專利名稱：：重組rsv抗原的制作方法重組RSV抗原對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2007年12月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/016，524和2008年5月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/056，206的較早提交日期的權(quán)益，通過(guò)提及而將其公開(kāi)內(nèi)容收入本文。按照37C.F.R.§1.71(E)的版權(quán)通知本專利文件的公開(kāi)內(nèi)容的一部分含有受到版權(quán)保護(hù)的材料。版權(quán)擁有人不反對(duì)任何人拓制專利文件或?qū)＠_(kāi)內(nèi)容，就像其出現(xiàn)在專利商標(biāo)局專利文件或記錄中的那樣，但是在其它情況中保留無(wú)論什么的所有版權(quán)權(quán)利。
背景技術(shù)：
：本公開(kāi)內(nèi)容關(guān)注免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本公開(kāi)內(nèi)容涉及用于引發(fā)對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)特異性的免疫應(yīng)答的組合物和方法。人呼吸道合胞病毒(RSV)是小于6個(gè)月齡的嬰兒和懷孕期小于或等于35周的早產(chǎn)兒中下呼吸道感染(LRI)的最常見(jiàn)的全球性原因。RSV疾病譜包括從鼻炎(rhinitis)和耳炎(otitis)至肺炎(pneumonia)和細(xì)支氣管炎(bronchiolitis)的一大批呼吸癥狀，后兩種疾病與相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率有關(guān)。人是RSV唯一已知的貯主。自受污染的鼻分泌物擴(kuò)散病毒經(jīng)由大的呼吸飛沫發(fā)生，因此傳播需要與受感染個(gè)體或受污染表面緊密接觸。RSV能在玩具或其它物體上持續(xù)數(shù)小時(shí)，這解釋了醫(yī)院RSV感染的高比率，特別是在兒科病房中。估計(jì)全球每年的RSV感染和死亡數(shù)字分別是6400萬(wàn)和16萬(wàn)。僅在美國(guó)，估計(jì)RSV每年造成18，000至75，000例住院和90至1900例死亡。在溫帶氣候，RSV被較好地證明為急性LRI(包括細(xì)支氣管炎和肺炎)的每年冬季流行病的一個(gè)原因。在美國(guó)，幾乎所有兒童到兩歲時(shí)都感染過(guò)RSV。RSV相關(guān)LRI在其它方面健康的兒童中的發(fā)生率計(jì)算為生命前兩年中37/1000名兒童-年(小于6個(gè)月齡的嬰兒中45/1000名兒童-年)，而住院風(fēng)險(xiǎn)為6/1000名兒童-年(生命前6個(gè)月中每1000名兒童-年)。發(fā)生率在患有心肺疾病的兒童和早產(chǎn)兒中較高，在美國(guó)這些兒童構(gòu)成幾乎半數(shù)的RSV相關(guān)醫(yī)院收治。經(jīng)受由RSV引起的更嚴(yán)重的LRI的兒童以后具有升高的兒童哮喘發(fā)生率。這些研究表明患有嚴(yán)重LRI及其后遺癥的患者的護(hù)理花費(fèi)巨大的工業(yè)化國(guó)家普遍需要RSV疫苗及其使用。RSV還日益被公認(rèn)為老年人中流感樣病的發(fā)病率的一個(gè)重要原因。已經(jīng)嘗試了多種辦法來(lái)努力產(chǎn)生安全且有效的RSV疫苗，其在健康的和有風(fēng)險(xiǎn)的群體中產(chǎn)生持久的且保護(hù)性的免疫應(yīng)答。然而，迄今所評(píng)估的候選物無(wú)一證明作為疫苗用于預(yù)防RSV感染和/或減輕或預(yù)防RSV疾病(包括下呼吸道感染(LRI))是安全且有效的。發(fā)明概述本公開(kāi)內(nèi)容關(guān)注重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。更具體而言，本公開(kāi)內(nèi)容關(guān)注包含已經(jīng)進(jìn)行過(guò)修飾以穩(wěn)定三聚體融合前構(gòu)象的重組F蛋白的抗原。所公開(kāi)的重組抗原展現(xiàn)出卓越的免疫原性，而且作為針對(duì)RSV感染和/或疾病提供保護(hù)的免疫原性組合物(例如疫苗)的成分而被采用是特別有利的。還公開(kāi)了編碼重組抗原的核酸、含有所述抗原的免疫原性組合物、及用于生成和使用所述抗原的方法。附圖簡(jiǎn)述圖IA是突出顯示RSVF蛋白的結(jié)構(gòu)特征的示意圖。圖IB是例示性RSV融合前F(PreF)抗原的示意圖。圖2是一幅線圖，其顯示了對(duì)PreF的不對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)(asymmetricalfieldflowfractionation,AFF-MALS)分析的代表性結(jié)果。圖3是一幅柱形圖，其顯示了PreF抗原對(duì)人血清的中和抑制。圖4A和圖4B是柱形圖，其顯示了小鼠中響應(yīng)PreF抗原而引發(fā)的血清IgG滴度。圖5A和圖5B是柱形圖，其顯示了由PreF抗原引發(fā)的對(duì)RSV特異性的中和性抗體的滴度。圖6A和圖6B是顯示在小鼠中由RSVPreF抗原提供的針對(duì)攻擊的保護(hù)的圖。圖7是免疫和攻擊后評(píng)估BAL白細(xì)胞的圖。發(fā)明詳述遊由于宿主免疫應(yīng)答表現(xiàn)出在疾病的發(fā)病機(jī)制中起作用的實(shí)情而使開(kāi)發(fā)疫苗來(lái)預(yù)防RSV感染變得復(fù)雜。二十世紀(jì)60年代的早期研究顯示了，與未接種疫苗的對(duì)照受試者相比，接種用福爾馬林滅活的RSV疫苗的兒童在隨后暴露于病毒后遭受更嚴(yán)重的疾病。這些早期試驗(yàn)導(dǎo)致80%的接種疫苗者住院和2例死亡。增強(qiáng)的疾病嚴(yán)重性已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到再現(xiàn)，而且認(rèn)為其源自血清中和性抗體的水平不足、缺乏局部免疫、和2型輔助T細(xì)胞樣(Th2)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)過(guò)量，其伴有肺嗜酸粒細(xì)胞增多及IL-4和IL-5細(xì)胞因子的生成增加。比較而言，針對(duì)RSV感染提供保護(hù)的成功疫苗誘導(dǎo)Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答，其特點(diǎn)在于IL-2和Y-干擾素(IFN)的生成。本公開(kāi)內(nèi)容關(guān)注重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，其解決先前在疫苗中使用RSV抗原遇到的問(wèn)題，而且改善抗原的免疫學(xué)特性以及制備特性。本文所公開(kāi)的重組RSV抗原牽涉一種融合(F)蛋白類似物，其包含可溶性F蛋白多肽，該可溶性F蛋白多肽已經(jīng)進(jìn)行過(guò)修飾以穩(wěn)定F蛋白的融合前構(gòu)象，即成熟的裝配好的F蛋白在與宿主細(xì)胞膜融合前的構(gòu)象。為了清晰和簡(jiǎn)單，這些F蛋白類似物稱作“PreF”或“PreF抗原”。本文所公開(kāi)的PreF抗原以如下未預(yù)見(jiàn)到的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，即已經(jīng)通過(guò)摻入異源三聚化域來(lái)修飾的可溶性F蛋白類似物展現(xiàn)出改良的免疫原性特征，而且在對(duì)受試者體內(nèi)施用時(shí)是安全且高度保護(hù)性的。本文參照本領(lǐng)域中廣泛接受的術(shù)語(yǔ)和名稱來(lái)提供RSVF蛋白結(jié)構(gòu)的詳情，并在圖IA中示意性顯示。圖IB中提供了例示性PreF抗原的示意圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解，依照本文所提供的教導(dǎo)，可以修飾任何RSVF蛋白來(lái)穩(wěn)定融合前構(gòu)象。因此，為了便于理解指導(dǎo)PreF抗原生成的原則，各個(gè)結(jié)構(gòu)構(gòu)件會(huì)參照例示性F蛋白來(lái)指明，所述例示性F蛋白的多核苷酸和氨基酸序列分別在SEQIDNO:1和2中提供。類似地，在可適用的情況中，G蛋白抗原參照例示性G蛋白來(lái)描述，所述例示性G蛋白的多核苷酸和氨基酸序列分別在SEQIDNO:3和4中提供。參照F蛋白多肽的一級(jí)氨基酸序列(圖1A)，利用下列術(shù)語(yǔ)來(lái)描述PreF抗原的結(jié)構(gòu)特征。術(shù)語(yǔ)FO指全長(zhǎng)翻譯的F蛋白前體。FO多肽可以細(xì)分成由稱作ρ印27的居間肽分開(kāi)的F2域和Fl域。成熟過(guò)程中，F(xiàn)O多肽在位于F2和Fl之間且在pep27側(cè)翼的兩個(gè)弗林蛋白酶位點(diǎn)處經(jīng)歷蛋白水解切割。為了隨后的討論，F(xiàn)2域包含F(xiàn)蛋白氨基酸1-109的至少一部分，并且多達(dá)所有，而Fl域的可溶性部分包含F(xiàn)蛋白氨基酸137-526的至少一部分，并且多達(dá)所有。如上文所指明的，這些氨基酸位置(和本文指明的所有隨后的氨基酸位置)參照例示性F蛋白前體多肽(FO)SEQIDNO2給出。融合前F(或“PreF”)抗原是一種可溶性(即不是膜結(jié)合的)F蛋白類似物，其包含至少一處穩(wěn)定F蛋白的融合前構(gòu)象的修飾，從而RSV抗原保留F蛋白的融合前構(gòu)象的至少一個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位?？扇苄訤蛋白多肽包含RSVF蛋白的F2域和Fl域(但是不包含RSVF蛋白的跨膜域)。在例示性的實(shí)施方案中，F(xiàn)2域包含F(xiàn)蛋白的氨基酸26-105，而Fl域包含F(xiàn)蛋白的氨基酸137-516。然而，也可以使用更小的部分，只要穩(wěn)定化的PreF抗原的三維構(gòu)象得到維持。類似地，也可以使用包含額外結(jié)構(gòu)構(gòu)件的多肽(例如融合多肽)來(lái)替換例示性F2和Fl域，只要所述額外構(gòu)件不破壞三維構(gòu)象，或者在其它方面不會(huì)不利地影響穩(wěn)定性、生成或加工，或者降低抗原的免疫原性。F2和Fl域以N端至C端取向定位，設(shè)計(jì)成復(fù)制F蛋白類似物折疊和裝配成成熟的融合前構(gòu)象。為了增強(qiáng)生成，F(xiàn)2域之前可以有分泌信號(hào)肽，諸如天然F蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽，其選擇用于在要表達(dá)重組PreF抗原的宿主細(xì)胞中增強(qiáng)生成和分泌。通過(guò)引入一處或多處修飾，諸如一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、刪除或替代來(lái)穩(wěn)定PreF抗原(處于三聚體融合前構(gòu)象)。一種此類穩(wěn)定化修飾是添加包含異源穩(wěn)定化域的氨基酸序列。在例示性的實(shí)施方案中，所述異源穩(wěn)定化域是蛋白質(zhì)多聚化域。此類蛋白質(zhì)多聚化域的一個(gè)特別有利的例子是卷曲螺旋域，諸如異亮氨酸拉鏈域，其促進(jìn)多個(gè)具有此類域的多肽的三聚化。SEQIDN0:11中描述了一種例示性異亮氨酸拉鏈域。典型地，所述異源穩(wěn)定化域定位于Fl域的C端。任選地，經(jīng)由短的氨基酸接頭序列(諸如序列GG)將多聚化域連接至Fl域。所述接頭也可以是更長(zhǎng)的接頭(例如包括序列GG，諸如氨基酸序列GGSGGSGGS；SEQIDNO14)。許多構(gòu)象中性接頭是本領(lǐng)域中已知的，其可以在這種背景中使用而不破壞PreF抗原的構(gòu)象。另一種穩(wěn)定化修飾是消除弗林蛋白酶識(shí)別和切割位點(diǎn)，其位于天然FO蛋白中F2和Fl域之間?？梢酝ㄟ^(guò)刪除或替代弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)消除一個(gè)或兩個(gè)弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(位于第105位-第109位和第133位-第136位)，從而該蛋白酶不能將PreF多肽切割成其構(gòu)成域。任選地，也可以除去或用例如接頭肽替代居間pep27肽。另外，或任選地，可以除去或替代接近融合肽的非弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(例如第112位-第113位的金屬蛋白酶位點(diǎn))。穩(wěn)定化突變的另一個(gè)例子是將親水性氨基酸添加或替代入F蛋白的疏水域中。典型地，會(huì)在疏水區(qū)中添加帶電荷的氨基酸諸如賴氨酸或者用其替代中性殘基諸如亮氨酸。例如，可以將/用親水性氨基酸添加至或替代F蛋白胞外域的HRB卷曲螺旋域內(nèi)的疏水性或中性氨基酸。舉例而言，可以用帶電荷的氨基酸殘基諸如賴氨酸替代F蛋白的第512位處存在的亮氨酸。或者/另外，可以將/用親水性氨基酸添加至或替代F蛋白的HRA域內(nèi)的疏水性或中性氨基酸。例如，可以在PreF抗原的第105位-第106位處或者接近第105位-第106位處(例如在與參照SEQIDNO2的殘基105對(duì)應(yīng)的氨基酸后，諸如在氨基酸9105和106之間)插入一個(gè)或多個(gè)帶電荷的氨基酸諸如賴氨酸。任選地，可以在HRA和HRB域兩者中添加親水性氨基酸或者用親水性氨基酸替代?；蛘撸梢詣h除一個(gè)或多個(gè)疏水性殘基，只要PreF抗原的總體構(gòu)象沒(méi)有受到不利影響。可以個(gè)別地和/或與本文所公開(kāi)的任何其它穩(wěn)定化修飾組合地使用任何和/或所有穩(wěn)定化修飾來(lái)生成PreF抗原。在例示性的實(shí)施方案中，PreF蛋白包含如下多肽，其包含F(xiàn)2域和Fl域，F(xiàn)2域與Fl域之間沒(méi)有居間弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，并且有位于Fl域C端的異源穩(wěn)定化域(例如三聚化域)。在某些實(shí)施方案中，PreF抗原還包括一處或多處將/用親水性殘基添加和/或替代入疏水性HRA和/或HRB域中。任選地，PreF抗原具有至少一個(gè)非弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(諸如金屬蛋白酶位點(diǎn))的修飾。任選地，PreF抗原可以包括額外的多肽構(gòu)件，其至少包含RSVG蛋白的免疫原性部分。也就是說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，PreF抗原是包含F(xiàn)蛋白和G蛋白構(gòu)件兩者的嵌合蛋白。F蛋白構(gòu)件可以是上文所描述的任何PreF抗原，而G蛋白構(gòu)件選擇為RSVG蛋白的免疫學(xué)活性部分(多至和/或包括全長(zhǎng)G蛋白)。在例示性的實(shí)施方案中，G蛋白多肽包含G蛋白的氨基酸149-229(其中氨基酸位置參照SEQIDNO:4中表示的G蛋白序列指明)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，可以使用G蛋白的更小部分或片段，只要選定的部分保留較大G蛋白片段的優(yōu)勢(shì)免疫學(xué)特征。具體地，選定的片段保留在約氨基酸位置184-198(例如氨基酸180-200)之間的免疫學(xué)優(yōu)勢(shì)表位，而且長(zhǎng)得足以折疊和裝配成展現(xiàn)出免疫優(yōu)勢(shì)表位的穩(wěn)定構(gòu)象。也可以使用更長(zhǎng)的片段，例如自約氨基酸128至約氨基酸229，多達(dá)全長(zhǎng)G蛋白。只要選定的片段在嵌合蛋白的背景中折疊成穩(wěn)定的構(gòu)象，并且在宿主細(xì)胞中重組生成時(shí)不干擾生成、加工或穩(wěn)定性。任選地，經(jīng)由短的氨基酸接頭序列諸如序列GG將G蛋白構(gòu)件連接至F蛋白構(gòu)件。所述接頭也可以是更長(zhǎng)的接頭(諸如氨基酸序列GGSGGSGGS:SEQIDNO14)。許多構(gòu)象中性的接頭是本領(lǐng)域中已知的，其可以在不破壞PreF抗原構(gòu)象的情況中在這種背景中使用。任選地，G蛋白構(gòu)件可以包括在RSV疾病的動(dòng)物模型中減輕或預(yù)防增強(qiáng)性病毒疾病的一處或多處氨基酸替代。也就是說(shuō)，G蛋白可以包括如下氨基酸替代，從而在對(duì)選自公認(rèn)動(dòng)物模型(例如RSV的小鼠模型)的受試者施用包含PreF-G嵌合抗原的免疫原性組合物時(shí)，與接受疫苗(包括含有未修飾G蛋白的疫苗)的對(duì)照動(dòng)物相比，受試者展現(xiàn)出疫苗增強(qiáng)性病毒疾病(例如嗜酸粒細(xì)胞增多、中性白細(xì)胞增多)的癥狀減輕或沒(méi)有癥狀。疫苗增強(qiáng)性病毒疾病的減輕和/或預(yù)防在沒(méi)有佐劑的情況中施用免疫原性組合物時(shí)(而不是在例如存在強(qiáng)烈的Thl誘導(dǎo)性佐劑的情況中施用抗原時(shí))可以是明顯的。另外，在對(duì)人受試者施用時(shí)，氨基酸替代可以減輕或預(yù)防疫苗增強(qiáng)性病毒疾病。合適氨基酸替代的一個(gè)例子是用丙氨酸替換第191位的天冬酰胺(氨基酸191處Asn—Ala:N191A)。任選地，上文所描述的任何PreF抗原可以包含起有助于純化的作用的額外序列。一個(gè)例子是多組氨酸標(biāo)簽。若想要的話，可以自最終產(chǎn)物除去此類標(biāo)簽。在表達(dá)時(shí)，PreF抗原經(jīng)受分子內(nèi)折疊，并裝配成成熟蛋白，其包括多肽的多聚體。有利地，PreF抗原多肽裝配成三聚體，其類似于成熟的、加工過(guò)的RSVF蛋白的融合前構(gòu)象。為了引發(fā)針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答，可以在免疫原性組合物中有利地使用本文所公開(kāi)的任何PreF抗原(包括PreF-G抗原)。此類免疫原性組合物通常包含藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑諸如緩沖劑。為了增強(qiáng)施用后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，免疫原性組合物通常還包含佐劑。在用于引發(fā)針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性組合物(例如疫苗)的情況中，有利的是，組合物包含主要引發(fā)Thl免疫應(yīng)答的佐劑(Thl偏愛(ài)性佐劑)。典型地，佐劑選擇為適合于對(duì)要施用組合物的目標(biāo)群體施用。如此，根據(jù)應(yīng)用，佐劑選擇為適合于對(duì)例如新生兒或老年人施用。有利地，采用本文所描述的免疫原性組合物作為疫苗來(lái)減輕或預(yù)防感染RSV，而在施用或暴露于RSV后不誘導(dǎo)病理學(xué)應(yīng)答(諸如疫苗增強(qiáng)性病毒疾病)。在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含PreF抗原(諸如由SEQIDNO6顯示的例示性實(shí)施方案)和包含G蛋白構(gòu)件的第二多肽。G蛋白構(gòu)件通常至少包含G蛋白的氨基酸149-229。雖然可以使用G蛋白的更小部分，但是此類片段應(yīng)當(dāng)最低限度包含氨基酸184-198的免疫學(xué)優(yōu)勢(shì)表位。或者，G蛋白可以包含G蛋白的更大部分，諸如氨基酸128-229或130-230，任選地，作為更大蛋白質(zhì)諸如全長(zhǎng)G蛋白或嵌合多肽的元件。在其它實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含作為嵌合蛋白的PreF抗原，所述嵌合蛋白還包含G蛋白構(gòu)件(諸如由SEQIDNO8和10顯示的例示性實(shí)施方案)。此類嵌合PreF(或PreF-G)抗原的G蛋白構(gòu)件通常至少包含G蛋白的氨基酸149-229。如上文所指明的，也可以使用G蛋白的更小或更大片段(諸如氨基酸129-229或130-230)，只要免疫優(yōu)勢(shì)表位得到保留，并且PreF-G抗原的構(gòu)象沒(méi)有受到不利影響。任選地，免疫原性組合物還可以包含與RSV不同的病原性生物體的至少一種別的抗原。例如，病原性生物體是與RSV不同的病毒，諸如副流感病毒(PIV)、麻疹、乙肝、脊髓灰質(zhì)炎病毒、或流感病毒?；蛘撸≡陨矬w可以是細(xì)菌，諸如白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血菌、和肺炎球菌。編碼任何PreF抗原(包括PreF-G抗原)的重組核酸也是本公開(kāi)內(nèi)容的特征。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)化編碼PreF抗原的核酸的多核苷酸序列以在選定的宿主(諸如CHO細(xì)胞、其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞、或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中表達(dá)。因而，載體(包括表達(dá)載體，包括原核和真核表達(dá)載體)是本公開(kāi)內(nèi)容的特征。同樣地，包含此類核酸和載體的宿主細(xì)胞是本公開(kāi)內(nèi)容的特征。此類核酸也可以在對(duì)受試者施用的免疫原性組合物的背景中使用以引發(fā)對(duì)RSV特異性的免疫應(yīng)答。有利地，使用PreF抗原來(lái)預(yù)防和/或治療RSV感染。如此，本公開(kāi)內(nèi)容的另一方面關(guān)注一種用于引發(fā)針對(duì)RSV的免疫應(yīng)答的方法。該方法牽涉對(duì)受試者(諸如人或動(dòng)物受試者)施用免疫學(xué)有效量的含有PreF抗原的組合物。施用免疫學(xué)有效量的組合物引發(fā)對(duì)PreF抗原上存在的表位特異性的免疫應(yīng)答。此類免疫應(yīng)答可以包括B細(xì)胞應(yīng)答(例如中和性抗體的生成)和/或T細(xì)胞應(yīng)答(例如細(xì)胞因子的生成)。有利地，由PreF抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答包括對(duì)RSVF蛋白的融合前構(gòu)象上存在的至少一個(gè)構(gòu)象表位特異性的要件?？梢詫?duì)受試者施用PreF抗原和組合物，而在與RSV接觸后不增強(qiáng)病毒疾病。有利地，本文所公開(kāi)的PreF抗原和適當(dāng)配制的免疫原性組合物引發(fā)Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答，其減輕或預(yù)防感染RSV和/或減輕或預(yù)防感染RSV后的病理學(xué)應(yīng)答?？梢越?jīng)由多種路徑來(lái)施用免疫原性組合物，包括直接將PreF抗原放置得與上呼吸道的粘膜接觸的路徑，諸如鼻內(nèi)的?；蛘撸梢圆捎酶鼈鹘y(tǒng)的施用路徑，諸如肌內(nèi)施用路徑。如此，還涵蓋任何所公開(kāi)的RSV抗原(或核酸)在制備用于治療RSV感染(例如預(yù)防性處理或預(yù)防RSV感染)的藥物中的用途。因而，本公開(kāi)內(nèi)容提供了在藥物中使用的所公開(kāi)重組RSV抗原或免疫原性組合物，以及其用于預(yù)防或治療RSV相關(guān)疾病的用途。在下文描述和實(shí)施例中呈現(xiàn)了關(guān)于PreF抗原及其使用方法的其它詳情。術(shù)語(yǔ)為了便于審閱本公開(kāi)內(nèi)容的各個(gè)實(shí)施方案，提供了術(shù)語(yǔ)的下列解釋?？梢栽诒竟_(kāi)內(nèi)容的語(yǔ)境中提供別的術(shù)語(yǔ)和解釋。除非另有解釋，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本公開(kāi)內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同含義。