分別加入HSP65-SARS/3CL161-264蛋白、SARS/3CL161-264合成表位肽、培養(yǎng)液。培養(yǎng)72小時后，每孔加入1μCi3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)16小時，收集細胞，測定3H-TdR摻入量。結(jié)果表明，蛋白免疫組的淋巴結(jié)細胞，在HSP65-SARS/3CL161-264蛋白、SARS/3CL161-264合成表位肽A、B和C的刺激下3H-TdR摻入量高于培養(yǎng)液對照組，結(jié)果表明發(fā)生了淋巴細胞的特異性增生。3H-TdR摻入實驗的結(jié)果分析如下①肽A與PBS組、medium組比較有明顯差異(P＜0.05)②肽B與PBS組、medium組比較有明顯差異(P＜0.01)③肽C與PBS組、medium組比較有明顯差異(P＜0.05)。
結(jié)果表明HSP65-SARS/3CL161-264能夠誘導(dǎo)小鼠記憶性的淋巴細胞，這些淋巴細胞在體外能夠識別我們通過預(yù)測合成的A、B、C3個表位肽。(圖16)實施例10人CTL的體外誘生(Ali方法)一、分離人外周血單核細胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇擦拭后，將其中的血移入于含PBS/EDTA緩沖液的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml混合液移入含12.5ml泛影葡胺的50ml試管中。注意不要破壞泛影葡胺和混合液的界面。
5.將上述含有混合液的試管離心，室溫，3000rpm/min(不使用剎車)20-25min。
6.離心后，汲取界面層細胞，移入一新離心管中。
7.向此含有分層細胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml后離心，1800rpm/min，4℃，離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時為1200rpm/min，4℃，離心7min。
8.收取試管底部的細胞團，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細胞。
9.將含有細胞的試管離心，1200rpm/min，4℃，離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細胞，取2只試管，各加6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細胞懸液緩慢移入(勿攪動Percol)含6ml冷的52％Percol試管中，在無剎車條件下2000rpm/min，4℃，離心20min。
12.汲取界面層細胞，移入一新試管中；將其他細胞移入另一管中進行HLA分型。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細胞，4℃，1300rpm/inm，無剎車離心10min。
14.以尼龍網(wǎng)濾過因死亡而成團的分層細胞。
15.計數(shù)單核細胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細胞1.以IMDM稀釋單核細胞，調(diào)整細胞數(shù)達2×106/ml。
2.向12孔板中每一個孔加入1ml細胞懸液和1mlIMDM。于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)2h。
3.2h后，用IMDM洗滌12孔板中的細胞，用手輕輕搖動12孔板，去掉每孔中未黏附的細胞。
4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM。
5.于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次IMDM培養(yǎng)液。
三、用重組HSP65-SARS/3CL161-264融合蛋白裝載樹突狀細胞1.于第五天將HSP65-SARS/3CL161-264直接加于未成熟的樹突狀細胞(DC)中使其終濃度達100μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.于第7d收獲未成熟的DC。
四、自人的外周血分離CD8+T淋巴細胞1.從人血漿白細胞層分離外周血單個核細胞(PBMC)。
2.以PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分離出的單個核細胞并計數(shù)。
3.根據(jù)得到的細胞數(shù)量準備抗體溶液抗體溶液是用PBS/EDTA/人血清緩沖液將抗體制備成1∶1000稀釋液，所含抗體為小鼠抗人anti-CD4，anti-CD14，anti-CD56，anti-CD19，anti-CD45RO，HLA-DR，γδ-TCR，每20×106個細胞需要1ml抗體溶液。
4.用抗體溶液重懸細胞。
5.將細胞與抗體混懸液置冷室內(nèi)或冰上震蕩培養(yǎng)30min。
6.離心收獲細胞，將與抗體結(jié)合的細胞重懸于25ml PBS/EDTA/人血清緩沖液中。
7.制備抗小鼠IgG磁珠，以PBS(pH7.4)將磁珠洗三次。
8.按照細胞/磁珠＝1/4的比例將細胞重懸于含磁珠的試管內(nèi)，置冰上于雙向搖床上培養(yǎng)20min。
9.離心收獲上清，上清中即含有所需要的CD8+T淋巴細胞，細胞計數(shù)。
10.于96孔U型板中加入2×105CD8+T淋巴細胞/孔。
五、用裝載重組融合蛋白HSP65-SARS/3CL161-264的樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞1.將CD8+T淋巴細胞和裝載了重組融合蛋白HSP65-SARS/3CL161-264的樹突狀細胞(DCs)混合在一起，培養(yǎng)6d-7d。
2.按照上述方法重復(fù)刺激CD8+T淋巴細胞兩次，每次培養(yǎng)6d。
3.3周以后，收獲SARS/3CL161-264特異性的CD8+T淋巴細胞。
六、T2細胞標記和SARS/3CL161-264特異性抗原肽的加載1.含有T2細胞的培養(yǎng)瓶中，加入51Cr使其終濃度達到1μCi/ml，將含有T2細胞和51Cr的培養(yǎng)瓶置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)1-2小時。期間偶而搖動混合幾次，然后以培養(yǎng)液洗滌細胞3次。
2.向含有已標記51Cr的T2細胞培養(yǎng)瓶中，分別加入10-100μg SARS/3CL161-264表位肽A、B、C，于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)1-2小時。
七、CTL分析
1.向96孔板中以不同的效靶比加入效應(yīng)細胞和靶細胞。
2.設(shè)立對照組自然釋放對照靶細胞50μl+培養(yǎng)基 100μl最大釋放對照靶細胞50μl+10％Triton X-100 100μl3.已加入效應(yīng)細胞和靶細胞的96孔板離心，350r/min，5min。
4.將96孔板置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)4-6h。
5.培養(yǎng)后使用Skkatron濾過系統(tǒng)收獲細胞懸液，每個樣品于γ-計數(shù)器上計數(shù)1min。
