專利名稱：高產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇的酵母生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了代謝上經(jīng)工程改造的微生物和產(chǎn)生這種生物體的方法。還提供了制 備作為生物燃料的代謝產(chǎn)物的方法，所述方法通過將合適的底物與代謝上經(jīng)工程改造的生 物和來自該生物的酶制備物接觸來進(jìn)行。
背景技術(shù)：
生物燃料具有很長的歷史，其可以追溯到20世紀(jì)初。早在1900年，Rudolf Diesel 在法國巴黎世界博覽會(huì)上展示了依賴于花生油運(yùn)轉(zhuǎn)的機(jī)器。此后不久，Henry Ford展示了 他的依賴于源自玉米的乙醇運(yùn)行的福特T型車。由于石油衍生的燃料供應(yīng)量增加和較低成 本下的高效率，在20世紀(jì)30年代和40年代石油衍生的燃料取代了生物燃料。在20世紀(jì)70年代與美國油產(chǎn)量下降相伴隨的市場波動(dòng)導(dǎo)致了原油價(jià)格增長，而 生物燃料重新得到關(guān)注。今天，許多利益集團(tuán)，包括政策制定者、工業(yè)策劃者、有所意識(shí)的市 民和金融界都對用生物質(zhì)衍生的生物燃料取代石油衍生的燃料感興趣。發(fā)展生物燃料的主 要?jiǎng)訖C(jī)是其經(jīng)濟(jì)性、政治性和環(huán)保性。其中之一“油品高峰(peak oil)，，的威脅，即原油消耗率超過供給率，從而導(dǎo)致燃 料成本價(jià)顯著增加，這導(dǎo)致對替代性燃料需求的增加。另外，中東和其他富油區(qū)域的不穩(wěn)定 性增加了對本土生產(chǎn)生物燃料的需求。此外，與二氧化碳相關(guān)的氣候變化的可能性有關(guān)的 環(huán)境問題是一個(gè)重要的社會(huì)和道德的驅(qū)動(dòng)力，這種驅(qū)動(dòng)力開始致使形成政府的規(guī)章和政策， 如汽車的二氧化碳排放量的上限、對二氧化碳排的稅收以及對使用生物燃料的稅收激勵(lì)。乙醇是目前最豐富的發(fā)酵生產(chǎn)的燃料，但是其與汽油相比有幾個(gè)缺點(diǎn)。相比之下， 丁醇作為燃料與乙醇相比有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)其可以由與生產(chǎn)乙醇相同的原料制備，但是與乙醇 不同，它可以與汽油以任何比率相容，并且也可以不經(jīng)過改性在現(xiàn)存的內(nèi)燃機(jī)中作為純?nèi)?料使用。與乙醇不同，丁醇不吸水并因此可以在現(xiàn)有的石油化工基礎(chǔ)設(shè)施中儲(chǔ)存和分銷。由 于其接近于汽油的高能含量，其燃料經(jīng)濟(jì)性(英里/加侖)優(yōu)于乙醇。此外，丁醇-汽油混 和物比乙醇-汽油混和物具有更低的蒸氣壓，其在降低蒸發(fā)性碳?xì)浠衔锱欧胖泻苤匾?。異丁醇具有與丁醇相同的優(yōu)點(diǎn)，并且由于支化的碳鏈其還具有更高的辛烷值這個(gè) 額外的優(yōu)點(diǎn)。異丁醇作為商品化的化學(xué)品也很有用，并且也是MTBE的前體。異丁醇可以在 表達(dá)異源性代謝途徑的微生物中產(chǎn)生，但是這些微生物由于其固有的低性能特征而不適用 于商業(yè)，低性能特征包括低繁殖力、低滴度、低產(chǎn)率和在發(fā)酵過程中對氧的需求。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了產(chǎn)生異丁醇的方法。該方法包括提供包含產(chǎn)生異丁醇
10的代謝途徑的重組微生物，所述微生物經(jīng)選擇從而以至少5%的理論產(chǎn)率(at a yield of at least 5 percent theoretical)從碳源產(chǎn)生異丁醇。該方法進(jìn)一步包括在包含提供碳 源的原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，直至產(chǎn)生可回收量的異丁醇，以及回收異丁醇。在一些方 面，所述微生物經(jīng)選擇從而在以高于約10%、20%或50%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。在另一實(shí)施方式中，此處提供的方法包括經(jīng)工程化改造從而與親本微生物相比包 括降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性的重組微生物。在一方面，所述重組微生物在至少一種 丙酮酸脫羧酶(PDC)基因中包括突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性 的降低。