分子生物學(xué)中的常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)的定義可以參見(jiàn)BenjaminLewin,GenesV,由OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(編)，TheEncyclopediaofMolecularBiology,由BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；及RobertA.Meyers(編)，MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,由VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。除非上下文另有明確指明，單數(shù)術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)所指物。類似地，除非上下文另有明確指明，詞語(yǔ)“或”意圖包括“和”。術(shù)語(yǔ)“多個(gè)/種”指兩個(gè)/種或更多個(gè)/種。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，對(duì)核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子質(zhì)量值是近似的，并且為了描述而提供。另外，關(guān)于物質(zhì)諸如抗原的濃度或水平給出的數(shù)值限制意圖為近似的。如此，若指明濃度是至少(例如)200pg，則意圖該濃度被理解為至少約(或“大約”或“”)200pg。雖然與本文所描述的方法和材料類似或等同的方法和材料可以在本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)踐或測(cè)試中使用，下文描述了合適的方法和材料。術(shù)語(yǔ)“包含”意味著“包括”。如此，除非上下文另有要求，詞語(yǔ)“包含”及其變化形式應(yīng)當(dāng)理解為暗示包括規(guī)定的化合物或組合物(例如核酸、多肽、抗原)或步驟，或者化合物或步驟的組，但是不排除任何其它化合物、組合物、步驟，或其組。縮寫(xiě)“例如”(e.g.)衍生自拉丁語(yǔ)exemplifygratia，并且在本文中用于指明非限制性例子。如此，縮寫(xiě)“例如”(e.g.)與術(shù)語(yǔ)“例如”(forexample)是同義的。呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒亞科(Pneumovirinae)、肺病毒屬(Pneumovirus)的一種病原性病毒。RSV的基因組是負(fù)義RNA分子，其編碼11種蛋白質(zhì)。RNA基因組與病毒N蛋白的緊密聯(lián)合形成包在病毒包膜內(nèi)部的核殼?；贕糖蛋白的抗原性差異，已經(jīng)描述了兩組人RSV毒株，即A和B組。迄今已經(jīng)分離出多種RSV毒株。由GenBank和/或EMBL登錄號(hào)指明的例示性毒株可以參見(jiàn)W02008114149，通過(guò)提及而將其收入本文，以便披露適合于在PreF抗原(包括嵌合PreF-G抗原)中使用，和與PreF抗原聯(lián)合使用的RSVF和G蛋白的核酸和多肽序列。別的RSV毒株可能會(huì)得到分離，并且涵蓋在RSV屬內(nèi)。類似地，RSV屬涵蓋通過(guò)遺傳漂變、或人工合成和/或重組，源于天然存在的變體(例如以前或以后鑒定的毒株)。術(shù)語(yǔ)“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”指具有RSV融合蛋白多肽的整個(gè)或部分氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。類似地，術(shù)語(yǔ)“G蛋白”或“G蛋白多肽”指具有RSV附著蛋白多肽的整個(gè)或部分氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。已經(jīng)描述了許多RSV融合和附著蛋白，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。W02008114149列出了此公開(kāi)內(nèi)容提交日時(shí)公眾可獲得的例示性F和G蛋白變體(例如天然存在的變體)?！白凅w”在提及核酸或多肽(例如RSVF或G蛋白核酸或多肽，或PreF核酸或多肽)時(shí)指與參照核酸或多肽不同的核酸或多肽。通常，變體與參照核酸或多肽之間的差異構(gòu)成與所指物相比小比例的差異。多肽或蛋白質(zhì)的“域”或“結(jié)構(gòu)域”指多肽或蛋白質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)限定的元件。例如，“三聚化域”指多肽內(nèi)促進(jìn)多肽裝配成三聚體的氨基酸序列。例如，三聚化域能促進(jìn)經(jīng)由與(具有相同或不同氨基酸序列的別的多肽的)其它三聚化域的聯(lián)合而裝配成三聚體。該術(shù)語(yǔ)也用于指編碼此類肽或多肽的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“天然的”和“天然存在的”指以與其在自然界中相同狀態(tài)存在的元件，諸如蛋白質(zhì)、多肽或核酸。也就是說(shuō)，該元件沒(méi)有進(jìn)行過(guò)人工修飾。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本公開(kāi)內(nèi)容的語(yǔ)境中，RSV蛋白或多肽有許多天然的/天然存在的變體，例如自不同的天然存在的RSV毒株或分離物獲得的。術(shù)語(yǔ)“多肽”指其中單體是經(jīng)由酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白質(zhì)”意圖涵蓋任何氨基酸序列，而且包括經(jīng)修飾的序列諸如糖蛋白。術(shù)語(yǔ)“多肽”明確意圖涵蓋天然存在蛋白質(zhì)，以及重組或合成生成的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“片段”提到多肽時(shí)指多肽的一部分(即亞序列)。術(shù)語(yǔ)“免疫原性片段”指多肽的保留全長(zhǎng)參照蛋白質(zhì)或多肽的至少一個(gè)優(yōu)勢(shì)免疫原性表位的所有片段。多肽內(nèi)的取向一般以N端至C端方向敘述，由各個(gè)氨基酸的氨基和羧基模塊的取向限定。多肽從N或氨基端朝向C或羧基端翻譯?！靶盘?hào)肽”是一種短的氨基酸序列(例如長(zhǎng)度為約18-25個(gè)氨基酸)，其將新合成的分泌性蛋白質(zhì)或膜蛋白引導(dǎo)至膜及穿過(guò)膜，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的。信號(hào)肽常常但不普遍位于多肽的N端，并且常常在蛋白質(zhì)穿過(guò)膜后被信號(hào)肽酶切去。信號(hào)序列通常含有三種常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)特征N端極性堿性區(qū)(η區(qū))、疏水性核心、和親水性c區(qū)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸序列”指長(zhǎng)度為至少10個(gè)堿基的核苷酸聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或任一核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包括單一和雙重形式DNA。“分離的多核苷酸”指與編碼序列兩者均不緊密相鄰的多核苷酸，它與所述編碼序列在正是衍生其的生物體的天然存在的基因組中緊密相鄰(一個(gè)在5’端上，而一個(gè)在3’端上)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼多肽。核酸的5’和3’方向通過(guò)參照各個(gè)核苷酸單元的連接性來(lái)限定，并依照脫氧核糖(或核糖)糖環(huán)的碳位置來(lái)指派。以5’至3’方向閱讀多核苷酸序列的信息(編碼)內(nèi)容?！爸亟M”核酸指具有非天然存在序列或者具有通過(guò)人工組合兩個(gè)在其它情況中分開(kāi)的序列區(qū)段生成的序列的核酸?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成或者，更常見(jiàn)地，通過(guò)人工操作分離的核酸區(qū)段，例如通過(guò)遺傳工程技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)此人工組合?！爸亟M”蛋白指由已經(jīng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞諸如細(xì)菌或真核細(xì)胞中的異源(例如重組)核酸編碼的蛋白質(zhì)?？梢栽诰哂心軌虮磉_(dá)由所導(dǎo)入核酸編碼的蛋白質(zhì)的信號(hào)的表達(dá)載體上導(dǎo)入核酸，或者可以將核酸整合入宿主細(xì)胞染色體中。術(shù)語(yǔ)“異源的”就核酸、多肽或其它細(xì)胞成分而言指明存在如下成分，其在自然界中通常找不到和/或其源自不同來(lái)源或物種。術(shù)語(yǔ)“純化”(例如就病原體或含有病原體的組合物而言)指自組合物除去成分(其存在不是想要的)的方法。純化是一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)，并且不要求從組合物除去不想要的成分的所有痕跡。在疫苗生產(chǎn)的語(yǔ)境中，純化包括諸如離心、透析、離子交換層析、和大小排阻層析、親和純化或沉淀等工藝。如此，術(shù)語(yǔ)“純化的”并不要求絕對(duì)純度；相反，其意圖為一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)。如此，例如純化的核酸制備物是指定蛋白質(zhì)比該核酸在其生成環(huán)境中(例如在細(xì)胞內(nèi)或在生化反應(yīng)室中)得到更多富集的核酸制備物?？梢约兓旧霞兊暮怂峄虻鞍踪|(zhì)的制備物，使得想要的核酸占制備物總核酸含量的至少50%。在某些實(shí)施方案中，基本上純的核酸會(huì)占制備物總核酸或蛋白質(zhì)含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更多。“分離的”生物學(xué)成分(諸如核酸分子、蛋白質(zhì)或細(xì)胞器)已經(jīng)與該成分天然存在的生物體的細(xì)胞中的其它生物學(xué)成分，諸如其它染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器基本上分開(kāi)或已經(jīng)基本上純化除去與該成分天然存在的生物體的細(xì)胞中的其它生物學(xué)成分，諸如其它染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。已經(jīng)“分離的”核酸和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸和蛋白質(zhì)。“抗原”指能在動(dòng)物中刺激抗體生成和/或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物、或物質(zhì)，包括注射、吸附、或別的方式導(dǎo)入動(dòng)物中的組合物。術(shù)語(yǔ)“抗原”包括所有相關(guān)抗原性表位。術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”指抗原上由B和/或T細(xì)胞應(yīng)答的位點(diǎn)。“優(yōu)勢(shì)抗原性表位”或“優(yōu)勢(shì)表位”指針對(duì)其產(chǎn)生功能上顯著的宿主免疫應(yīng)答(例如抗體應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答)的那些表位。如此，關(guān)于針對(duì)病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，優(yōu)勢(shì)抗原性表位指在被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別時(shí)產(chǎn)生保護(hù)免于由該病原體引起的疾病的那些抗原性模塊。術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞表位”指在與合適的MHC分子結(jié)合時(shí)被T細(xì)胞特異性結(jié)合(經(jīng)由T細(xì)胞受體)的表位?！癇細(xì)胞表位”指被抗體(或B細(xì)胞受體分子)特異性結(jié)合的表位。“佐劑”指以非特異性方式增強(qiáng)免疫應(yīng)答產(chǎn)生的藥劑。常見(jiàn)的佐劑包括將抗原吸附至其上的礦物(明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁)的懸液液；乳劑，包括油包水、和水包油(及其變體，包括雙重乳劑和可逆乳劑)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸(諸如CpG寡核苷酸)、脂質(zhì)體、Toll樣受體激動(dòng)劑(特別是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激動(dòng)劑)，和此類成分的各種組合?！懊庖咴越M合物”指適合于對(duì)人或動(dòng)物受試者施用(例如在實(shí)驗(yàn)背景中)的物質(zhì)組合物，其能夠引發(fā)特異性免疫應(yīng)答，例如針對(duì)病原體諸如RSV。因此，免疫原性組合物包含一種或多種抗原(例如多肽抗原)或抗原性表位。免疫原性組合物還可以包含一種或多種能夠引發(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的別的成分，諸如賦形劑、載體、和/或佐劑。在某些例子中，施用免疫原性組合物來(lái)引發(fā)保護(hù)受試者免于由病原體誘導(dǎo)的癥狀或狀況的免疫應(yīng)答。在一些情況中，在受試者被暴露于病原體后通過(guò)抑制病原體(例如RSV)的復(fù)制來(lái)預(yù)防(或減輕或改善)由病原體引起的癥狀或疾病。在本公開(kāi)內(nèi)容的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)免疫原性組合物應(yīng)當(dāng)理解成涵蓋意圖用于對(duì)受試者或受試者群體施用以引發(fā)針對(duì)RSV的保護(hù)性或姑息性免疫應(yīng)答的組合物(即疫苗組合物或疫苗)?！懊庖邞?yīng)答”指免疫系統(tǒng)細(xì)胞諸如B細(xì)胞、T細(xì)胞、或單核細(xì)胞對(duì)刺激物的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以是B細(xì)胞應(yīng)答，其導(dǎo)致特異性抗體諸如抗原特異性中和性抗體的生成。免疫應(yīng)答也可以是T細(xì)胞應(yīng)答，諸如⑶4+應(yīng)答或⑶8+應(yīng)答。在一些情況中，應(yīng)答對(duì)特定抗原是特異性的(即“抗原特異性應(yīng)答”)。若抗原衍生自病原體，則抗原特異性應(yīng)答是“病原體特異性應(yīng)答”?！氨Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答”指抑制病原體的有害功能或活性、減輕病原體感染、或減輕源于病原體感染的癥狀(包括死亡)的免疫應(yīng)答。可以例如通過(guò)在噬斑減少測(cè)定法或ELISA中和測(cè)定法中抑制病毒復(fù)制或噬斑形成，或者通過(guò)在體內(nèi)測(cè)量對(duì)病原體攻擊的抗性來(lái)測(cè)量保護(hù)性免疫應(yīng)答?！癟hl”偏愛(ài)性免疫應(yīng)答的特征在于存在生成IL-2和IFN-γ的⑶4+Τ輔助細(xì)胞，并且如此，特征在于分泌或存在IL-2和IFN-Y。比較而言，“Th2”偏愛(ài)性免疫應(yīng)答的特征在于生成IL-4、IL-5、和IL-13的CD4+輔助細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)。“免疫學(xué)有效量”是用于在受試者中引發(fā)針對(duì)組合物或針對(duì)組合物中抗原的免疫應(yīng)答的組合物(典型地，免疫原性組合物)數(shù)量。通常，想要的結(jié)果是產(chǎn)生抗原(例如病原體)特異性免疫應(yīng)答，其能夠或促成保護(hù)受試者免于所述病原體。然而，為了獲得針對(duì)病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，可需要免疫原性組合物的多次施用。如此，在本公開(kāi)內(nèi)容的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)免疫學(xué)有效量涵蓋與先前或隨后施用聯(lián)合促成獲得保護(hù)性免疫應(yīng)答的分?jǐn)?shù)劑量。形容詞“藥學(xué)可接受的”指明所指物適合于對(duì)受試者(例如人或動(dòng)物受試者)施用。Remington’sPharmaceuticalSciences,Ε.W.MartiniMackPublishingCo.，Easton，PA，第15版(1975)描述了適合于治療性和/或預(yù)防性組合物(包括免疫原性組合物)的藥學(xué)投遞的組合物和配制劑(包括稀釋劑)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控”提到應(yīng)答諸如免疫應(yīng)答時(shí)指改變或變更應(yīng)答的開(kāi)始、幅度、持續(xù)時(shí)間或特征。調(diào)控免疫應(yīng)答的藥劑在其施用后改變下列至少一項(xiàng)免疫應(yīng)答的開(kāi)始、幅度、持續(xù)時(shí)間或特征，或者與參照藥劑相比改變下列至少一項(xiàng)開(kāi)始、幅度、持續(xù)時(shí)間或特征。術(shù)語(yǔ)“減輕”是一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)，從而若應(yīng)答或狀況在施用藥劑后得到定量減弱，或者若與參照藥劑相比，它在施用藥劑后得到減弱，則所述藥劑減輕應(yīng)答或狀況。類似地，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”不必然意味著藥劑完全消除應(yīng)答或狀況，只要應(yīng)答或狀況的至少一項(xiàng)特征得到消除。如此，減輕或預(yù)防感染或應(yīng)答諸如病理學(xué)應(yīng)答(例如疫苗增強(qiáng)性病毒疾病)的免疫原性組合物可以但不必然完全消除此類感染或應(yīng)答，只要所述感染或應(yīng)答可測(cè)量地減弱例如至少約50%，諸如至少約70%，或約80%，或甚至約90%(即減弱至10%或更小)的感染或應(yīng)答(在沒(méi)有藥劑的情況中，或者與參照藥劑相比)?！笆茉囌摺敝富畹亩嗉?xì)胞脊椎動(dòng)物生物體。在本公開(kāi)內(nèi)容的語(yǔ)境中，受試者可以是實(shí)驗(yàn)受試者，諸如非人動(dòng)物，例如小鼠、棉鼠、或非人靈長(zhǎng)類。或者，受試者可以是人受試者。PreF抗原在自然界中，RSVF蛋白表達(dá)為長(zhǎng)度為574個(gè)氨基酸的單一多肽前體，稱作F0。在體內(nèi)，F(xiàn)O在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中寡聚化，并且在兩種保守的弗林蛋白酶共有序列(弗林蛋白酶切割位點(diǎn))，即RARR109(SEQIDNO15)和RKRR136(SEQIDNO16)處被弗林蛋白酶蛋白水解加工以產(chǎn)生由兩個(gè)二硫化物連接的片段組成的寡聚物。這些片段中較小者稱作F2，并且源于FO前體的N端部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)可的是，縮寫(xiě)F0、Fl和F2在科學(xué)文獻(xiàn)中通常稱作FpF1和&。較大的、C端Fl片段經(jīng)由疏水性氨基酸序列錨定膜中的F蛋白，所述疏水性氨基酸與24個(gè)氨基酸的胞質(zhì)尾部相鄰。三個(gè)F2-F1二聚物結(jié)合以形成成熟的F蛋白，其采用亞穩(wěn)性融原前(prefusogenic)(“融合前”)構(gòu)象，該構(gòu)象在與靶細(xì)胞膜接觸后得到觸發(fā)以經(jīng)受構(gòu)象變化。此構(gòu)象變化暴露疏水性序列(稱為融合肽)，其與宿主細(xì)胞膜結(jié)合，并促進(jìn)病毒或受感染細(xì)胞的膜與靶細(xì)胞膜融合。Fl片段至少含有兩種七價(jià)重復(fù)域，稱作HRA和HRB，并且分別位于融合肽和跨膜錨定域附近。處于融合前構(gòu)象，F(xiàn)2-F1二聚物形成球狀頭部和莖結(jié)構(gòu)，其中HRA域在球狀頭部中處于分段的(延伸的)構(gòu)象。比較而言，HRB域形成自頭部區(qū)域延伸的三鏈卷曲螺旋莖。從融合前向融合后構(gòu)象轉(zhuǎn)變期間，HRA域倒塌(collapse)，并使其接近HRB域以形成反平行的六螺旋束。處于融合后狀態(tài)，融合肽和跨膜域并列以便于膜融合。雖然上文所提供的構(gòu)象描述基于晶體學(xué)數(shù)據(jù)的分子建模，但是可以在不訴諸于晶體學(xué)的情況中監(jiān)測(cè)融合前與融合后構(gòu)象之間的結(jié)構(gòu)差別。例如，可以使用電子顯微照相術(shù)來(lái)區(qū)別融合前和融合后(或者稱作融原前和融原)構(gòu)象，如由Calder等，Virology,271122-131(2000)和Morton等，Virology,311:275_288所演示的，為了它們的技術(shù)教導(dǎo)，通過(guò)提及而將它們收入本文。也可以通過(guò)脂質(zhì)體結(jié)合測(cè)定法來(lái)區(qū)別融合前構(gòu)象與融原(融合后)構(gòu)象，如由Connolly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10317903-17908(2006)所描述的，為了其技術(shù)教導(dǎo)，也通過(guò)提及而將其收入本文。另外，可以使用如下抗體(例如單克隆抗體)來(lái)區(qū)別融合前與融原構(gòu)象，所述抗體特異性識(shí)別RSVF蛋白的融合前或融原形式之一種或另一種上存在，而另一種形式上不存在的構(gòu)象表位。此類構(gòu)象表位可以是由于分子表面上抗原決定簇的優(yōu)先暴露。或者，構(gòu)象表位可以源于線性多肽中非連續(xù)氨基酸的并列。將本文所公開(kāi)的PreF抗原設(shè)計(jì)成穩(wěn)定并維持RSVF蛋白的融合前構(gòu)象，從而在所表達(dá)蛋白質(zhì)的群體中，實(shí)質(zhì)部分的所表達(dá)蛋白質(zhì)群體處于融原前(融合前)構(gòu)象(例如如通過(guò)結(jié)構(gòu)和/或熱力學(xué)建模所預(yù)測(cè)的或者如通過(guò)上文所公開(kāi)的一種或多種方法所評(píng)估的)。將穩(wěn)定化修飾引入天然的(或合成的)F蛋白諸如SEQIDNO:2的例示性F蛋白中，使得F蛋白的融合前構(gòu)象的主要免疫原性表位在將PreF抗原導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞外環(huán)境中后(例如在體內(nèi)，例如在對(duì)受試者施用后)得到維持。第一，可以在構(gòu)建體的C端末端放置異源穩(wěn)定化域以替換FO多肽的膜錨定域。預(yù)測(cè)此穩(wěn)定化域補(bǔ)償HRB不穩(wěn)定性，有助于穩(wěn)定融合前構(gòu)象異構(gòu)體。在例示性的實(shí)施方案中，異源穩(wěn)定化域是蛋白質(zhì)多聚化域。此類蛋白質(zhì)多聚化域的一個(gè)特別有利的例子是三聚化域。例示性三聚化域折疊成卷曲螺旋，其促進(jìn)裝配成具有此類卷曲螺旋域的多個(gè)多肽的三聚體。三聚化域的一個(gè)有利的例子是異亮氨酸拉鏈。一種例示性異亮氨酸拉鏈域是由Harbury等Science2621401-1407(1993)所描述的經(jīng)工程化改造的酵母GCN4異亮氨酸變體。以SEQIDNO:11表示一種合適的異亮氨酸拉鏈域的序列，雖然保留形成卷曲螺旋穩(wěn)定化域的能力的此序列變體是同樣合適的。