6.按以下公式計算釋放率(％)特異性殺傷％＝實驗孔(cpm)-自發(fā)釋放孔(cpm)/最大釋放孔(cpm)-自發(fā)釋放孔(cpm)％八、結(jié)果結(jié)果表明裝載重組融合蛋白HSP65-SARS/3CL161-264的樹突狀細胞能夠刺激CD8+T淋巴細胞，在體外特異性殺傷表達SARS/3CL161-264的腫瘤細胞(見圖17)。
序列表<110>北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司<120>熱休克蛋白65-人SARS冠狀病毒表位抗原重組融合蛋白(HSP65-SARS/3CL161-264)<160>16<210>1<211>312<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1tacatgcacc acatggaact gccgaccggt gttcacgcag gtactgacct ggaaggtaaa 60ttttatggtc cgttcgttga ccgtcagact gcacaggctg ctggtactga cactactatc 120actcttaatg ttctggcttg gctgtacgct gctgttatta acggtgaccg ctggttcctg 180aaccgcttta ctactaccct gaacgatttc aacctggttg ctatgaagta caactacgaa 240ccgctgactc aagaccacgt agacattctg ggtccactgt ctgctcagac tggtatcgct 300gttctggata tg 312<210>2<211>104<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr5 10 15Asp Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr20 25 30Ala Gln Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu35 40 45Ala Trp Leu Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu50 55 60Asn Arg Phe Thr Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met65 70 75Lys Tyr Asn Tyr Glu Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu80 85 90Gly Pro Leu Ser Ala Gln Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met95 100 104<210>3<211>333
<212>DNA<213>人工序列<400>3gatgagtaca tgcaccacat ggaactgccg accggtgttc acgcaggtac tgacctggaa 60ggtaaatttt atggtccgtt cgttgaccgt cagactgcac aggctgctgg tactgacact 120actatcactc ttaatgttct ggcttggctg tacgctgctg ttattaacgg tgaccgctgg 180ttcctgaacc gctttactac taccctgaac gatttcaacc tggttgctat gaagtacaac 240tacgaaccgc tgactcaaga ccacgtagac attctgggtc cactgtctgc tcagactggt 300atcgctgttc tggatatgga ggacgacgaa gac 333<210>4<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>4Asp Glu Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala5 10 15Gly Thr Asp Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg20 25 30Gln Thr Ala Gln Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn35 40 45Val Leu Ala Trp Leu Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp50 55 60Phe Leu Asn Arg Phe Thr Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val65 70 75Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp80 85 90Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp95 100 105Met Glu Asp Asp Glu Asp110 111<210>5<211>1977<212>DNA<213>人工序列<400>5atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac60gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120
aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc 480gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc 540tttgggctgc agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg 600tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg 660gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga 720gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg 780gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc 840gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag 960gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc 1020gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt 1080gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtcat caaggccggt 1140gccgccaccg acgtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat 1200gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg 1260gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg 1320aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc 1380gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt 1440gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg 1500ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac 1560aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc 1620catatggcta gcgaattcga tgagtacatg caccacatgg aactgccgac cggtgttcac 1680gcaggtactg acctggaagg taaattttat ggtccgttcg ttgaccgtca gactgcacag 1740gctgctggta ctgacactac tatcactctt aatgttctgg cttggctgta cgctgctgtt 1800attaacggtg accgctggtt cctgaaccgc tttactacta ccctgaacga tttcaacctg 1860gttgctatga agtacaacta cgaaccgctg actcaagacc acgtagacat tctgggtcca 1920ctgtctgctc agactggtat cgctgttctg gatatggagg acgacgaaga caagctt 1977poly-histag<210>6<211>657<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu5 10 15Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu20 25 30Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala35 40 45
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Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val395 400 405Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala410 415 420Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr425 430 435Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln440 445 450Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys455 460 465Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly470 475 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys485 490 495Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu500 505 510Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu515 520 525Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe530 535 540His Met Ala Ser Glu Phe Asp Glu Tyr Met His His Met Glu Leu545 550 555Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp Leu Glu Gly Lys Phe Tyr560 565 570Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln Ala Ala Gly Thr Asp575 580 585Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu Tyr Ala Ala Val590 595 600Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr Thr Thr Leu605 610 615Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu Pro Leu620 625 630Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln Thr635 640 645Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Glu Asp Asp Glu Asp poly-histag650 655 657<210>7<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>7actatcactc ttaatgttct ggcttggctg tacgctgctg ttattaacgg tgaccgc 57
<210>8<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>8gttgaaatcg ttcagggtag tagtaaagcg gttcaggaac cagcggtcac cgttaat 57<210>9<211>58<212>DNA<213>人工序列<400>9ttcgttgacc gtcagactgc acaggctgct ggtactgaca ctactatcac tcttaatg 58<210>10<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>10gtcttgagtc agcggttcgt agttgtactt catagcaacc aggttgaaat cgttcag 57<210>11<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>11gttcacgcag gtactgacct ggaaggtaaa ttttatggtc cgttcgttga ccgtcag57<210>12<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>12gataccagtc tgagcagaca gtggacccag aatgtctacg tggtcttgag tcagcgg57<210>13<211>58<212>DNA<213>人工序列<400>13
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權(quán)利要求
1.一種重組融合蛋白，該重組融合蛋白是由熱休克蛋白65(HSP65)和優(yōu)化的人SARS冠狀病毒表位抗原多肽融合而形成的融合蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的單拷貝人SARS冠狀病毒表位抗原含有選自下列的任一氨基酸序列(1)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(2)其氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的同源性大于80％；(3)其核苷酸編碼序列能夠在核酸雜交條件下與編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸編碼序列雜交；(4)包括那些對SEQ ID NO2所示的序列進行人工點突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進行改造后所得到的序列。