在另一方面，所述重組微生物包括對丙酮酸脫羧酶(PDC)基因的部分缺失，其導(dǎo)致 由該基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性的降低。在另一方面，所述重組微生物包含對丙 酮酸脫羧酶(PDC)基因的完全缺失，其導(dǎo)致由該基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性的降 低。在又一方面，所述重組微生物包括對與至少一種丙酮酸脫羧酶(PDC)基因相關(guān)的調(diào)節(jié) 區(qū)的修飾，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性的降低。在另一方面，所述重 組微生物包含對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的修飾，其導(dǎo)致丙酮酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)錄的減少。在另一方面，所 述重組微生物在所有丙酮酸脫羧酶(PDC)基因中包含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽 的丙酮酸脫羧酶活性的降低。在另一實(shí)施方式中，此處提供的方法利用已經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而表達(dá)將丙酮酸 (pyruvate)轉(zhuǎn)化成異丁醇的異源代謝途徑的重組微生物。在一方面，所述重組微生物經(jīng)進(jìn) 一步工程改造從而增加將丙酮酸轉(zhuǎn)化成異丁醇的天然(naive)代謝途徑的活性。在另一方 面，所述重組微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而包括至少一種由異源基因編碼的酶和至少一種 由天然基因編碼的酶。在又一方面，所述重組微生物經(jīng)選擇從而包括將丙酮酸轉(zhuǎn)化成異丁 醇的天然代謝途徑。在一個(gè)實(shí)施方式中，此處提供的方法包含酵母屬進(jìn)化枝(Saccharomyces clade) 的酵母重組微生物。另一個(gè)實(shí)施方式中，此處提供的方法包括重組生物體，其為酵母屬狹義酵母微生 物(Saccharomyces sensu stricto yeast microorganism) 在一方面，酵母屬狹義酵母 微生物選自如下的種之一釀酒酵母、釀酒酵母、庫德里阿茲威酵母(S. kudriavzevii), S. mikatae、貝酵母、葡萄汁酵母、S. carocanis或其雜種。在另一實(shí)施方式中，此處提供的方法包括Crabtree-陽性重組酵母微生物。在一 方面，Crabtree-陽性酵母微生物選自如下的屬之一酵母屬、克魯維酵母屬、接合酵母屬、 德巴利酵母屬、畢赤酵母屬或裂殖酵母屬。在另外的方面，Crabtree-陽性酵母微生物選自 釀酒酵母、葡萄汁酵母、貝酵母、奇異酵母、Saccharomyces castelli、克魯弗酵母、耐熱克 魯維酵母、光滑假絲酵母、拜耳接合酵母、魯氏接合酵母菌、漢遜德巴利酵母、巴斯德畢赤酵 母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。在另一實(shí)施方式中，此處提供的方法包括后-WGD (全基因組倍增)酵母微生物。在 一方面，后-WGD酵母選自酵母菌屬或假絲酵母屬之一。在另一方面，后-WGD酵母選自釀酒 酵母、葡萄汁酵母、貝酵母、奇異酵母、Saccharomyces castelli和光滑假絲酵母。在另一實(shí)施方式中，提供了一種產(chǎn)生異丁醇的方法。該方法包括提供重組微生物， 其包括產(chǎn)生異丁醇的代謝途徑并經(jīng)選擇從而由碳源產(chǎn)生異丁醇。重組體進(jìn)一步包括與親本 微生物相比減少的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性。該方法包括在包含提供碳源的原料的培養(yǎng)基