備選的穩(wěn)定化卷曲螺旋三聚化域包括TRAF2(GENBANK登錄號(hào)Q12933[gi=23503103]；氨基酸299-348)；血小板反應(yīng)蛋白1(登錄號(hào)P07996[gi135717]；氨基酸291-314)；胞外基質(zhì)蛋白_4(登錄號(hào)095460[gi14548117]；氨基酸594-618)；CMP(胞外基質(zhì)蛋白-1)(登錄號(hào)NP_002370[gi=4505111]；氨基酸463-496)；HSF1(登錄號(hào)AAX42211[gi61362386]；氨基酸165-191)；和Cubilin(登錄號(hào)NP_001072[gi=4557503]；氨基酸104-138)。預(yù)期合適的三聚化域?qū)е聦?shí)質(zhì)部分的所表達(dá)蛋白質(zhì)裝配成三聚體。例如，至少50%的具有三聚化域的重組PreF多肽會(huì)裝配成三聚體(例如如通過(guò)AFF-MALS所評(píng)估的)。典型地，至少60%，更有利地，至少70%，并且最想要地，至少約75%或更多的所表達(dá)多肽以三聚體存在。為了使HRB更穩(wěn)定，可以用賴氨酸替代位于PreF的第512位(相對(duì)于天然的FO蛋白)的亮氨酸殘基(例示性PreF抗原多肽SEQIDNO6的L482K)。此替代改善卷曲螺旋疏水性殘基周期性。類似地，可以在第105位氨基酸后添加賴氨酸。第二，可以除去ρ印27。對(duì)處于融合前狀態(tài)的RSVF蛋白的結(jié)構(gòu)模型的分析提示pep27在Fl和F2之間產(chǎn)生大的無(wú)約束環(huán)。此環(huán)并不促成融合前狀態(tài)的穩(wěn)定化，并且在弗林蛋白酶切割天然蛋白質(zhì)后被除去。第三，可以刪除兩個(gè)弗林蛋白酶切割基序之一或兩者。憑借此設(shè)計(jì)，不從F2切割融合肽，這阻止從融合前構(gòu)象異構(gòu)體的球狀頭部釋放和與鄰近膜的可接近性。預(yù)測(cè)融合肽與膜界面之間的相互作用是融合前狀態(tài)不穩(wěn)定性的主要問(wèn)題。融合過(guò)程期間，融合肽與靶膜之間的相互作用導(dǎo)致融合肽從球狀頭部結(jié)構(gòu)內(nèi)暴露，增強(qiáng)融合前狀態(tài)的不穩(wěn)定性，并折疊成融合后構(gòu)象異構(gòu)體。此構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)膜融合過(guò)程。預(yù)測(cè)除去兩個(gè)弗林蛋白酶切割位點(diǎn)之一或兩者阻止膜與融合肽N端部分的可接近性，這穩(wěn)定融合前狀態(tài)。任選地，還可以通過(guò)例如替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)除去至少一個(gè)非弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。例如，實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示，在有助于某些金屬蛋白酶進(jìn)行切割的條件下，可以在氨基酸110-118附近切割PreF抗原(例如其中切割在PreF抗原的氨基酸112和113之間；在參照F蛋白多肽SEQIDNO:2的第142位亮氨酸和第143位甘氨酸之間發(fā)生)。因而，對(duì)此區(qū)域內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾能降低對(duì)PreF抗原的切割。例如，可以用不同氨基酸諸如異亮氨酸或色氨酸替代第112位亮氨酸。或者/另外，可以用絲氨酸或丙氨酸替代第113位甘氨酸。天然的F蛋白多肽可以選自RSVA或RSVB毒株的任何F蛋白，或者選自其變體(如上文所定義的)。在某些例示性的實(shí)施方案中，F(xiàn)蛋白多肽是以SEQIDNO:2表示的F蛋白。為了便于理解本公開(kāi)內(nèi)容，所有氨基酸殘基位置(不管毒株)相對(duì)于(即氨基酸殘基位置對(duì)應(yīng)于)例示性F蛋白的氨基酸位置給出。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過(guò)使用容易地可獲得且公知的比對(duì)算法(諸如BLAST，例如使用缺省參數(shù))來(lái)比對(duì)選定RSV毒株的氨基酸序列與例示性序列的氨基酸序列，從而容易地確定任何其它RSVA或B毒株的可比氨基酸位置。W02008114149中披露了來(lái)自不同RSV毒株的F蛋白多肽的許多別的例子(為了提供RSVF和G蛋白序列的別的例子，通過(guò)提及而將其收入本文)。別的變體可以經(jīng)由遺傳漂變生成，或者可以使用定點(diǎn)或隨機(jī)誘變，或者通過(guò)重組兩種或更多種先前存在的變體來(lái)人工生成。此類別的變體在本文所公開(kāi)的PreF(和PreF-G)抗原的背景中也是合適的。在選擇F蛋白的F2和Fl域時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，包含整個(gè)F2和/或Fl域不是嚴(yán)格必要的。典型地，構(gòu)象考慮在選擇F2域的亞序列(或片段)時(shí)是重要的。如此，F(xiàn)2域通常包含F(xiàn)2域中促進(jìn)多肽裝配和穩(wěn)定性的部分。在某些例示性的變體中，F(xiàn)2域包含氨基酸26-105。然而，在長(zhǎng)度上具有微小修飾(通過(guò)添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸)的變體也是有可能的。典型地，至少選擇Fl域的亞序列(或片段)，并將其設(shè)計(jì)成維持包含F(xiàn)蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)表位的穩(wěn)定構(gòu)象。例如，一般想要選擇Fl多肽域中包含氨基酸262-275(帕利珠單抗(palivizumab)中和)和423-436(Centocor的chlOlF單抗)的區(qū)域中由中和性抗體識(shí)別的表位的亞序列。另外，想要包含T細(xì)胞表位，例如在氨基酸328-355的區(qū)域中。最常見(jiàn)地，作為Fl亞基的單一連續(xù)部分(例如跨越氨基酸262-436)，但是表位可以在包含作為以穩(wěn)定構(gòu)象裝配的不連續(xù)元件的這些免疫優(yōu)勢(shì)表位的合成序列中得到保留。如此，F(xiàn)l域多肽17包含RSVF蛋白多肽的至少約氨基酸262-436。在本文提供的一個(gè)非限制性例子中，F(xiàn)l域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137至516。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，別的更短的亞序列可以任憑從業(yè)人員使用。在選擇F2或Fl域的亞序列時(shí)(或者如會(huì)在下文就某些PreF-G抗原的G蛋白構(gòu)件進(jìn)行討論)，在構(gòu)象考慮外，基于包含別的免疫原性表位來(lái)選擇序列(例如變體、亞序列等)可以是想要的。例如，可以使用本領(lǐng)域中已知的錨基序或其它方法諸如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或多項(xiàng)式確定來(lái)鑒定別的τ細(xì)胞表位，參見(jiàn)例如RANKPEP(在萬(wàn)維網(wǎng)上于mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html可獲得)；ProPredI(在萬(wàn)維網(wǎng)上于:imtech.res.in/raghava/propredl/index,html可獲得)；Bimas(在萬(wàn)維網(wǎng)上于:www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html可獲得)；和SYFPEITH(在萬(wàn)維網(wǎng)上于syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm可獲得)。例如，使用算法來(lái)測(cè)定肽的“結(jié)合閾值”，并選擇那些具有給予它們MHC或抗體以某種親和力結(jié)合的高概率的得分的。算法或是基于對(duì)MHC結(jié)合特定位置處的特定氨基酸的影響、對(duì)抗體結(jié)合特定位置處的特定氨基酸的影響、或是對(duì)結(jié)合含有基序的肽中的特定替代的影響。在免疫原性肽的背景內(nèi)，“保守殘基”指在肽中特定位置處以比通過(guò)隨機(jī)分布會(huì)預(yù)期的頻率顯著更高的頻率出現(xiàn)的殘基。錨殘基是保守殘基，其提供與MHC分子的接觸點(diǎn)。由此類預(yù)測(cè)方法鑒定出的T細(xì)胞表位可以通過(guò)測(cè)量它們對(duì)特定MHC蛋白的結(jié)合及通過(guò)其在MHC蛋白的背景中呈遞時(shí)刺激T細(xì)胞的能力來(lái)確認(rèn)。有利地，PreF抗原(包括PreF-G抗原，如下文所討論的)包括與表達(dá)系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽，例如哺乳動(dòng)物或病毒信號(hào)肽，諸如RSVFO天然信號(hào)序列(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-25或SEQIDNO:6的氨基酸1-25)。典型地，信號(hào)肽選擇為與選擇用于重組表達(dá)的細(xì)胞相容。例如，可以用信號(hào)肽(諸如桿狀病毒信號(hào)肽，或蜂毒肽信號(hào)肽)替代以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)。合適的植物信號(hào)肽是本領(lǐng)域中已知的，若植物表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選的話。許多例示性信號(hào)肽是本領(lǐng)域中已知的(參見(jiàn)例如，參見(jiàn)Zhang和Henzel，ProteinSci.，132819-2824(2004)，其描述了許多人信號(hào)肽)，并列入例如SPdb信號(hào)肽數(shù)據(jù)庫(kù)，其包括古細(xì)菌、原核生物和真核生物的信號(hào)序列(http://proline,bic.nus.edu.sg/spdb/)。任選地，任何前述抗原可以包含別的序列或標(biāo)簽諸如His標(biāo)簽來(lái)促進(jìn)純化。任選地，PreF抗原可以包含別的免疫原性構(gòu)件。在某些特別有利的實(shí)施方案中，PreF抗原包含RSVG蛋白抗原性構(gòu)件。具有PreF和G構(gòu)件的例示性嵌合蛋白包括下列PreF_Vl(以SEQIDNO:7禾口8表示)和PreF_V2(以SEQIDNO9禾口10表示)。在PreF-G抗原中，在構(gòu)建體的C端末端處添加G蛋白的抗原性部分(例如截短的G蛋白，諸如氨基酸殘基149-229)。典型地，經(jīng)由柔性接頭序列將G蛋白構(gòu)件連接至F蛋白構(gòu)件。例如，在例示性PreF_Vl設(shè)計(jì)中，通過(guò)-GGSGGSGGS-接頭(SEQIDN0:14)將G蛋白連接至PreF構(gòu)件。在PreF_V2設(shè)計(jì)中，接頭較短。代替具有-GGSGGSGGS-接頭(SEQIDNO14)，PreF_V2具有用于接頭的2個(gè)甘氨酸(-GG-)。在存在的情況中，G蛋白多肽域可以包含選自任何RSVA或RSVB毒株的G蛋白的整個(gè)或部分。在某些例示性的實(shí)施方案中，G蛋白是以SEQIDNO:4表示的G蛋白(或者與其95%相同)。合適的G蛋白序列的別的例子可以參見(jiàn)W02008114149(通過(guò)提及而將其收入本文)。G蛋白多肽構(gòu)件選擇為至少包含G蛋白中保留免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位(例如在氨基酸183-197的區(qū)域中)的亞序列(或片段)，諸如包含天然G蛋白的氨基酸151-229、149-229、或128-229的G蛋白片段。在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，G蛋白多肽是天然G蛋白多肽中包含天然G蛋白多肽氨基酸殘基149至229整個(gè)或部分的亞序列(或片段)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易領(lǐng)會(huì)的是，也可以使用更長(zhǎng)或更短的G蛋白部分，只要選定的部分不在構(gòu)象上使PreF-G抗原不穩(wěn)定或者破壞PreF-G抗原的表達(dá)、折疊或加工。任選地，G蛋白域包含第191位的氨基酸替代，先前已經(jīng)顯示了其牽涉減輕和/或預(yù)防以與福爾馬林滅活的RSV疫苗有關(guān)的嗜酸粒細(xì)胞增多為特征的增強(qiáng)性疾病。天然存在的和替代的(N191A)G蛋白的屬性的全面描述可以參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)文本No.2005/0042230，通過(guò)提及而將其收入本文。例如，關(guān)于選擇與天然存在的毒株對(duì)應(yīng)的序列，一個(gè)或多個(gè)域可以在序列上對(duì)應(yīng)于RSVA或B毒株，諸如稱作A2或Long的常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)室分離物，或任何其它天然存在的毒株或分離物(如上述W02008114149中所披露的)。在此類天然存在的和分離的變體外，也可以在PreF(包括PreF-G)抗原的背景中采用與上述序列共享序列相似性的經(jīng)工程化改造的變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，PreF抗原多肽(和多核苷酸序列，如下文所描述的)之間的相似性就多肽(和一般而言，核苷酸序列)而言可以關(guān)于序列間的相似性(在其它情況中稱為序列同一性)表示。序列同一性常常關(guān)于百分比同一性(或相似性)測(cè)量；百分比越高，兩種序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)越相似。一般而言，兩種氨基酸(或多核苷酸)序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)越相似，源于折疊和裝配的更高級(jí)結(jié)構(gòu)越相似。PreF多肽(和多核苷酸)序列的變體通常具有一處或少量氨基酸刪除、添加或替代，但是仍然會(huì)共享非常高百分比的其氨基酸，和一般而言其多核苷酸序列。更重要的是，變體保留本文所公開(kāi)的參照序列的結(jié)構(gòu)屬性和如此，構(gòu)象屬性。測(cè)定序列同一性的方法是本領(lǐng)域中公知的，并且可適用于PreF抗原多肽，以及編碼它們的核酸(例如如下文所描述的)。多種程序和比對(duì)算法記載于Smith和Waterman，Adv.App1.Math.2:482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443，1970；Higgins和Sharp,Gene73:237，1988；Higgins和Sharp,CABIOS5151,1989；Corpet等，NucleicAcidsResearch1610881，1988；及Pearson禾口Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444，1988。Altschul等，NatureGenet.6:119，1994呈現(xiàn)了序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)考慮。NCBI基本的局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST)(八1仏(^111等，工1101.8丨01.215=403,1990)可獲自數(shù)個(gè)來(lái)源，包括(美國(guó))國(guó)家生物技術(shù)信;|、4^l>(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI,Bethesda,MD)特網(wǎng)上，用于與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx組合使用。如何使用此程序來(lái)測(cè)定序列同一性的描述在因特網(wǎng)上NCBI網(wǎng)站上可獲得。在一些例子中，PreF抗原相對(duì)于衍生其的天然存在的毒株的氨基酸序列具有一處或多處氨基酸修飾(例如在上述穩(wěn)定化修飾外)。此類差異可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、刪除或替代。變體通常相差不超過(guò)約1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%的氨基酸殘基。例如，與例示性PreF抗原多肽序列SEQIDNO:6、8、和/或10相比，變體PreF抗原(包括PreF-G)多肽序列可以包含1、或2、或多至5、或多至約10、或多至約15、或多至約50、或多至約100處氨基酸的差異。如此，RSVF或G蛋白，或PreF抗原(包括PreF-G抗原)背景中的變體通常與參照蛋白(例如SEQIDN0:2、4、6、8和/或10中顯示的參照序列，或本文所公開(kāi)的任何例示性PreF抗原)共享至少80%、或85%，更常見(jiàn)地，至少約90%或更多，諸如95%，或甚至98%或99%序列同一性。作為本公開(kāi)內(nèi)容特征包括的別的變體是包含選自W02008114149中所披露的天然存在變體的核苷酸或氨基酸序列整個(gè)或部分的PreF抗原(包括PreF-G抗原)。別的變體可以經(jīng)由遺傳漂變生成，或者可以使用定點(diǎn)或隨機(jī)誘變，或者通過(guò)重組兩種或更多種先前存在的變體來(lái)人工生成。此類別的變體在本文所公開(kāi)的PreF(和PreF-G)抗原的背景中也是合適的。例如，修飾可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸(諸如兩個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、四個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、多至約十個(gè)氨基酸，或更多個(gè))的替代，其不改變所得PreF抗原的構(gòu)象或免疫原性表位?；蛘?另外，修飾可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的刪除和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加。確實(shí)，若想要的話，一個(gè)或多個(gè)多肽域可以是合成的多肽，其不對(duì)應(yīng)于任何單一毒株，但是包含來(lái)自多個(gè)毒株，或者甚至來(lái)自通過(guò)比對(duì)多種RSV病毒株多肽推導(dǎo)的共有序列的構(gòu)件亞序列。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)添加構(gòu)成標(biāo)簽的氨基酸序列來(lái)修飾一個(gè)或多個(gè)多肽域，所述標(biāo)簽便于隨后的加工或純化。此類標(biāo)簽可以是抗原性或表位標(biāo)簽、酶標(biāo)簽或多組氨酸標(biāo)簽。通常，標(biāo)簽位于蛋白質(zhì)的一端或另一端，諸如在抗原或融合蛋白的C端或N端。編碼PreF抗原的核酸本公開(kāi)內(nèi)容的另一方面關(guān)注編碼如上文所描述的PreF抗原的重組核酸。在某些實(shí)施方案中，對(duì)重組核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在選定的原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，SEQIDNO:5和12是編碼PreF抗原的序列的兩種不同例示性、非限制性例子，它們已經(jīng)進(jìn)行過(guò)密碼子優(yōu)化以在哺乳動(dòng)物(例如CH0)細(xì)胞中表達(dá)。為了便于復(fù)制和表達(dá)，可以將核酸摻入載體諸如原核或真核表達(dá)載體中。包含重組PreF抗原編碼核酸的宿主細(xì)胞也是本公開(kāi)內(nèi)容的特征。有利的宿主細(xì)胞包括原核(即細(xì)菌)宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌(E.coli)，以及許多真核宿主細(xì)胞，包括真菌(例如酵母)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如CH0、VERO和HEK293細(xì)胞)。為了便于復(fù)制和表達(dá)，可以將核酸摻入載體諸如原核或真核表達(dá)載體中。雖然本文所公開(kāi)的核酸可以包含在許多載體(包括例如細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合衍生的載體；病毒DNA諸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)之任一種中，但是最常見(jiàn)地，載體會(huì)是適合于生成多肽表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體。在表達(dá)載體中，編碼PreF抗原的核酸通常以對(duì)于合適的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動(dòng)子，和任選地，一種或多種增強(qiáng)子)的接近和取向排列以指導(dǎo)mRNA合成。也就是說(shuō)，感興趣的多核苷酸序列可操作連接至合適的轉(zhuǎn)錄控制序列。此類啟動(dòng)子的例子包括CMV的立即早期啟動(dòng)子、LTR或SV40啟動(dòng)子、桿狀病毒的多角體蛋白啟動(dòng)子、大腸桿菌Iac或trp啟動(dòng)子、噬菌體T7和λPl啟動(dòng)子、和已知在原核或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。表達(dá)載體通常還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。任選地，載體包含適合于擴(kuò)增表達(dá)的序列。另外，任選地，表達(dá)載體包含一種或多種選擇標(biāo)志基因以提供供選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞用的表型性狀，諸如供真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者諸如大腸桿菌中的卡那霉素、四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。表達(dá)載體還可以含有別的表達(dá)元件，例如以改善翻譯的效率。這些信號(hào)可以包含例如ATG起始密碼子和相鄰序列。在一些情況中，例如與感興趣的多核苷酸序列(例如天然的起始密碼子)同時(shí)將翻譯起始密碼子和相關(guān)序列元件插入合適的表達(dá)載體中。在此類情況中，不需要?jiǎng)e的翻譯控制信號(hào)。然而，在僅插入多肽編碼序列或其部分的情況中，提供外源翻譯控制信號(hào)(包括ATG起始密碼子)來(lái)翻譯編碼PreF抗原的核酸。以正確讀碼框的方式放置起始密碼子以確保翻譯感興趣的多核苷酸序列。外源轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是多種起源的(天然的和合成的兩者)。若想要的話，可以通過(guò)包含適合于使用中的細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來(lái)進(jìn)一步提高表達(dá)效率(Scharf等(1994)ResultsProblCellDiffer20125-62；Bitter等(1987)MethodsinEnzymol153:516_544)。在一些例子中，編碼PreF抗原的核酸(諸如載體)包含為了在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)提高和/或優(yōu)化PreF編碼核酸的表達(dá)而選擇的一種或多種別的序列元件。