3.權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的單拷貝人SARS冠狀病毒表位抗原含有選自下列的任一核苷酸序列(1)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO1的核苷酸序列具有簡并性的核苷酸序列；(3)與SEQ ID NO1的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列；(4)與SEQ ID NO1的核苷酸序列能夠在核酸雜交條件下雜交的核苷酸序列；(5)包括那些對SEQ ID NO1所示的序列進行人工點突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進行改造后所得到的序列。
4.權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，所述的優(yōu)化的單拷貝人SARS冠狀病毒表位抗原含有選自下列的任一氨基酸序列(1)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(2)其氨基酸序列與SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的同源性大于80％；(3)其核苷酸編碼序列能夠在核酸雜交條件下與編碼SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的核苷酸編碼序列雜交；(4)包括那些對SEQ ID NO4所示的序列進行人工點突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進行改造后所得到的序列。
5.權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的優(yōu)化的單拷貝人SARS冠狀病毒表位抗原含有選自下列任一的核苷酸序列(1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO3的核苷酸序列具有簡并性的核苷酸序列；(3)與SEQ ID NO3的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列；(4)與SEQ ID NO3的核苷酸序列能夠在核酸雜交條件下雜交的核苷酸序列；(5)包括那些對SEQ ID NO3所示的序列進行人工點突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進行改造后所得到的序列。
6.權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其含有選自下列的任一氨基酸序列(1)SEQ ID NO6所示的氨基酸序列；(2)其氨基酸序列與SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的同源性大于80％；(3)其核苷酸編碼序列能夠在核酸雜交條件下與編碼SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的核苷酸編碼序列雜交；(4)包括那些對SEQ ID NO6所示的序列進行人工點突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進行改造后所得到的序列。
7.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的優(yōu)化的人SARS冠狀病毒表位抗原可以為1-5個拷貝。
8.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中HSP65位于該重組融合蛋白的氨基端，人SARS冠狀病毒表位抗原位于該重組融合蛋白的羧基端。
9.編碼權(quán)利要求1至8中任意一項所述的重組融合蛋白的核苷酸序列。
10.按照權(quán)利要求9所述的核苷酸序列，其含有選自下列的任一序列(1)SEQ ID NO5所示的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO5的核苷酸序列具有簡并性的核苷酸序列；(3)與SEQ ID NO5的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列；(4)與SEQ ID NO5的核苷酸序列能夠在核酸雜交條件下雜交的核苷酸序列；(5)包括那些對SEQ ID NO5所示的序列進行人工點突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進行改造后所得到的序列。
11.含有權(quán)利要求9-10中任一項的核苷酸序列的載體。
12.按照權(quán)利要求11的載體，其是質(zhì)粒載體。
13.含有權(quán)利要求9-10中任一項所述的核苷酸序列或權(quán)利要求11-12中任意一項所述載體的宿主細胞。
14.按照權(quán)利要求13的宿主細胞，其是原核細胞。
15.按照權(quán)利要求14的宿主細胞，其中所述原核細胞是大腸桿菌。
16.按照權(quán)利要求13的宿主細胞，其是真核細胞。
17.按照權(quán)利要求16的宿主細胞，其中所述真核細胞是B16細胞。
18.生產(chǎn)權(quán)利要求1-8中任意一項重組融合蛋白的方法，包括在合適條件下培養(yǎng)權(quán)利要求13-17中任意一項的宿主細胞，并回收所需的重組融合蛋白。
19.一種重組蛋白疫苗制品，其包括有效量的權(quán)利要求1-8中任一項所述的重組融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
20.權(quán)利要求1-8中任意一項的重組融合蛋白、權(quán)利要求9-10中任意一項的核苷酸序列、權(quán)利要求11-12中任意一項的載體和/或權(quán)利要求13-17中任意一項的宿主細胞在制備用于治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物和/或試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組融合蛋白，該重組融合蛋白是由熱休克蛋白65(heat shock protein，HSP65)和人SARS冠狀病毒表位抗原融合而形成的融合蛋白。本發(fā)明亦提供了該重組融合蛋白的氨基酸序列和編碼該重組融合蛋白的核苷酸序列，含有這種核苷酸序列的表達載體，含有該表達載體的宿主細胞及本發(fā)明中重組融合蛋白的制備方法以及含有該重組融合蛋白的疫苗制品及該重組融合蛋白在制備用于治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物和/或試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的重組融合蛋白在應(yīng)用于人體后可有效預(yù)防和/或治療人SARS冠狀病毒感染。
文檔編號A61P11/00GK1749277SQ20041007474
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者王麗穎, 田亞萍, 于永利 申請人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司