例如，在某些實(shí)施方案中，編碼PreF抗原的核酸包含內(nèi)含子序列，諸如人皰疹病毒5內(nèi)含子序列(參見(jiàn)例如SEQIDNO:13)。已經(jīng)反復(fù)證明了，內(nèi)含子在重組構(gòu)建體中合適定位時(shí)增強(qiáng)同源和異源核酸的表達(dá)。另一類表達(dá)增強(qiáng)序列包括外遺傳元件諸如基質(zhì)附著區(qū)(或MAR)，或類似的外遺傳元件，例如STAR元件(例如諸如Otte等，Biotechnol.Prog.23=801-807,2007中披露的那些STAR元件)。不限于理論，認(rèn)為MAR介導(dǎo)靶DNA序列錨定至細(xì)胞核基質(zhì)，產(chǎn)生染色質(zhì)環(huán)域，其自異染色質(zhì)核心向外延伸。雖然MAR不含任何明顯的共有或可識(shí)別序列，但是它們最一致的特征表現(xiàn)為總體上高的A/T含量，和另一條鏈上占優(yōu)勢(shì)的C堿基。這些區(qū)域表現(xiàn)為形成彎曲的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其可能傾向于鏈分開(kāi)，而且可以包含能充當(dāng)鏈分開(kāi)的成核點(diǎn)的核心解旋元件(CUE)。已經(jīng)將數(shù)個(gè)簡(jiǎn)單的富含AT的序列基序與MAR序列聯(lián)系起來(lái)例如A框、T框、DNA解鏈基序、SATBl結(jié)合位點(diǎn)(H框，A/T/C25)和脊椎動(dòng)物或果蠅屬(Drosophila)的共有拓?fù)洚悩?gòu)酶Π位點(diǎn)。例示性MAR序列記載于已公布的美國(guó)專利申請(qǐng)No.20070178469和國(guó)際專利申請(qǐng)No.W002/074969(通過(guò)提及而將其收入本文)。可以用于增強(qiáng)編碼PreF抗原的核酸表達(dá)的別的MAR序列包括雞溶菌酶MAR、MARpl-42、MARpl-6、MARpl-68、和MARpx-29，其記載于Girod等，NatureMethods,4747-753，2007(分別以GenBank登錄號(hào)EA423306、DI107030、DI106196、DI107561、和DI106512披露)。技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，可以通過(guò)選擇產(chǎn)生中間水平增強(qiáng)的MAR(如關(guān)于MAR1-9報(bào)告的)來(lái)進(jìn)一步調(diào)控表達(dá)。若想要的話，可以通過(guò)搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如使用諸如MAR-Finder(在網(wǎng)絡(luò)上于futuresoft.org/MarFinder可獲得)、SMARTest(在網(wǎng)絡(luò)上于genomatix.de可獲得)、或SMARScanI(Levitsky等，Bioinformaticsl5=582-592,1999)等軟件來(lái)鑒定用于提高PreF抗原表達(dá)的備選MAR序列。在某些實(shí)施方案中，在與PreF抗原編碼序列相同的核酸(例如載體)上將MAR導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞中。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，在不同的核酸上(例如反式)將MAR導(dǎo)入，并且任選地，它可以與PreF抗原編碼多核苷酸序列共整合。足以指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成重組PreF抗原核酸生成的例示性規(guī)程可以參見(jiàn)Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989;Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，第3片反，ColdSpringHarborPress，2001；Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates，1992(和至2OO3年的增補(bǔ))；及Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology，第4片反，Wiley&Sons，1999。編碼PreF抗原多肽的例示性核酸以SEQIDNO:5、7、9、12和13表示。可以通過(guò)裝配選自任何已知的(或隨后)發(fā)現(xiàn)的RSV毒株的類似的F和G蛋白多肽序列來(lái)生成別的變體，例如如W02008114149中所披露的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以生成與例示性變體共享序列同一性的別的序列變體。典型地，核酸變體會(huì)編碼相差不超過(guò)1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%的氨基酸殘基的多肽。也就是說(shuō)，編碼的多肽共享至少80%、或85%、更常見(jiàn)地，至少約90%或更多，諸如95%，或者甚至98%或99%序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)立即理解的是，編碼PreF多肽的多核苷酸序列本身可以由于遺傳密碼冗余而共享較少的序列同一性。在一些例子中，PreF抗原相對(duì)于衍生其的天然存在的毒株的氨基酸序列具有一處或多處氨基酸修飾(例如在上述穩(wěn)定化修飾外)。此類差異可以分別是一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸的添加、刪除或替代。變體通常相差不超過(guò)約1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%的核苷酸殘基。例如，與例示性PreF抗原核酸SEQIDNO:5、7、9、12和/或13相比，變體PreF抗原(包括PreF-G)核酸可以包含1、或2、或多至5、或多至約10、或多至約15、或多至約50、或多至約100處核苷酸差異。如此，RSVF或G蛋白，或PreF抗原(包括PreF-G抗原)核酸背景中的變體通常與參照序列(例如SEQIDNO:1、3、5、7、9、12或13中顯示的參照序列，或本文所公開(kāi)的任何其它例示性PreF抗原核酸)共享至少80%、或85%，更常見(jiàn)地，至少約90%或更多，諸如95%，或甚至98%或99%序列同一性。作為本公開(kāi)內(nèi)容特征包括的別的變體是包含選自W02008114149中所披露的天然存在變體的核苷酸序列整個(gè)或部分的PreF抗原(包括PreF-G抗原)。別的變體可以經(jīng)由遺傳漂變生成，或者可以使用定點(diǎn)或隨機(jī)誘變，或者通過(guò)重組兩種或更多種先前存在的變體來(lái)人工生成。此類別的變體在本文所公開(kāi)的PreF(和PreF-G)抗原的背景中也是合適的。在先前所描述的變體核酸外，還可以使用與以SEQIDNO:1、3、5、7、9、12和13表示的一種或多種例示性核酸雜交的核酸來(lái)編碼PreF抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，在上文所描述的％序列同一性測(cè)量外，兩種核酸間的序列相似性的另一項(xiàng)指示是雜交能力。兩種核酸的序列越相似，它們會(huì)雜交的條件越嚴(yán)格。雜交條件的嚴(yán)格性是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。如此，產(chǎn)生特定程度的嚴(yán)格性的雜交條件會(huì)隨選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列的組成和長(zhǎng)度而變化。一般而言，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(尤其是Na+和/或Mg++濃度)會(huì)決定雜交的嚴(yán)格性，雖然清洗時(shí)間也影響嚴(yán)格性。一般而言，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在規(guī)定離子強(qiáng)度和PH的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C至20°C。Tm是50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。用于核酸雜交的條件和嚴(yán)格性的計(jì)算可以參見(jiàn)例如Sambrook等，MolecularCloning=ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001；Tijssen,HybridizationWithNucleicAcidProbes,PartITheoryandNucleicAcidPreparation,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierScienceLtd.,NY,NY,1993；禾口Ausubel等ShortProtocolsinMolecularBiology,%4版，JohnWiley&Sons,Inc.,1999。出于本公開(kāi)內(nèi)容的目的，“嚴(yán)格條件”涵蓋雜交僅會(huì)在雜交分子與靶序列之間有小于25%的錯(cuò)配時(shí)發(fā)生的條件。為了更精確的定義，“嚴(yán)格條件”可以分成特定的嚴(yán)格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等嚴(yán)格性”條件指具有超過(guò)25%序列錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件；“中間嚴(yán)格性”條件指錯(cuò)配超過(guò)15%的分子不會(huì)雜交的條件，而“高嚴(yán)格性”條件指錯(cuò)配超過(guò)10%的序列不會(huì)雜交的條件?！胺浅８叩膰?yán)格性”條件指錯(cuò)配超過(guò)6%的序列不會(huì)雜交的條件。比較而言，在“低嚴(yán)格性條件”下雜交的核酸包括具有少得多的序列同一性，或僅在核酸的短的亞序列里具有序列同一性的核酸。因此，應(yīng)當(dāng)理解，由本公開(kāi)內(nèi)容所涵蓋的核酸的各種變體能夠在基本上其整個(gè)長(zhǎng)度里與SEQID而1、3、5、7、9、和/或12的至少一項(xiàng)雜交。牛成RSV抗原件多肽的方法使用用于表達(dá)和純化重組蛋白的完善建立的規(guī)程來(lái)生成本文所公開(kāi)的PreF抗原(包括PreF-G抗原，和在可適用的情況中還包括G抗原)。足以指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的規(guī)程可以參見(jiàn)下列參考文獻(xiàn)Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,200；及Ausubel等ShortProtocolsinMolecularBiology，第4版，JohnWiley&Sons，Inc.，999。下文提供了另外的和具體的詳情。通過(guò)許多公知的規(guī)程之任一種，諸如電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如使用商品化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑諸如LIP0FECTAMINE2000或TRANSFECTIN)、磷酸鈣沉淀、感染、轉(zhuǎn)染等(這取決于載體和宿主細(xì)胞的選擇)來(lái)將編碼PreF抗原的重組核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。SEQIDN0:5、7、9、12和13中提供了編碼PreF抗原(包括PreF-G抗原)的例示性核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，SEQIDN0:5、7、9、12和13是例示性的，并不意圖是限制性的。例如，可以容易地使用與SEQIDNO:5、7和9編碼相同蛋白質(zhì)(例如以SEQIDNO:6、8和10表示)，但是差別僅在于遺傳密碼冗余(諸如備選密碼子優(yōu)化，如SEQIDN0:12中所顯示)的多核苷酸序列來(lái)代替例示性序列SEQIDN0:5、7、和9。類似地，可以采用包含表達(dá)增強(qiáng)元件諸如內(nèi)部定位的內(nèi)含子(或者通過(guò)添加啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子或其它類似的元件)的多核苷酸序列，如SEQIDN0:13中所顯示。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，此類修飾的組合是同樣合適的。類似地，也可以使用選自任何RSVA或RSVB毒株的同源序列和/或共享實(shí)質(zhì)的序列同一性的其它序列(如上文所討論的)來(lái)表達(dá)PreF抗原。確實(shí)，可以合適地將先前所公開(kāi)的任何變體核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，并用于生成PreF抗原(包括PreF-G抗原)和可適用情況中的G多肽。如此，包含重組PreF抗原編碼核酸的宿主細(xì)胞也是本公開(kāi)內(nèi)容的特征。有利的宿主細(xì)胞包括原核(即細(xì)菌)宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌，以及許多真核宿主細(xì)胞，包括真菌(例如酵母諸如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Picchiapastoris))細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如CHO和HEK293細(xì)胞)。將重組PreF抗原核酸導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞中，例如經(jīng)由載體諸如表達(dá)載體。如上文所描述的，載體最通常是質(zhì)粒，但是此類載體也可以是例如病毒顆粒、噬菌體等。合適的表達(dá)宿主的例子包括細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)、和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)；真菌細(xì)胞，諸如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、和粗糙脈抱菌(Neurosporacrassa)；昆蟲(chóng)細(xì)胞諸如果妮屬禾口草地夜娥(Spodopterafrugiperda)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如3T3、COS、CHO、BHK、HEK293或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞，包括藻類細(xì)胞寸?？梢栽跒榱思せ顔?dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體、或者擴(kuò)增所插入的多核苷酸序列而酌情修飾的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件諸如溫度、PH等通常是那些先前與選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞一起使用的條件，而且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見(jiàn)的，并且在本文所引用的參考文獻(xiàn)中，包括例如Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechniaue,第三版，Wiley-Liss,NewYork及其中所引用的參考文獻(xiàn)。也可以在非動(dòng)物細(xì)胞諸如植物、酵母、真菌、細(xì)菌等中生成與本發(fā)明的核酸對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物。在Sambrook,Berger和Ausubel外，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的詳情可以參見(jiàn)Payne等(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;Gamborg禾口Phillips(編)(1995)PlantCell,TissueandOrRanCulture；FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)及Atlas禾口Parks(編)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)所表達(dá)產(chǎn)物預(yù)期的用途來(lái)選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)需要大量多肽或其片段來(lái)生成抗體時(shí)，有利地采用指導(dǎo)容易純化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體。此類載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體諸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可以將感興趣的編碼序列(例如如上文所描述的本發(fā)明的多核苷酸)與氨基端翻譯起始甲硫氨酸和隨后β-半乳糖苷酶的7個(gè)殘基的序列以符合讀碼框方式連接入載體中，生成有催化活性的β-半乳糖苷酶融合蛋白；PlN載體(VanHeeke和Schuster(1989)JBiolChem264:5503-5509)；pET載體(Novagen，MadisonWI)，其中將氨基端甲硫氨酸以符合讀碼框方式與組氨酸標(biāo)簽連接；等。類似地，在酵母諸如釀酒酵母中，可以使用許多含有組成性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如α因子、醇氧化酶和PGH的載體來(lái)生成想要的表達(dá)產(chǎn)物。關(guān)于綜述，參見(jiàn)Berger、Ausubel、和例如Grant等(1987;MethodsinEnzymologyl53:516_544)。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以利用許多表達(dá)系統(tǒng)，包括質(zhì)粒和基于病毒的系統(tǒng)兩者。任選地，對(duì)宿主細(xì)胞選擇其調(diào)控所插入序列表達(dá)或者以想要的方式加工所表達(dá)蛋白質(zhì)的能力。對(duì)蛋白質(zhì)的此類修飾包括但不限于糖基化(以及例如乙?；?、羧基化、磷酸化、脂質(zhì)化(Iipidation)和?；?。任選地，在宿主細(xì)胞的背景中實(shí)施翻譯后加工，例如其將前體形式切割成蛋白質(zhì)的成熟形式(例如通過(guò)弗林蛋白酶)。不同宿主細(xì)胞諸如3T3、COS、CHO、HeLa,BHK、MDCK、293、WI38等針對(duì)此類翻譯后活性具有特定的細(xì)胞機(jī)器(machinery)和特征性機(jī)制，并且可以進(jìn)行選擇以確保對(duì)所導(dǎo)入的、外來(lái)蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。為了本文所公開(kāi)的重組PreF抗原的長(zhǎng)期的、高產(chǎn)量生成，通常使用穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)。例如，使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)或內(nèi)源表達(dá)元件和選擇標(biāo)志基因的表達(dá)載體來(lái)將穩(wěn)定表達(dá)PreF抗原多肽的細(xì)胞系引入宿主細(xì)胞中。導(dǎo)入載體后，容許細(xì)胞在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，之后將其轉(zhuǎn)換至選擇培養(yǎng)基。選擇標(biāo)志的目的是賦予對(duì)選擇的抗性，并且其存在容許成功表達(dá)所導(dǎo)入序列的細(xì)胞的生長(zhǎng)和回收。例如，可以使用適合于細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性組或集落。任選地，在適合于自細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)和回收所編碼蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)用編碼PreF抗原的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞系并將宿主細(xì)胞培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，通過(guò)合適的手段(例如溫度變動(dòng)或化學(xué)誘導(dǎo))來(lái)誘導(dǎo)選定的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。任選地，培養(yǎng)基包含降低蛋白酶降解所表達(dá)蛋白質(zhì)的成分和/或添加劑。例如，用于培養(yǎng)細(xì)胞以生成PreF抗原的培養(yǎng)基可以包含蛋白酶抑制劑，諸如螯合劑或小分子抑制劑(例如AZ11557272、AS111793等)以降低或消除由細(xì)胞、或細(xì)胞外(例如基質(zhì))蛋白酶進(jìn)行的不想要的切割。然后自培養(yǎng)液回收所分泌的多肽產(chǎn)物?；蛘?，可以通過(guò)離心來(lái)收獲細(xì)胞，通過(guò)物理或化學(xué)手段來(lái)破壞細(xì)胞，并保留所得的粗制提取物用于進(jìn)一步純化?？梢酝ㄟ^(guò)任何便利的方法來(lái)破壞蛋白質(zhì)表達(dá)中所采用的真核或微生物細(xì)胞，包括冷凍_融化循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞、或者使用細(xì)胞裂解劑、或者其它方法，其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的許多方法之任一種來(lái)從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化所表達(dá)的PreF抗原，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、過(guò)濾、超濾、離心、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析(例如使用本文所記錄的任何加標(biāo)簽系統(tǒng))、羥磷灰石層析、和凝集素層析。根據(jù)需要，可以在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，可以在最終的純化步驟中采用高效液相層析(HPLC)。在上文所記錄的參考文獻(xiàn)外，多種純化方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如下列文獻(xiàn)列出的Sandana(1997)BioseparationofProteins,AcademicPress,Inc.；禾口Bollag等(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss,NY;ffalker(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ,Harris禾口AnRal(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,U.K.;Scopes(1993)ProteinPurificationPrinciplesandPracticeH3片反SprinRerVerlag,NYTanson禾口Ryden(1998)ProteinPurificationPrinciples,HiRhResolutionMethodsandApplications,第二版ffiley-VCH,NY；及ffalker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ。在某些例子中，經(jīng)由適合于在原核細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)中導(dǎo)入和表達(dá)的載體來(lái)將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中。例如，可以將包含編碼PreF抗原的多核苷酸序列的核酸導(dǎo)入多種商品化或?qū)Ｓ休d體諸如PET表達(dá)載體系列(例如pET9b和pET2d)之任一種中。IPTG可誘導(dǎo)編碼序列的表達(dá)，產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。在噬菌體T7啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)錄編碼PreF抗原的多核苷酸序列。備選的載體諸如包含熱誘導(dǎo)型XpL啟動(dòng)子的pURV22也是合適的。將表達(dá)載體導(dǎo)入(例如通過(guò)電穿孔)合適的細(xì)菌宿主中。許多合適的大腸桿菌菌株是可用的，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇(例如，已經(jīng)證明了Rosetta和BL21(DE3)菌株對(duì)于表達(dá)含有編碼PreF抗原的多核苷酸序列的重組載體是有利的)。更典型地，將編碼PreF抗原的多核苷酸摻入適合于在真核(例如昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中導(dǎo)入和表達(dá)的表達(dá)載體中。有利地，對(duì)此類核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在選定的載體/宿主細(xì)胞中表達(dá)(例如，對(duì)SEQIDN0:5、7、9和12中顯示的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在CHO細(xì)胞中表達(dá))。在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，將編碼PreF抗原的多核苷酸序列導(dǎo)入載體中，諸如由LonzaBiologicals公司開(kāi)發(fā)的pEE14載體。在組成性啟動(dòng)子諸如立即早期CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子下表達(dá)多肽?；诮?jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在沒(méi)有谷氨酰胺來(lái)源的情況中生長(zhǎng)的能力來(lái)進(jìn)行對(duì)表達(dá)多肽的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的選擇。已經(jīng)成功整合PEE14的細(xì)胞能夠在沒(méi)有外源谷氨酰胺的情況中生長(zhǎng)，因?yàn)镻EE14載體表達(dá)GS(谷氨酰胺合成酶)酶?？梢詫?duì)選定的細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)充，并表征想要的PreF多肽的表達(dá)。在另一個(gè)例子中，使用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)來(lái)將編碼PreF抗原的多核苷酸序列導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞中?？梢允褂蒙唐坊d體、試劑盒和/或系統(tǒng)，諸如來(lái)自BDBioscience的BDBaculoGold系統(tǒng)來(lái)生成能夠感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的重組桿狀病毒。簡(jiǎn)言之，將編碼抗原的多核苷酸序列插入pAcSG2轉(zhuǎn)移載體中。然后，通過(guò)pAcSG2嵌合質(zhì)粒和BDBaculoGold(含有桿狀病毒苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的線性化基因組DNA)共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞SF9(草地夜蛾)。轉(zhuǎn)染后，PACSG2質(zhì)粒與桿狀病毒基因組之間發(fā)生同源重組以生成重組病毒。在一個(gè)例子中，在多角體蛋白啟動(dòng)子(PH)的調(diào)節(jié)控制下表達(dá)PreF抗原?？梢允褂闷渌鼏?dòng)子諸如基本的(Ba)和PlO啟動(dòng)子來(lái)生成類似的轉(zhuǎn)移載體。類似地，可以采用備選的昆蟲(chóng)細(xì)胞，諸如與Sf9緊密相關(guān)的SF21，和自甘藍(lán)尺蠖，即粉紋夜蛾(Trichoplusiani)衍生的HighFive細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)表達(dá)(依照選定的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或其它調(diào)節(jié)元件)后，將所表達(dá)的多肽回收(例如純化或富集)，并復(fù)性以確保折疊成有抗原性活性的融合前構(gòu)象。免疫原件組合物和方法還提供了免疫原性組合物，其包含上文所公開(kāi)的任何PreF抗原(諸如那些以SEQIDNO:6、8和10例示的)和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。在某些實(shí)施方案中，典型地，在PreF抗原不包含G蛋白構(gòu)件(諸如SEQIDNO6)的實(shí)施方案中，免疫原性組合物可以包含分離的、重組的和/或純化的G蛋白。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多合適的G蛋白，并且包括全長(zhǎng)重組G蛋白和由G蛋白的一部分(諸如氨基酸128-229或130-230)和融合配偶(諸如硫氧還蛋白)、或信號(hào)和/或前導(dǎo)序列(其便于表達(dá)和/或純化)構(gòu)成的嵌合蛋白。與PreF抗原混合使用的例示性G蛋白可以參見(jiàn)W02008114149、美國(guó)專利No.5，149，650、美國(guó)專利No.6，113，911、美國(guó)已公布的申請(qǐng)No.20080300382、和美國(guó)專利No.7，368，537，通過(guò)提及而將每篇收入本文。如關(guān)于嵌合PreF-G蛋白所指明的，可以在牽涉PreF(沒(méi)有G)和G的混合物的背景中有利地采用G蛋白的更小片段，諸如氨基酸149-229之間的部分，或約128至約229之間的部分。如上文所討論的，重要的考慮是免疫優(yōu)勢(shì)表位的存在，例如包含在氨基酸183-197的區(qū)域內(nèi)的?；蛘?，可以在此類組合物中采用全長(zhǎng)G蛋白。藥學(xué)可接受載體和賦形劑是公知的，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。例如，載體或賦形劑可以有利地包括緩沖劑。任選地，載體或賦形劑還含有至少一種穩(wěn)定溶解度和/或穩(wěn)定性的成分。增溶劑/穩(wěn)定劑的例子包括去污劑，例如月桂樹(shù)肌氨酸和/或Tween0備選的增溶劑/穩(wěn)定劑包括精氨酸和玻璃形成多元醇(諸如蔗糖、海藻糖等)。許多藥學(xué)可接受載體和/或藥學(xué)可接受賦形劑是本領(lǐng)域已知的，并且記載于例如Remington’sPharmaceuticalSciences,Ε.W.Martin,MackPublishingCo.，Easton，PA，第5片反(975)。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的賦形劑和載體以產(chǎn)生適合于通過(guò)選定的施用路徑向受試者投遞的配制劑。合適的賦形劑包括但不限于甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸鈉鹽、L-脯氨酸、非去污劑磺基甜菜堿、鹽酸胍、脲、三甲胺氧化物、KC1、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+和其它二價(jià)陽(yáng)離子相關(guān)鹽、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇(Dithioerytrol)、和β-巰基乙醇。其它賦形劑可以是去污劑(包括Tween80、Tween20、TritonX-00、NP_40、EmpigenBB、辛基葡糖苷、月桂酰麥芽糖苷、Zwittergent3-08、Zwittergent3-0、Zwittergent3_2、Zwittergent3-4、Zwittergent3-6、CHAPS、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基三甲銨)。任選地，免疫原性組合物還包含佐劑。在適合于對(duì)受試者施用以引發(fā)針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性組合物的背景中，對(duì)佐劑進(jìn)行選擇以引發(fā)Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答。通常對(duì)佐劑進(jìn)行選擇以在接受組合物施用的受試者或受試者群體中增強(qiáng)Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答。例如，在要對(duì)RSV感染易感(或者有升高風(fēng)險(xiǎn)的)的特定年齡組的受試者施用免疫原性組合物時(shí)，佐劑選擇為在受試者或受試者群體中是安全且有效的。如此，在配制含有RSVPreF抗原的免疫原性組合物以在老年受試者(諸如年齡大于65歲的受試者)中施用時(shí)，佐劑選擇為在老年受試者中是安全且有效的。類似地，在含有RSVPreF抗原的免疫原性組合物意圖用于在新生兒或嬰兒受試者(諸如在出生和年齡為兩歲之間的受試者)中施用時(shí)，佐劑選擇為在新生兒和嬰兒中是安全且有效的。另外，通常對(duì)佐劑進(jìn)行選擇以在經(jīng)由施用免疫原性組合物的施用路徑施用時(shí)增強(qiáng)Thl免疫應(yīng)答。例如，在配制含有PreF抗原的免疫原性組合物用于鼻施用時(shí)，蛋白體和Protollin是有利的Thl偏愛(ài)性佐劑。比較而言，在將免疫原性組合物配制用于肌內(nèi)施用時(shí)，有利地選擇包括下列一項(xiàng)或多項(xiàng)的佐劑3D-MPL、鯊烯(例如QS21)、脂質(zhì)體、和/或油和水乳劑。一種適合于與PreF抗原組合使用的佐劑是非毒性細(xì)菌脂多糖衍生物。合適的脂質(zhì)A非毒性衍生物的例子是單磷酰脂質(zhì)A或者更具體的是，3-脫酰單磷酰(monophoshoryl)脂質(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKlineBiologicalsN.A.以名稱MPL出售，并且貫穿整個(gè)文件稱為MPL或3D-MPL。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利No.4，436，727；4，877，611；4，866，034和4，912，094。3D-MPL主要促進(jìn)具有IFN-y(Thl)表型的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。可以依照GB2220211A中所披露的方法來(lái)生成3D-MPL。在化學(xué)上，它是具有3、4、5或6條?；湹?-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中，可以使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有如下顆粒大小，使得其可以無(wú)菌過(guò)濾流過(guò)0.22μm濾器。此類制備物記載于W094/21292?？梢砸悦咳藙┝康拿庖咴越M合物1和50μg之間的量使用脂多糖諸如3D-MPL?？梢砸约s25μg，例如20-30μg之間，合適地21-29μg之間或22和28μg之間或23和27μg之間或24和26μg之間，或25μg的水平使用此3D-MPL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約10μg，例如5和15μg之間，合適地6和14μg之間，例如7禾口13μg之間或8禾口12μg之間或9禾口11μg之間，或10μg的水平的3D-MPL。在又一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約5μg，例如1和9μg之間，或2和8μg之間或者合適地3和7μg之間或4和μg之間，或5μg的3D_MPL。在其它實(shí)施方案中，脂多糖可以是β(1-6)葡糖胺二糖，如記載于美國(guó)專利No.6，005，099和EP專利No.O729473Bi?；谶@些參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地能夠生成各種脂多糖，諸如3D-MPL。盡管如此，通過(guò)提及而將每篇這些參考文獻(xiàn)收入本文。在前述免疫刺激物(其在結(jié)構(gòu)上與LPS或MPL或3D-MPL類似)外，作為上述MPL結(jié)構(gòu)的亞部分的?；瘑翁呛投茄苌镆彩呛线m的佐劑。在其它實(shí)施方案中，佐劑是脂質(zhì)A的合成衍生物，其中一些被描述為T(mén)LR-4激動(dòng)劑，并且包括但不限于OMl74(2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷?；趸?癸?；被鵠-4-o-膦?；?β-D-吡喃葡萄糖基]-2--(1-0-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯)(W095/14026)；OM294DP(3S，9R)-3—[(R)-十二烷酰基氧基四癸酰基氨基]-4-氧-5-氮-9(R)-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-1，10-二醇，1，10-二(磷酸二氫酯)(W099/64301和WO00/0462)；和OM197MP_AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷?；趸腳癸?；被鵠-4-氧-5-氮-9-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-1，10-二醇，1-磷酸二氫酯10-(6-氨基己酸酯)(W001/46127)?？梢允褂玫钠渌黅LR4配體是烴基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)諸如那些在WO98/50399或美國(guó)專利No.6，303，347(還披露了用于制備AGP的方法)中披露的，合適地，RC527或RC529或AGP的藥學(xué)可接受鹽，如美國(guó)專利No.6，764，840中所披露的。一些AGP是TLR4激動(dòng)劑，而一些是TLR4拮抗劑。認(rèn)為兩者作為佐劑都是有用的。能夠經(jīng)由TLR-4引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答(Sabroe等，JI2003ρ1630-5)的其它合適的TLR-4配體是例如來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，特別是LPS的非毒性衍生物(諸如3D-MPL)。其它合適的TLR激動(dòng)劑是熱休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性劑蛋白A、乙酰透明質(zhì)酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纖連蛋白片段、血纖蛋白原肽和b-防衛(wèi)素-2、和胞壁酰二肽(MDP)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是HSP60、70或90。其它合適的TLR-4配體如記載于WO2003/011223和WO2003/099195，諸如W02003/011223的第4頁(yè)-第5頁(yè)上或W02003/099195的第3頁(yè)-第4頁(yè)上披露的化合物I、化合物II和化合物III和特別是W02003/011223中披露為ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680、和ER804764的那些化合物。例如，一種合適的TLR-4配體是ER804057。別的TLR激動(dòng)劑作為佐劑也是有用的。術(shù)語(yǔ)“TLR激動(dòng)劑”指能夠經(jīng)由TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答(或是作為直接的配體或是間接地經(jīng)由生成內(nèi)源或外源配體)的藥劑?？梢允褂么祟愄烊坏幕蚝铣傻腡LR激動(dòng)劑作為備選的或別的佐劑。Kaisho和Akira，BiochimicaetBiophysicaActal589:1_13，2002中提供了TLR作為佐劑受體的作用的簡(jiǎn)短綜述。這些潛在佐劑包括但不限于1112、11^3、11^7、11^8和11^9的激動(dòng)劑。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑和免疫原性組合物進(jìn)一步包含選自下組的佐劑=TLR-I激動(dòng)劑、TLR-2激動(dòng)劑、TLR-3激動(dòng)劑、TLR-4激動(dòng)劑、TLR-5激動(dòng)劑、TLR-6激動(dòng)劑、TLR-7激動(dòng)劑、TLR-8激動(dòng)劑、TLR-9激動(dòng)劑、或其組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-I引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-I引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑選自三?；?LP)；酚可溶性調(diào)控蛋白(modulin)；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)LP；三鹽酸S-(2，3-二(棕櫚酰基氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕櫚?；?(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-0H(Pam3Cys)LP(其模擬細(xì)菌脂蛋白的乙酰化氨基端)和來(lái)自布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)的OspALP0在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-2引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-2引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是下列一項(xiàng)或多項(xiàng)來(lái)自結(jié)核分枝桿菌、布氏疏螺旋體或蒼白密螺旋體(Tpallidum)的脂蛋白、肽聚糖、細(xì)菌脂肽；來(lái)自包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的物種的肽聚糖；脂磷壁酸質(zhì)類、甘露糖醛酸類、奈瑟氏球菌(Neisseria)孔蛋白、細(xì)菌菌毛、耶爾森氏菌(Yersina)毒力因子、CMV病毒體、麻疹血細(xì)胞凝集素、和來(lái)自酵母的酵母聚糖。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-3引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-3引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是雙鏈RNA(dsRNA)、或聚肌苷酸胞苷酸(PolyIC)，一種與病毒感染有關(guān)的分子核酸樣式。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-5引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-5引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是細(xì)菌鞭毛蛋白。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-6引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-6引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是分枝桿菌脂蛋白、二?；疞P、和酚可溶性調(diào)控蛋白。別的TLR6激動(dòng)劑記載于WO2003/043572。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-7引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-7引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是單鏈RNA(ssRNA)、洛索立賓(Ioxoribine)、在位置N7和C8的鳥(niǎo)苷類似物、或咪唑喹啉化合物、或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是咪喹莫特(imiquimod)。別的TLR7激動(dòng)劑記載于WO2002/085905。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-8引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-8引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是單鏈RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德(reSiquimod，R848)；瑞喹莫德也能夠被TLR-7識(shí)別?？梢允褂玫钠渌黅LR-8激動(dòng)劑包括記載于WO2004/071459的。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是HSP90?；蛘?，能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是細(xì)菌或病毒DNA、含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，特別是稱為CpG基序的序列背景。含有CpG的寡核苷酸主要誘導(dǎo)Thl應(yīng)答。此類寡核苷酸是公知的，并且記載于例如WO96/02555、WO99/33488和美國(guó)專利No.6，008，200和5，856，462。合適地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的合適的寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任選地，其含有由至少三個(gè)，合適地，至少六個(gè)或更多個(gè)核苷酸分開(kāi)的兩個(gè)或更多個(gè)二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后面跟著鳥(niǎo)嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯，或者合適的是硫代磷酸酯鍵，雖然磷酸二酯和其它核苷酸間鍵在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是具有混合的核苷酸間連接的寡核苷酸。用于產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法記載于美國(guó)專利No.5，666，153,5,278，302和WO95/26204。可以在具有PreF抗原的免疫原性組合物中使用(例如單獨(dú)地或者與3D-MPL或本文所描述的其它佐劑組合地)的其它佐劑是皂苷類，諸如QS21。皂苷類參見(jiàn)Lacaille-Dubois，M和WagnerH.(1996.Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicine^l2363頁(yè)-第386頁(yè))。皂苷類是植物和海洋動(dòng)物王國(guó)中廣泛分布的類固醇或三萜糖苷。皂苷類記錄用于在水中形成膠體溶液(其在搖動(dòng)時(shí)起泡沫)及用于沉淀膽固醇。當(dāng)皂苷類接近細(xì)胞膜時(shí)，它們?cè)谀ど袭a(chǎn)生引起膜爆裂的孔樣結(jié)構(gòu)。紅細(xì)胞溶血是此現(xiàn)象的一個(gè)例子，其是某些但不是所有皂苷類的特性。已知皂苷類為供系統(tǒng)施用的疫苗中的佐劑。本領(lǐng)域中已經(jīng)廣泛研究了各種皂苷的佐劑和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，見(jiàn)上文)。例如，QuilA(衍生自南美喬木皂皮樹(shù)(QuillajaSaponariaMolina)的樹(shù)皮)及其級(jí)分記載于US5，057，540和"Saponinsasvaccineadjuvants，，，Kensil,C.R.,CritRevTherDrugCarrierSyst,1996,12(1-2):l-55;及EP0362279Bi。包含QuilA級(jí)分的顆粒結(jié)構(gòu)(稱作免疫刺激性復(fù)合物(ISCOMS))是溶血的，并且已經(jīng)在疫苗的制造中使用(Morein,Β·，EP0109942Bl；WO96/11711；WO96/33739)。溶血性皂苷類QS21和QS17(HPLC純化的QuilA級(jí)分)已經(jīng)被描述為有力的系統(tǒng)佐劑，并且其生產(chǎn)方法披露于美國(guó)專利No.5，057，540和EP0362279Bi，通過(guò)提及而將其收入本文。已經(jīng)在系統(tǒng)疫苗接種研究中使用的其它皂苷類包括衍生自其它植物物種諸如絲石竹(Gypsophila)和肥皂草(Saponaria)的(Bomford等，Vaccine,10(9):572_577，1992)。QS21是自皂皮樹(shù)樹(shù)皮衍生的Hplc純化的非毒性級(jí)分。美國(guó)專利No.5，057，540中披露了用于生成QS21的方法。含有QS21的非反應(yīng)原性佐劑配制劑記載于WO96/33739。通過(guò)提及而將前述參考文獻(xiàn)收入本文?？梢砸悦咳藙┝康拿庖咴越M合物1和50μg之間的量使用所述免疫學(xué)活性皂苷諸如QS21。有利地，以約25μg，例如20-30μg之間，合適地，21-29μg之間或22-28μg之間或23-27μg之間或24-26μg之間，或25μg的水平使用QS21。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約10μg，例如5和15μg之間，合適地6-14μg之間，例如7-13μg之間或8-12μg之間或9-11μg之間，或10μg的水平的QS21。在又一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約5μg，例如1-9μg之間，或2-8μg之間或者合適地3-7μg之間或4-6μg之間，或5μg的QS21。已經(jīng)顯示了包含QS21和膽固醇的此類配制劑在與抗原一起配制時(shí)是成功的Thl刺激性佐劑。如此，例如，可以在具有佐劑的免疫原性組合物中有利地采用PreF多肽，所述佐劑包含QS21和膽固醇的組合。任選地，佐劑還可以包括礦物鹽諸如鋁或鈣鹽，特別是氫氧化鋁、磷酸鋁和磷酸鈣。例如，含有與鋁鹽(例如氫氧化鋁或“明礬”)組合的3D-MPL的佐劑適合于在含有PreF抗原的免疫原性組合物中配制用于對(duì)人受試者施用。另一類適合于在具有PreF抗原的配制劑中使用的Thl偏愛(ài)性佐劑包括基于OMP的免疫刺激性組合物?；贠MP的免疫刺激性組合物作為粘膜佐劑例如用于鼻內(nèi)施用是特別合適的?；贠MP的免疫刺激性組合物是一類來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌諸如但不限于奈瑟氏球菌物種的外膜蛋白(0ΜΡ，包括一些孔蛋白)的制備物(參見(jiàn)例如Lowell等，J.Exp.Med.167:658，1988；Lowell等，Science240:800，1988；Lynch等，Biophys.J.45:104，1984；Lowell,于"NewGenerationVaccines，，第2版，MarcelDekker,Inc.,NewYork,Basil,HongKong，第193頁(yè)，1997；美國(guó)專利No.5，726，292；美國(guó)專利No.4，707,543)，其作為載體或者在免疫原諸如細(xì)菌或病毒抗原的組合物中是有用的。一些基于OMP的免疫刺激性組合物可以稱為“蛋白體”，其是疏水性的，并且供人使用是安全的。蛋白體具有自動(dòng)裝配成約20nm至約SOOnm的小囊泡或小囊泡樣OMP簇的能力，及非共價(jià)地與蛋白質(zhì)抗原(Ag)，特別是具有疏水性模塊的抗原合并、協(xié)調(diào)、結(jié)合(例如靜電地或疏水地)、或以其它方式協(xié)作的能力。產(chǎn)生處于小囊泡或小囊泡樣形式的外膜蛋白成分(包括一種或多種OMP的多分子膜性結(jié)構(gòu)或熔球樣OMP組合物)的任何制備方法包括在蛋白體的定義內(nèi)。可以制備蛋白體，例如如本領(lǐng)域中所描述的(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.5，726，292或美國(guó)專利No.5，985，284)。蛋白體還可以含有源于用于生成OMP孔蛋白的細(xì)菌(例如奈瑟氏球菌物種)的內(nèi)源脂多糖或脂寡糖(分別為L(zhǎng)PS或L0S)，其一般會(huì)小于2%的總OMP制備物。蛋白體主要由通過(guò)去污劑維持在溶液中的來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriamenigitidis)的化學(xué)提取外膜蛋白(OMP)(主要為孔蛋白A和B以及4類0ΜΡ)組成(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal,Oral,orInjectableVaccines.于LevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS編，NewGenerationVaccines.NewYork:MarcelDekker,Inc.1997；193-206)。蛋白體可以與多種抗原諸如自病毒來(lái)源衍生的純化的或重組的蛋白質(zhì)(包括本文所公開(kāi)的PreF多肽)(例如通過(guò)滲濾或傳統(tǒng)的透析方法得到)一起配制。逐漸除去去污劑容許直徑約100-200nm的顆粒疏水性復(fù)合物的形成(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal,Oral,orInjectableVaccines.于LevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS編，NewGenerationVaccines.NewYork:MarcelDekker,Inc.1997；193-206)。如本文中所使用的，“蛋白體LPS或Protollin”指與至少一類脂多糖混合(例如通過(guò)外源添加)以提供OMP-LPS組合物(其能發(fā)揮免疫刺激性組合物的功能)的蛋白體制備物。如此，OMP-LPS組合物可以由Protollin基本成分之兩種構(gòu)成，其包括(1)自革蘭氏陰性細(xì)菌諸如腦膜炎奈瑟氏球菌制備的蛋白體(例如Projuvant)的外膜蛋白制備物，和(2)一種或多種脂糖的制備物。脂寡糖可以是內(nèi)源的(例如與OMP蛋白體制備物天然包含在一起)，可以與來(lái)自外源制備的脂寡糖(例如自與OMP制備物不同的培養(yǎng)物或微生物制備)的OMP制備物混合或組合，或者可以是其組合。此類外源添加的LPS可以來(lái)自制備OMP制備物的相同革蘭氏陰性細(xì)菌或者來(lái)自不同革蘭氏陰性細(xì)菌。還應(yīng)當(dāng)理解，任選地，Protollin包含脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白、小分子等，及其組合?？梢灾苽銹rotollin，例如如記載于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.2003/0044425的。也可以在具有PreF抗原的組合物中使用不同佐劑諸如上文所提及的佐劑的組合。例如，如已經(jīng)記錄的，可以將QS21與3D-MPL配制在一起。QS213D-MPL的比率通常會(huì)是大約110至101;諸如15至51，和經(jīng)?；旧蠟?1。典型地，比率在2.51至113D-MPLQS21的范圍中。另一種組合佐劑配制劑包含3D-MPL和鋁鹽，諸如氫氧化鋁。在組合配制時(shí)，此組合能增強(qiáng)抗原特異性Thl免疫應(yīng)答。在一些例子中，佐劑配制劑包含水包油乳劑，或礦物鹽諸如鈣或鋁鹽，例如磷酸鈣、磷酸鋁或氫氧化鋁。水包油乳劑的一個(gè)例子在水性載體中包含可代謝油，諸如鯊烯、母育酚諸如生育酚(例如α-生育酚)，和表面活性劑諸如Polysorbate80或Tween80，并且不含任何別的免疫刺激物，特別是它不含非毒性脂質(zhì)A衍生物(諸如3D-MPL)或皂苷(諸如QS21)。水性載體可以是例如磷酸鹽緩沖鹽水。另外，水包油乳劑可以含有Span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種疫苗組合物，其包含抗原或抗原組合物和佐劑組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳劑和任選地，一種或多種別的免疫刺激物，其中所述水包油乳劑包含0.5-10mg可代謝油(合適的是鯊烯)、0.5-llmg母育酚(合適的是生育酚，諸如α"生育酚)和0.4-4mg乳化劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，佐劑配制劑包含以乳劑諸如水包油乳劑形式制備的3D-MPL。在一些情況中，乳劑具有直徑小于0.2μm的小顆粒大小，如WO94/21292中所披露的。例如，3D-MPL顆?？梢孕〉米阋詿o(wú)菌過(guò)濾流過(guò)0.22微米膜(如記載于歐洲專利號(hào)O689454的)?；蛘?，可以在脂質(zhì)體配制劑中制備3D-MPL。任選地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐劑還包含別的免疫刺激性成分。例如，在將具有PreF多肽抗原的免疫原性組合物配制用于對(duì)嬰兒施用時(shí)，佐劑的劑量確定為在嬰兒受試者中是有效且相對(duì)非反應(yīng)原性的。一般而言，嬰兒配制劑中的佐劑劑量低于設(shè)計(jì)用于對(duì)成人(例如年齡為65歲或更年長(zhǎng)的成人)施用的配制劑中使用的劑量。例如，3D-MPL的量通常在每劑1μg_200yg，諸如10-100μg，或10μg-50μg的范圍中。嬰兒劑量通常在此范圍(例如約Iyg至約50yg，諸如約2yg、或約5yg、或約IOyg至約25μg、或約50μg)的下端。典型地，在配制劑中使用QS21的情況中，范圍是相當(dāng)?shù)?并且依照上文所指明的比率)。對(duì)于成人和老年人群體，配制劑通常包含比嬰兒配制劑中通常找到的佐劑成分更多的佐劑成分。在使用水包油乳劑的特定配制劑中，此類乳劑可以包含別的成分，例如諸如膽固醇、鯊烯、α“生育酚、和/或去污劑，諸如Tween80或Span85。在例示性配制劑中，此類成分可以以下列量存在約l_50mg膽固醇、2至10%鯊烯、2至10%α-生育酚和0.3至3%Tween80。典型地，鯊烯α-生育酚的比率等于或小于1，因?yàn)檫@提供較穩(wěn)定的乳劑。在一些情況中，配制劑還可以含有穩(wěn)定劑。在存在明礬(例如與3D-MPL組合)的情況中，量通常在每劑約IOOyg和Img之間，諸如約100μg或約200μg至約750μg，諸如約500μg。免疫原性組合物通常含有免疫保護(hù)數(shù)量(或其分?jǐn)?shù)劑量)的抗原，并且可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。免疫原性組合物(包括用于對(duì)人受試者施用的免疫原性組合物)的制備一般記載于PharmaceuticalBiotechnology,第61卷VaccineDesign-thesubunitandadjuvantapproach,Powell禾口Newman編，PlenurnPress,1995.NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,Voller等編，UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。例如，F(xiàn)ullerton，美國(guó)專利4，235，877描述了脂質(zhì)體內(nèi)的包囊。例如，Likhite，美國(guó)專利4，372，945和Armor等，美國(guó)專利4，474，757披露了蛋白質(zhì)與大分子的偶聯(lián)。典型地，每劑免疫原性組合物中的蛋白質(zhì)量選擇為在典型的受試者中誘導(dǎo)免疫保護(hù)性應(yīng)答而沒(méi)有顯著的、不利的副作用的量。在此語(yǔ)境中的免疫保護(hù)性的并不必然意味著針對(duì)感染的完全保護(hù)的；它意味著提供保護(hù)免于癥狀或疾病，尤其是與病毒有關(guān)的嚴(yán)重疾病?？乖靠梢噪S哪種特定的免疫原被采用而變化。一般而言，預(yù)期每個(gè)人劑量會(huì)包含1-1000μg的蛋白質(zhì)，諸如約1μg至約100μg，例如約1μg至約50μg，諸如約1μg、約2μg、約5μg、約10μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg、或約50μg0基于受試者群體(例如嬰兒或老年人)來(lái)選擇免疫原性組合物中利用的量?？梢酝ㄟ^(guò)牽涉在受試者中觀察抗體滴度和其它應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究來(lái)確定特定組合物的最佳量。初始疫苗接種后，受試者可以在約4周中接受加強(qiáng)免疫。應(yīng)當(dāng)注意到，不管選定的佐劑，最終配制劑中的濃度計(jì)算為在靶標(biāo)群體中是安全且有效的。例如，有利地對(duì)嬰兒(例如，出生和1歲，諸如0和6個(gè)月之間的嬰兒，在初始劑量的年齡時(shí))施用用于在人中引發(fā)針對(duì)RSV的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物。也有利地對(duì)老年人施用用于引發(fā)針對(duì)RSV的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物(例如單獨(dú)地或與COPD有關(guān)的其它病原體的抗原組合地)。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)的是，佐劑的選擇在這些不同應(yīng)用中可以是不同的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗(yàn)確定每種情況的最佳佐劑和濃度。在某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物是減輕或預(yù)防RSV感染的疫苗。在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物是RSV感染后減輕或預(yù)防病理應(yīng)答的疫苗。任選地，將含有PreF抗原的免疫原性組合物與不同于RSV的病原性生物體的至少一種別的抗原一起配制。例如，病原性生物體可以是呼吸道病原體(諸如引起呼吸道感染的病毒或細(xì)菌)。在某些情況中，免疫原性組合物含有自與RSV不同的病原性病毒諸如引起呼吸道感染諸如流感或副流感的病毒衍生的抗原。在其它實(shí)施方案中，選擇別的抗原來(lái)便于施用或減少保護(hù)受試者免于多種感染性生物體所需要的接種數(shù)目。例如，抗原可以衍生自下列任何一項(xiàng)或多項(xiàng)流感、乙肝、白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血菌(Hemophilusinfluenza)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鏈球菌屬(Streptococcus)或月市炎球菌屬(Pneumococcus)等。因而，PreF抗原或編碼它們的核酸在制備用于處理(或是之后治療性地或是之前預(yù)防性地)暴露于RSV或RSV感染的藥物中的用途也是本公開(kāi)內(nèi)容的特征。同樣地，用于在受試者中引發(fā)針對(duì)RSV的免疫應(yīng)答的方法是本公開(kāi)內(nèi)容的特征。此類方法包括對(duì)受試者諸如人受試者施用免疫學(xué)有效量的包含PreF抗原的組合物。通常，組合物包含引發(fā)Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答的佐劑。對(duì)組合物進(jìn)行配制以引發(fā)對(duì)RSV特異性的免疫應(yīng)答，而不在接觸RSV后增強(qiáng)病毒疾病。也就是說(shuō)，對(duì)組合物進(jìn)行配制，并且該組合物產(chǎn)生Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答，其減輕或預(yù)防RSV感染和/或在RSV感染后減輕或預(yù)防病理應(yīng)答。雖然可以通過(guò)多種不同路徑來(lái)施用組合物，但是最通常，通過(guò)肌內(nèi)或鼻內(nèi)施用路徑來(lái)投遞免疫原性組合物。免疫原性組合物通常含有免疫保護(hù)數(shù)量(或其分?jǐn)?shù)劑量)的抗原，并且可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。免疫原性組合物(包括用于對(duì)人受試者施用的免疫原性組合物)的制備一般記載于PharmaceuticalBiotechnology,第61卷VaccineDesign-thesubunitandadjuvantapproach,Powell禾口Newman編，PlenurnPress,1995.NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,Voller等編，UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。例如，F(xiàn)ullerton，美國(guó)專利4，235，877描述了脂質(zhì)體內(nèi)的包囊。例如，Likhite，美國(guó)專利4，372，945和Armor等，美國(guó)專利4，474，757披露了蛋白質(zhì)與大分子的偶聯(lián)。典型地，每劑免疫原性組合物中的蛋白質(zhì)量選擇為在典型的受試者中誘導(dǎo)免疫保護(hù)性應(yīng)答而沒(méi)有顯著的、不利的副作用的量。在此語(yǔ)境中的免疫保護(hù)性的并不必然意味著針對(duì)感染的完全保護(hù)的；它意味著保護(hù)免于癥狀或疾病，尤其是與病毒有關(guān)的嚴(yán)重疾病。抗原量可以隨哪種特定的免疫原被采用而變化。一般而言，預(yù)期每個(gè)人劑量會(huì)包含1-1000μg的蛋白質(zhì)，諸如約1μg至約100μg，例如約1μg至約50μg，諸如約1μg、約2μg、約5μg、約10μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg、或約50μg。基于受試者群體(例如嬰兒或老年人)來(lái)選擇免疫原性組合物中利用的量?？梢酝ㄟ^(guò)牽涉在受試者中觀察抗體滴度和其它應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究來(lái)確定特定組合物的最佳量。初始疫苗接種后，受試者可以在約4-12周中接受加強(qiáng)免疫。例如，在對(duì)嬰兒受試者施用含有PreF抗原的免疫原性組合物時(shí)，可以施用初始接種和后續(xù)接種以與此期間施用的其它疫苗一致。提供了以下實(shí)施例來(lái)例示某些具體的特征和/或?qū)嵤┓桨?。這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限制于所描述的具體的特征或?qū)嵤┓桨?。?shí)施例μg實(shí)施例1例示件PreF抗原與天然的RSVF蛋白相比，對(duì)PreF抗原進(jìn)行修飾以穩(wěn)定化處于其融合前構(gòu)象的蛋白質(zhì)，這基于如下預(yù)測(cè)來(lái)進(jìn)行，即針對(duì)F的融合前構(gòu)象所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答會(huì)優(yōu)先包括會(huì)阻止結(jié)合、構(gòu)象轉(zhuǎn)變和/或牽涉膜融合的其它事件的抗體，由此提高保護(hù)性應(yīng)答的功效。圖IA和圖IB示意性顯示了RSVFO和例示性PreF重組抗原的特征。圖IA是RSVFO蛋白的表示。FO是由574個(gè)氨基酸組成的前蛋白。翻譯后對(duì)FO前蛋白進(jìn)行蛋白水解加工和糖基化。信號(hào)肽(其隨后被信號(hào)肽酶除去)將FO前蛋白的翻譯靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RE)。然后在多個(gè)位點(diǎn)(通過(guò)三角形表示)對(duì)RE中的新生肽進(jìn)行N糖基化。弗林蛋白酶對(duì)FO的切割生成F2和Fl肽域，它們被折疊并裝配在一起，作為F2-F1異二聚物的三聚體(即3倍F2-F1)。在其天然狀態(tài)，F(xiàn)蛋白通過(guò)C端區(qū)域中的跨膜螺旋而錨定至膜。FO多肽的別的特征包括15個(gè)半胱氨酸殘基、4個(gè)經(jīng)表征的中和性表位、2個(gè)卷曲螺旋區(qū)、和脂質(zhì)化基序。圖IB顯示了例示性PreF抗原的特征。為了構(gòu)建PreF抗原，修飾FO多肽以穩(wěn)定F蛋白的融合前構(gòu)象，由此保留F蛋白的優(yōu)勢(shì)免疫原性表位，如與宿主細(xì)胞結(jié)合和融合前由RSV病毒呈現(xiàn)的。相對(duì)于FO多肽，將下列穩(wěn)定化突變引入PreF抗原中。第一，在FO多肽的胞外域的C端末端放置穩(wěn)定化卷曲螺旋域，替換FO的膜錨定域。第二，除去pep27肽(位于天然蛋白質(zhì)中的F2和Fl域之間)。第三，消除兩個(gè)弗林蛋白酶基序。在備選的實(shí)施方案(稱作PreF_Vl和PreF_V2)中，將RSVG蛋白的免疫學(xué)活性部分(例如氨基酸149-229)添加至C端域。實(shí)施例2自CHO細(xì)胞牛成和純化PreF重組蛋白將編碼例示性PreF抗原的重組多核苷酸序列導(dǎo)入宿主CHO細(xì)胞中以生成PreF抗原。將包含所導(dǎo)入多核苷酸序列的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞或擴(kuò)充的穩(wěn)定群體在培養(yǎng)基中并在適合于生長(zhǎng)的條件下以對(duì)于想要目的可接受的規(guī)模培養(yǎng)(例如，如一般記載于Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第三版，ffiley-Liss,NewYork及其中引用的參考文獻(xiàn))。典型地，將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中在搖瓶中于37°C在5%CO2的情況中培養(yǎng)，并以2-3天的時(shí)間間隔傳代，或者在生物反應(yīng)器中于29°C在以20%維持的p02的情況中培養(yǎng)。為了回收重組PreF抗原，離心細(xì)胞培養(yǎng)物，并于80°C貯存細(xì)胞培養(yǎng)上清液，直至進(jìn)一步使用。為了進(jìn)一步分析，用純化水將2升等分試樣的細(xì)胞培養(yǎng)上清液稀釋2x，并用NaOH調(diào)節(jié)至pH9.5。以14ml/分鐘的速率將上清液加載至在20mM哌嗪pH9.5中平衡的QSepharoseFF離子交換柱(60ml，11.3cm)上。用起始緩沖液清洗該柱后，用0至0.5MNaCl的NaCl梯度在20個(gè)柱體積中實(shí)施洗脫(級(jí)分大小IOml)。在SDSPAGE凝膠上通過(guò)銀染色和Western印跡來(lái)分析級(jí)分。然后合并含有實(shí)質(zhì)性PreF蛋白的級(jí)分，之后進(jìn)一步加工。使用具有PellliconXLPESBiomax100(MWC010，OOODa)膜盒的來(lái)自Millipore的工作臺(tái)規(guī)模TFF系統(tǒng)將Q步驟的合并洗脫(約130ml)進(jìn)行緩沖液交換，進(jìn)入IOmM磷酸鹽，pH7.0中。所得的材料具有7.0的pH和1.8mS/cm的電導(dǎo)率。在用IOmMPO4(Na)緩沖液pH7.0平衡的IOml羥磷灰石II型(HATII)凝膠(XK16，高度=5cm)上以5ml/分鐘加載IOOml此樣品。用起始緩沖液清洗該柱后，用IOmM至200mMPO4(Na)pH7.0的梯度在20個(gè)柱體積中實(shí)施洗脫。在SDSPAGE上用銀染色和考馬斯藍(lán)再次分析級(jí)分，并合并陽(yáng)性級(jí)分。親和層析后，濃縮合并的級(jí)分，并使用Vivaspin20濃縮器單元，10，OOODaMWCO將其緩沖液交換入DPBS(pH約7.4)中。最終產(chǎn)物是約13ml。蛋白質(zhì)濃度是195μg/ml，其通過(guò)Lowry測(cè)定法來(lái)評(píng)估。純度大于95%。將此純化的PreF抗原制備物進(jìn)行濾器除菌，并在使用前于_20°C貯存。實(shí)施例3:CH0細(xì)胞中牛成的PreF重組蛋白的表征通過(guò)不對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)(AFF-MALS)來(lái)表征CHO細(xì)胞中生成的PreF重組蛋白，并與包含RSVF和G蛋白構(gòu)件的嵌合抗原進(jìn)行比較。AFF-MALS容許蛋白質(zhì)種類在具有最低限度基質(zhì)相互作用的液體流動(dòng)中依照其分子大小分開(kāi)，并通過(guò)多角度光散射來(lái)進(jìn)一步分析以測(cè)定精確的分子量。圖2A顯示了，發(fā)現(xiàn)超過(guò)65%的純化的TO材料在其最終的PBS緩沖液中為高分子量寡聚物(1000-100OOOKDa)，而3%仍然處于單體形式。圖2B顯示了，純化的PreF蛋白以其三聚體形式在PBS緩沖液中以73%的比例折疊。發(fā)現(xiàn)10%的材料為1000至20OOOKDa寡聚物。這些結(jié)果指明，CHO細(xì)胞中表達(dá)的重組PreF蛋白折疊為三聚體，如對(duì)天然狀態(tài)所預(yù)測(cè)的。出于下列雙重目的，還將純化的PreF蛋白用戊二醛交聯(lián)確認(rèn)蛋白質(zhì)在磷酸鹽緩沖液溶液中的可溶性質(zhì)及生成聚集體來(lái)與re蛋白進(jìn)行比較性體內(nèi)評(píng)估(參見(jiàn)下文的實(shí)施例7)。已知戊二醛交聯(lián)用于提供對(duì)蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的良好評(píng)估，并且記載于(Biochemistry,3610230-10239(1997)；Eur.J.Biochem.，271:4284_4292(2004))。將蛋白質(zhì)與1%、2%和5%的戊二醛交聯(lián)劑于4°C一起溫育4小時(shí)，并通過(guò)添加NaBH4來(lái)阻斷反應(yīng)。通過(guò)在PBS緩沖液中進(jìn)行柱脫鹽來(lái)除去過(guò)量的戊二醛。通過(guò)在280nm的吸光度來(lái)量化所得的蛋白質(zhì)，并通過(guò)在變性和還原性條件中的SDSPAGE來(lái)評(píng)估。大部分純化的重組PreF測(cè)定為在PBS溶液中作為三聚體遷移。需要將溫育溫度提高至23°C來(lái)將大部分三聚體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成高分質(zhì)量聚集體，如通過(guò)SDSPAGE所確認(rèn)的。實(shí)施例4由PreF抗原進(jìn)行的體外中和抑制通過(guò)ELISA對(duì)自志愿者獲得的人血清篩選針對(duì)RSVA的反應(yīng)性，并基于先前對(duì)每份血清樣品建立的RSV中和潛力滴定以相關(guān)稀釋度在中和抑制(Ni)測(cè)定法中使用。簡(jiǎn)言之，將血清與在具有50%199-H培養(yǎng)基(其具有0.5%卩83、21111谷氨酰胺、501^/1111慶大霉素，均為Invitrogen)的DMEM中的25μg/ml濃度的抑制劑蛋白質(zhì)(PreF或基本上與美國(guó)專利No.5，194，595中所披露的嵌合TO對(duì)應(yīng)的對(duì)照蛋白質(zhì)，稱作RixTO)混合，并于37°C在轉(zhuǎn)輪上溫育1.5至2小時(shí)。將20μ1連續(xù)稀釋的血清和蛋白質(zhì)在圓底96孔板中與為每份血清樣品優(yōu)化抑制范圍而滴定的RSVA混合。將所得的混合物于33°C在5%CO2下溫育20分鐘以維持pH。然后將血清-抑制劑-病毒混合物放置入先前經(jīng)Vero細(xì)胞接種的平底96孔板中，并于33°C溫育2小時(shí)，之后添加160μ1培養(yǎng)基。將平板于33°C在5%CO2的情況中再溫育5-6天，直至進(jìn)行免疫熒光測(cè)定法來(lái)檢測(cè)NI滴度。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的低聚甲醛固定1小時(shí)后，用2%奶/PBS和封閉緩沖液來(lái)封閉平板。在不漂洗的情況中將山羊抗RSV抗體(BiodesignInternation；1400)添加至每孔，并于室溫(RT)溫育2小時(shí)。用PBS清洗樣品2x，并將封閉緩沖液中的抗山羊IgG-FITC(Sigma;l400)添加至各孔。將平板于RT再溫育2小時(shí)，并如上文那樣清洗2x，之后讀數(shù)。當(dāng)檢測(cè)出個(gè)熒光合胞體時(shí)，認(rèn)為孔呈陽(yáng)性。使用Spearman-Karber(SK)方法來(lái)實(shí)施50%組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50)計(jì)算，并如下計(jì)算NI的百分比[(Oyg/ml抑制劑的中和滴度-25μg/ml抑制劑的中和滴度)/Oμg/ml抑制劑的中和滴度]X100。圖3中顯示的例示性結(jié)果指明PreF在NI中在16/21名所測(cè)試供體中優(yōu)于re。實(shí)施例5:PreF抗原是免疫原件的為了證明PreF抗原的免疫原性，以兩周時(shí)間間隔用preF(6.5、3·1、0·63,0.13、和0.025μg/ml)和1/20人劑量的含有3DMPL和QS21的Thl佐劑("ASOIE")或preF(l、0.2和0.04μg/ml)和1/10人劑量的含有3DMPL和明礬的Thl佐劑(“AS04C”)IM免疫小鼠兩次，并在3周后收集血清。通過(guò)ELISA依照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程對(duì)合并的血清樣品測(cè)定抗原特異性IgG抗體滴度。簡(jiǎn)言之，用純化的、滅活的RSVA、RSVB和同源preF蛋白包被96孔板，并于4°C溫育過(guò)夜。與200ng/ml起始濃度的純化的小鼠IgG(Sigma，ON)一起將血清樣品在封閉緩沖液中連續(xù)稀釋，以150的起始濃度開(kāi)始，并于室溫溫育2小時(shí)。用偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Sigma，ON)檢測(cè)結(jié)合的抗體。使用3，3A，5，5A-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，BDOptEIATM,BDBiosciences,ON)作為HRP的底物。將50μ1IMΗ2804添加至每孔以停止反應(yīng)。用MolecularDevices微板讀板儀(MolecularDevices,USA)于450nm檢測(cè)每孔的吸光度值。圖4A和4B中詳述的代表性結(jié)果顯示了，在用PreF抗原免疫后，針對(duì)RSVA和RSVB兩者均引發(fā)強(qiáng)烈的滴度。實(shí)施例6=PreF引發(fā)中和件抗體在如上文實(shí)施例5中所描述的那樣免疫的小鼠的血清樣品中評(píng)估中和性抗體的存在和量。將來(lái)自經(jīng)免疫動(dòng)物的合并血清自18的起始稀釋度在RSV培養(yǎng)基中在96孔板(20μ1/孔)中連續(xù)稀釋。對(duì)照孔僅含有RSV培養(yǎng)基，或者150的山羊抗RSV抗體(Biodesigninternational)。將500-1000個(gè)感染劑量的代表性RSVA或B毒株添加至孔，并將平板于33°C,5%CO2溫育20分鐘，之后將混合物轉(zhuǎn)移至先前用IxlO5個(gè)細(xì)胞/mLVero細(xì)胞接種的96孔平底板。將細(xì)胞于33°C，5%CO2溫育約2小時(shí)，并再喂養(yǎng)，之后在相同溫度溫育5-6天。取出上清液；用PBS清洗平板，并用PBS中的低聚甲醛將粘附細(xì)胞固定1小時(shí)，接著進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)，其使用山羊抗RSV—抗和抗山羊IgG-FITC來(lái)檢測(cè)。圖5A和圖5B中顯示的代表性結(jié)果分別證明了，在用preF免疫的動(dòng)物的血清中檢測(cè)出顯著的針對(duì)兩種RSV毒株的中和性抗體。實(shí)施例7=PreF針對(duì)RSV攻擊提供保護(hù)如上文所描述的那樣以兩周時(shí)間間隔IM免疫小鼠兩次，并在第二次注射RSVA后3周進(jìn)行攻擊。通過(guò)測(cè)量攻擊后肺中存在的病毒來(lái)評(píng)估針對(duì)RSV的保護(hù)。簡(jiǎn)言之，安樂(lè)死后在無(wú)菌條件下取出來(lái)自經(jīng)免疫動(dòng)物的肺，并在15ml管中使用2個(gè)體積的IOml/肺在RSV培養(yǎng)基中清洗。然后對(duì)肺稱重，并在RSV培養(yǎng)基中用自動(dòng)化Potter勻漿器(Fisher，NepeanON)個(gè)別均漿化，并以2655xg于4°C離心2分鐘。通過(guò)在96孔板中先前接種的Vero細(xì)胞(ATCC#CCL-81)單層上進(jìn)行連續(xù)稀釋(8次重復(fù)，以110開(kāi)始)來(lái)滴定上清液中存在的病毒，并溫育6天。通過(guò)在低聚甲醛/PBSpH7.2中固定后用山羊抗RSV—抗和經(jīng)FITC標(biāo)記的抗山羊IgG二抗進(jìn)行的間接IFA來(lái)檢測(cè)RSV。圖6A和圖6B中顯示的代表性結(jié)果證明，在存在佐劑的情況中給予時(shí)等于或高于0.04μg的劑量引發(fā)針對(duì)RSV的強(qiáng)烈保護(hù)。實(shí)施例8:PreF在攻擊后不誘導(dǎo)肺嗜曙紅細(xì)朐慕集為了評(píng)估PreF抗原在免疫和隨后的攻擊后激起疾病加重的潛力，每次用(a)10Pg經(jīng)戊二醛處理的preF，(b)IOugpreF或(c)10μg沒(méi)有佐劑的FG免疫小鼠組(5只小鼠/組)兩次。加強(qiáng)免疫后3周用RSVA攻擊小鼠，并在攻擊后4天實(shí)施支氣管肺泡灌洗(BAL)。對(duì)每只小鼠的BAL中的總白細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)以及基于巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行區(qū)別計(jì)數(shù)(300個(gè)細(xì)胞)。將總細(xì)胞數(shù)目乘以每只動(dòng)物的嗜曙紅細(xì)胞的區(qū)別百分比。所表示的是每組的幾何均值，置信限度95%。圖7中顯示的代表性結(jié)果證明，嗜曙紅細(xì)胞在用preF免疫和攻擊后并不募集至肺。此外，這些結(jié)果提示，與preF的有意聚集形式(戊二醛處理)或FG抗原(天然聚集的)相比，PreF抗原的可溶性質(zhì)不偏愛(ài)嗜曙紅細(xì)胞。序列表SEQIDNO1編碼RSV參照融合蛋白的核苷酸序列毒株A2GenBank登錄號(hào)U50362atggagttgctaatcctcaaagcaaatgcaattaccacaatcctcactgcagtcacatttgttttgcttctggtcaaaacatcactgaagaattttatcaatcaacatgcagtgcagtagcaaaggctatcttagtgctctgagaactggttggtataccagtgttataactatagattaagtaatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattgataaacaagaattagataaatataaaaatgctgtaacagaattgcagttgctcatgcaaagcacccagcaacaaacaatcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaaaatgccaaaaaaaccaatgtaacattaagcaagaaaaggaaaagaagatttcttggtttttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcgttgctgtatctaaggtcctgcacctgaaggggaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggctgtagtcagttatcaaatggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagaaaacaattgttacctattgtgaacaagcaaagctgcagcatatcaaatatagcaactgtatagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccagggaatttagtgttaagcaggtgtaactacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcattatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgtccaacaatgttcaaatgttagacagcaaagttactctatcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgtgtacaattaccactatatggtgttatagatacaccctgttggaaactacacacatccccctatgtacaaccaacacaaaagaagggtccaacatctgtttaacaagaactgacagaggtggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtcaatcaaatcgagtattttgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaactctgcaatgttgacatattcaaccccaaatatgattgtaaaattatgacttcaaaaacgatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatggcaaaacaaatgtacagcatccaataaaaatcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgcgatatgtatcaaataaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattatgtaaaaagcaagaaggtaaaagtctctatgtaaaaggtgaaccaataataaatttctatgacccttagtattcccctctgatgaatttgatgcatcaatatctcaagtcaacgagaagattaacagagcctagcatttattcgtaaatccgatgaattattacataatgtaaatgctggtaatccaccataaatatcatgataactactataattatagtgattatagtaatattgttatcttaattgctgttggactgctcttatactgtaaggccagaagcacaccagtcacactaagaaagatcaactgagtggtataaataatattgcatttagtaactaaSEQIDNO2RSV參照F蛋白前體FO的氨基酸序列毒株A2GenBank登錄號(hào)AAB86664________________________MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLffi,EGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIATVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMJNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQsnrvfcdiinsltlpsevnlcnvdifnpkydckimtsktdvsssvitslgaivscygktkctasnknrgiιKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTINIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNSEQIDNO3編碼RSV參照G蛋白的核苷酸序列毒株LongAtgtccaaaaacaaggaccaacgcaccgctaagacactagaaaagacctgggacactctcaatcatttattattcatatcatcgggcttatataagttaaatcttaaatctatagcacaaatcacattatccattctggcaatgataatctcaacttcacttataattacagccatcatattcatagcctcggcaaaccacaaagtcacactaacaactgcaatcatacaagatgcaacaagccagatcaagaacacaaccccaacatacctcactcaggatcctcagcttggaatcagcttctccaatctgtctgaaattacatcacaaaccaccaccatactagcttcaacaacaccaggagtcaagtcaaacctgcaacccacaacagtcaagactaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccactacaaaacaacgccaaaacaaaccaccaaacaaacccaataatgattttcacttcgaagtgtttaactttgtaccctgcagcatatgcagcaacaatccaacctgctgggctatctgcaaaagaataccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagcctacaaaaaaaccaaccttcaagacaaccaaaaaagatctcaaacctcaaaccactaaaccaaaggaagtacccaccaccaagcccacagaagagccaaccatcaacaccaccaaaacaaacatcacaactacactgctcaccaacaacaccacaggaaatccaaaactcacaagtcaaatggaaaccttccactcaacctcctccgaaggcaatctaagcccttctcaagtctccacaacatccgagcacccatcacaaccctcatctccacccaacacaacacgccagtagSEQIDNO4RSV參照G蛋白的氨基酸序列____________________________一_____——_________‘_______MSKNKDQRTAKTLEKTWDTLmXFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLTTAIIQDATSQIKNTTPTYLTQDPQIjGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTC1AICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLK.................................................................-............................PQTTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNTTRQSeqIDNO5針對(duì)CHO優(yōu)化的PreF類似物的核苷酸序列aagcttgccaccatggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggcctgataatctagaSEQIDNO6PreF類似物的氨基酸序列MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLffl￡GEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTmTNSELLSLINDMPITNDQKKmSNNVQIVRQQSYS頂SIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDQaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEASeqIDNO7針對(duì)CHO優(yōu)化的編碼PreF—Vl的核苷酸序列—aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggctggcggctctggcggcagcggcggctccaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaagcaccaccaccatcaccactgataatctaSeqIDNO8用于CHO的PreF—Vl肽MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKOELDKYKSAVTEIXaii^STPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKHEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYfflJNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCMLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDIMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGSGGSGGSKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCMICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPOTTKPKEVPTTKSeqIDNO9用于CHO的PreF—V2肽aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggctggcggcaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaagcaccaccaccatcaccactgataatctaSeqIDNO10用于CHO的PreF—V2肽MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKOELDKYKSAVTEIXaii^STPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKHEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKaLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYfflJNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCMLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDIMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTKSEQIDNO11例示性卷曲螺旋(異亮氨酸拉鏈)EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEASEQIDNO12PreF抗原多核苷酸CH02atggagctgcccatcctgaagaccaacgccatcaccaccatcctcgccgccgtgaccctgtgcttcgccagcagccagaacatcacggaggagttctaccagagcacgtgcagcgccgtgagcaagggctacctgagcgcgctgcgcacgggctggtacacgagcgtgatcacgatcgagctgagcaacatcaaggagaacaagtgcaacggcacggacgcgaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgcggtgacggagctgcagctgctgatgcagagcacgccggcgacgaacaacaagttcctcggcttcctgctgggcgtgggcagcgcgatcgcgagcggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagtccgcgctgctgagcacgaacaaggcggtcgtgagcctgagcaacggcgtgagcgtgctgacgagcaaggtgctcgacctgaagaactacatcgacaagcagctgctgccgatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccgcctgctggagatcacgcgggagttctccgtgaacgcaggcgtgacgacgcccgtgtctacgtacatgctgacgaacagcgagctgctcagcctgatcaacgacatgccgatcacgaacgaccagaagaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcgccagcagagctacagcatcatgagcatcatcaaggaggaggtgctggcatacgtggtgcagctgccgctgtacggcgtcatcgacacgccctgctggaagctgcacacgagcccgctgtgcacgaccaacacgaaggagggcagcaacatctgcctgacgcggacggaccggggctggtactgcgacaacgcgggcagcgtgagcttcttcccgctcgcggagacgtgcaaggtgcagagcaaccgcgtcttctgcgacacgatgaacagcctgacgctgccgagcgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaacccgaagtacgactgcaagatcatgacgagcaagaccgatgtcagcagcagcgtgatcacgagcctcggcgcgatcgtgagctgctacggcaagacgaagtgcacggcgagcaacaagaaccgcggcatcatcaagacgttcagcaacggctgcgactatgtgagcaacaagggcgtggacactgtgagcgtcggcaacacgctgtactacgtgaacaagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagccgatcatcaacttctacgacccgctcgtgttcccgagcgacgagttcgacgcgagcatcagccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggcgttcatccgcaagagcgacgagaagctgcacaacgtggaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatcgcgcgcatcaagaagctgatcggcgaggcgcatcatcaccatcaccattgaSEQIDNO13具有內(nèi)含子的PreF抗原多核苷酸atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtacgtgtcgggacttgtgttcccctttttttaataaaaagttatatctttaatgttatatacatatttcctgtatgtgatccatgtgcttatgactttgtttatcatgtgtttaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaaga42ccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccggaggtcaccaccaccatcaccactgaSEQIDNO:14合成的接頭序列GGSGGSGGSSEQIDNO:15弗林蛋白酶切割位點(diǎn)RARRSEQIDNO:16弗林蛋白酶切割位點(diǎn)RKRR4權(quán)利要求一種重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，其包含可溶性F蛋白多肽，該可溶性F蛋白多肽包含至少一處穩(wěn)定所述F蛋白的融合前構(gòu)象的修飾。2.一種重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，其包含可溶性F蛋白多肽，該F蛋白多肽包含至少一處選自下組的修飾(i)添加包含異源三聚化域的氨基酸序列；()刪除至少一個(gè)弗林蛋白酶切割位點(diǎn)；(iii)刪除至少一個(gè)非弗林蛋白酶切割位點(diǎn)；(iv)刪除pep27域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸；和(ν)所述F蛋白胞外域的疏水域中的至少一處親水性氨基酸替代或添加。3.權(quán)利要求1或2的重組RSV抗原，其中所述可溶性F蛋白多肽包含RSVF蛋白多肽WF2域和F1域。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述至少一處修飾包含添加包含異源三聚化域的氨基酸序列。5.權(quán)利要求4的重組RSV抗原，其中所述異源三聚化域位于所述F1域的C端。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其包含沒(méi)有居間弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的&域和F1域。7.一種融合(F)蛋白類似物，其包含RSVF蛋白多肽的F2域和F1域，其中所述F2域與所述F1域之間沒(méi)有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，并且其中所述多肽進(jìn)一步包含位于所述F1域(端的異源三聚化域。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原裝配成三聚體。9.權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述F2域至少包含RSVF蛋白多肽中與參照F蛋白前體多肽(Ftl)SEQIDNO2的氨基酸26-105對(duì)應(yīng)的一部分。10.權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述F1域至少包含RSVF蛋白多肽中與參照F蛋白前體多肽(Ftl)SEQIDNO2的氨基酸137-516對(duì)應(yīng)的一部分。11.權(quán)利要求3-10任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述F2域包含與參照F蛋白前體多肽(F0)SEQIDNO2的氨基酸26-105對(duì)應(yīng)的RSVF蛋白多肽和/或其中所述F1域包含與參照F蛋白前體多肽(Ftl)SEQIDNO2的氨基酸137-516對(duì)應(yīng)的RSVF蛋白多肽。12.權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原選自下組a)包含SEQIDNO6的多肽；b)在嚴(yán)格條件下在基本上其整個(gè)長(zhǎng)度里與SEQIDNO:6雜交的多肽，所述多肽包含與天然存在的RSV株對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；c)與SEQIDNO:6具有至少95%序列同一性的多肽，所述多肽包含不與天然存在的RSV株對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其進(jìn)一步包含信號(hào)肽。14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述F2域包含RSVF蛋白多肽的氨基酸1-105。15.權(quán)利要求3-14任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述F2域和所述F1域在沒(méi)有居間ρ印27域的情況中定位。16.權(quán)利要求4-15任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述異源三聚化域包含卷曲螺旋域。17.權(quán)利要求16的重組RSV抗原，其中所述多聚化域包含異亮氨酸拉鏈。18.權(quán)利要求17的重組RSV抗原，其中所述異亮氨酸拉鏈域包含氨基酸序列SEQIDNO:11ο19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含所述F蛋白胞外域的疏水域中的至少一處親水性氨基酸替代或添加。20.權(quán)利要求19的重組RSV抗原，其中所述疏水域是所述F蛋白胞外域的HRB卷曲螺旋域。21.權(quán)利要求20的重組RSV抗原，其中所述HRB卷曲螺旋域在與參照F蛋白前體(F。)SEQIDNO:2的氨基酸512對(duì)應(yīng)的位置處包含用帶電荷的殘基替換中性殘基的替代。22.權(quán)利要求21的RSV抗原，其中所述HRB卷曲螺旋域在與參照F蛋白前體(Ftl)SEQIDNO2的氨基酸512對(duì)應(yīng)的位置處包含用賴氨酸對(duì)亮氨酸的替代。23.權(quán)利要求19的重組RSV抗原，其中所述疏水域是所述F蛋白胞外域的HRA域。24.權(quán)利要求23的重組RSV抗原，其中所述HRA域包含在與參照F蛋白前體(Ftl)SEQIDNO2的氨基酸105對(duì)應(yīng)的位置后添加帶電荷的殘基。25.權(quán)利要求24的重組RSV抗原，其中所述HRA域包含在與參照F蛋白前體(Ftl)SEQIDNO2的氨基酸105對(duì)應(yīng)的位置后添加賴氨酸。26.權(quán)利要求19-25任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含所述F蛋白胞外域的HRA域中的至少第一處親水性氨基酸替代或添加和HRB域中的至少第二處親水性氨基酸替代或添加。27.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含至少一處消除天然存在的F蛋白前體(Ftl)中存在的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸添加、刪除或替代。28.權(quán)利要求27的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原在與所述參照F蛋白前體(F。)SEQIDNO2的氨基酸105-109對(duì)應(yīng)的位置、與氨基酸133-136對(duì)應(yīng)的位置、或與氨基酸105-109和133-136對(duì)應(yīng)的兩個(gè)位置處包含消除弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸添加、刪除或替代。29.權(quán)利要求1-28任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其進(jìn)一步包含G蛋白多肽，該G蛋白多肽包含RSVG蛋白多肽的氨基酸位置149至229。30.權(quán)利要求29的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原選自下組a)包含SEQIDNO8或SEQIDNO10的多肽；b)在嚴(yán)格條件下在基本上其整個(gè)長(zhǎng)度里與SEQIDNO8和SEQIDNO10中至少一項(xiàng)雜交的多肽，所述多肽包含與天然存在的RSV株對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；c)與SEQIDNO8和SEQIDNO10中至少一項(xiàng)具有至少95%序列同一性的多肽，所述多肽包含不與天然存在的RSV株對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。31.權(quán)利要求29或30的重組RSV抗原，其中所述G蛋白多肽包含與參照G蛋白序列SEQIDNO4的氨基酸位置149至229對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。32.權(quán)利要求31的重組RSV抗原，其中所述G蛋白多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸149-229。33.權(quán)利要求29或30的重組RSV抗原，其中所述G蛋白多肽包含相對(duì)于天然存在的RSV多肽的至少一處氨基酸替代，所述氨基酸替代與減輕或預(yù)防疫苗增強(qiáng)性病毒疾病有關(guān)。34.權(quán)利要求33的重組RSV抗原，其中所述增強(qiáng)性病毒疾病在沒(méi)有佐劑的情況中對(duì)受試者施用所述RSV抗原時(shí)得到減輕或預(yù)防。35.權(quán)利要求33的重組RSV抗原，其中所述疫苗增強(qiáng)性病毒疾病在對(duì)人受試者施用所述RSV抗原時(shí)得到減輕或預(yù)防。36.權(quán)利要求33的重組RSV抗原，其中所述G蛋白多肽包含G蛋白的第191位用丙氨酸對(duì)天冬酰胺的替代(N191A)。37.權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其進(jìn)一步包含接頭。38.權(quán)利要求37的重組RSV抗原，其中所述接頭包含氨基酸序列GG。39.權(quán)利要求38的重組RSV抗原，其中所述接頭包含氨基酸序列GGSGGSGGS。40.權(quán)利要求39的重組RSV抗原，其中所述接頭選自下組氨基酸序列GG和GGSGGSGGS。41.權(quán)利要求1-40任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述F蛋白多肽在序列上與RSVALong株對(duì)應(yīng)。42.權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述F蛋白多肽進(jìn)一步包含多組氨酸標(biāo)簽。43.權(quán)利要求1-42任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含多肽的多聚體。44.權(quán)利要求1-43任一項(xiàng)的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含多肽的三聚體。45.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1-44任一項(xiàng)的重組RSV抗原和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。46.權(quán)利要求45的免疫原性組合物，其中所述載體或賦形劑包含緩沖劑。47.權(quán)利要求45或46的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。48.權(quán)利要求47的免疫原性組合物，其中所述佐劑引發(fā)Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答。49.權(quán)利要求48的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含3D-MPL、QS21、水包油乳劑、和明礬中至少一項(xiàng)。50.權(quán)利要求49的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含水包油乳劑。51.權(quán)利要求49或50的免疫原性組合物，其中所述水包油乳劑包含母育酚。52.權(quán)利要求49-51任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含3D-MPL。53.權(quán)利要求49的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含3D-MPL。54.權(quán)利要求53的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含明礬。55.權(quán)利要求53的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含QS21。56.權(quán)利要求55的免疫原性組合物，其中所述3D-MPL和QS21在脂質(zhì)體配制劑中。57.權(quán)利要求47或48的免疫原性組合物，其中所述佐劑適合于對(duì)新生兒施用。58.權(quán)利要求45-57任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物減輕或預(yù)防感染呼吸道合胞病毒(RSV)。59.權(quán)利要求45-58任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物減輕或預(yù)防RSV感染后的病理學(xué)應(yīng)答。60.權(quán)利要求45-59任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在所述免疫原性組合物包含權(quán)利要求1-28任一項(xiàng)的重組RSV抗原時(shí)，所述免疫原性組合物進(jìn)一步包含G蛋白多肽，該G蛋白多肽包含與RSVG蛋白多肽的氨基酸位置149至229對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。61.權(quán)利要求60的免疫原性組合物，其中所述G蛋白多肽包含與RSVG蛋白多肽的氨基酸位置128-229對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。62.權(quán)利要求60或61的免疫原性組合物，其中所述G蛋白多肽包含與參照G蛋白序列SEQIDNO4的氨基酸位置149至229對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。63.權(quán)利要求62的免疫原性組合物，其中所述G蛋白多肽包含SEQIDNO4的氨基酸149-229。64.權(quán)利要求60或61的免疫原性組合物，其中所述G蛋白多肽包含相對(duì)于天然存在的RSV多肽的至少一處氨基酸替代，所述氨基酸替代與減輕或預(yù)防疫苗增強(qiáng)性病毒疾病有關(guān)。65.權(quán)利要求60或64的免疫原性組合物，其中所述G蛋白多肽包含全長(zhǎng)G蛋白多肽或至少包含G蛋白多肽的一部分的融合蛋白。66.權(quán)利要求45-65任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含與RSV不同的病原性生物體的至少一種別的抗原。67.權(quán)利要求66的免疫原性組合物，其中所述至少一種別的抗原是與RSV不同的病毒的。68.權(quán)利要求67的免疫原性組合物，其中所述病毒選自乙肝病毒(HBV)、副流感病毒(PIV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒和流感病毒。69.權(quán)利要求66的免疫原性組合物，其中所述至少一種別的抗原選自白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血菌、和肺炎球菌。70.一種重組核酸，其包含編碼權(quán)利要求1-44任一項(xiàng)的重組RSV抗原的多核苷酸序列。71.權(quán)利要求70的重組核酸，其中對(duì)所述編碼RSV抗原的多核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)。72.—種載體，其包含權(quán)利要求70或71的重組核酸。73.權(quán)利要求72的載體，其中所述載體包括原核或真核表達(dá)載體。74.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求70或71的核酸或權(quán)利要求72或73的載體。75.權(quán)利要求74的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自下組細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。76.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求70或71的核酸和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。77.權(quán)利要求1-44任一項(xiàng)的RSV抗原或權(quán)利要求70或71的核酸在制備用于治療RSV感染的藥物中的用途。78.權(quán)利要求76的RSV抗原或核酸的用途，其中為了預(yù)防性處理RSV感染的目的而施用所述藥物。79.一種用于引發(fā)針對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對(duì)受試者施用包含權(quán)利要求1-44任一項(xiàng)的重組RSV抗原的組合物或權(quán)利要求45-69任一項(xiàng)的免疫原性組合物。80.權(quán)利要求79的方法，其中施用所述包含RSV抗原的組合物引發(fā)對(duì)RSV特異性的免疫應(yīng)答，而不在與RSV接觸后增強(qiáng)病毒疾病。81.權(quán)利要求79或80的方法，其中所述免疫應(yīng)答包含Thl偏愛(ài)性免疫應(yīng)答。82.權(quán)利要求79-81任一項(xiàng)的方法，其中所述免疫應(yīng)答包含減輕或預(yù)防感染RSV和/或5減輕或預(yù)防RSV感染后的病理學(xué)應(yīng)答的保護(hù)性免疫應(yīng)答。83.權(quán)利要求79-82任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人受試者。84.權(quán)利要求79-83任一項(xiàng)的方法，包括施用所述包含RSV抗原的組合物包括經(jīng)由鼻內(nèi)路徑的施用。85.權(quán)利要求79-83任一項(xiàng)的方法，包括施用所述包含RSV抗原的組合物包括經(jīng)由肌內(nèi)路徑的施用。86.權(quán)利要求1-44任一項(xiàng)的重組RSV抗原或權(quán)利要求45-69任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其用于在藥物中使用。87.權(quán)利要求1-44任一項(xiàng)的重組RSV抗原或權(quán)利要求45-69任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其用于預(yù)防或治療RSV相關(guān)疾病。全文摘要本公開(kāi)內(nèi)容提供了重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原及其制備和使用方法，包括用于治療和/或預(yù)防RSV感染的免疫原性組合物(例如疫苗)。文檔編號(hào)C12N15/62GK101952321SQ200880127407公開(kāi)日2011年1月19日申請(qǐng)日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日發(fā)明者帕特里克·雷奧爾特,讓-皮埃爾·鮑杜克斯,讓-路易斯·魯爾,諾曼德·布萊斯申請(qǐng)人:魁北克益得生物醫(yī)學(xué)公司;葛蘭素史密斯克萊生物公司