11中培養(yǎng)所述微生物直到產(chǎn)生可回收量的異丁醇并回收異丁醇。在一些方面，所述微生物是 酵母進(jìn)化枝的酵母。在其他方面，所述微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于親本微生物 生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。在一方面，所 述微生物是酵母屬狹義酵母。在另一方面，所述微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于親 本微生物生長速率的生長速率不依賴C2化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。在其他方面，所述微生物是Crabtree-陰性酵母微生物，其選自如下的屬之一 克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬或假絲酵母屬。在其他方面，所述Crabtree-陰 性酵母微生物選自乳酸克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、異常畢赤酵母、樹干畢赤酵母、異 常漢遜酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或Kluyveromyces Waltii0在其他方面，所述Crabtree-陰性 酵母微生物選自茁牙絲孢酵母、嗜木紅酵母或Myxozyma vanderwaltii、乙醇假絲酵母、 Debaromyces carsonii> Pichia castillae。在另一方面，所述微生物是Crabtree-陽性酵母微生物。在一些方面，所述微生 物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在 葡萄糖上生長而PDC活性不改變。Crabtree-陽性酵母微生物可以選自如下的屬之一 酵母菌屬、克魯維酵母屬、接合酵母屬、德巴利酵母屬、畢赤酵母屬或裂殖酵母屬。在其 它方面，所述Crabtree-陽性酵母微生物選自釀酒酵母、葡萄汁酵母、貝酵母、奇異酵母、 Saccharomyces castelli、克魯弗酵母、耐熱克魯維酵母、光滑假絲酵母、拜耳接合酵母、魯 氏接合酵母、漢遜德巴利酵母、巴斯德畢赤酵母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。在其它方面， 所述微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于親本微生物生長速率的生長速率生長不依賴 C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。在其它方面，所述微生物是選自酵母屬或假絲酵母屬之一的后-WGD (全基因組 倍增)酵母。在其它方面，后-WGD酵母選自釀酒酵母、葡萄汁酵母、貝酵母、奇異酵母、 Saccharomyces casteili和光滑假絲酵母。在其它方面，所述微生物經(jīng)工程改造從而以基 本上等同于親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性 不改變。在另一方面，所述微生物是前-WGD(全基因組倍增)酵母，其選自如下的屬之一 酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、管囊酵母屬 (Pachysolen)、西洋蓍霉屬或裂殖酵母屬。在其它方面，前-WGD酵母選自如下克魯弗酵 母、耐熱克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克魯維酵母、熱帶假 絲酵母、巴斯德畢赤酵母、異常畢赤酵母、樹干畢赤酵母、漢遜德巴利酵母、異常漢遜酵母、 嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tarmophilis)、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。在其它方面，此處提供的方法包括是非-發(fā)酵酵母微生物的微生物，其選自如下 的屬之一絲孢酵母屬、紅酵母屬或Myxozyma。在另一實(shí)施方式中，提供了重組微生物。該微生物包括產(chǎn)生異丁醇的代謝途徑，所 述微生物經(jīng)選擇從而由碳源產(chǎn)生異丁醇。所述微生物還包括與親本微生物相比降低的丙酮 酸脫羧酶(PDC)活性。在多個(gè)方面，此處提供的微生物包括Crabtree-陰性酵母微生物、酵 母進(jìn)化枝的微生物、酵母屬狹義酵母微生物、Crabtree-陽性酵母微生物、后_WGD(全基因 組倍增)酵母微生物、前-WGD (全基因組倍增)酵母微生物和非發(fā)酵酵母微生物。在一些實(shí)施方式中，此處提供的微生物已經(jīng)工程修飾從而以基本上等同于親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。附圖簡述在附圖中說明了本發(fā)明的例示性實(shí)施方式，其中

圖1例示了異丁醇途徑的示范性實(shí)施方式；圖2A例示了經(jīng)由糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，以及將丙酮酸轉(zhuǎn)化成異丁醇的異丁醇途徑 和將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和二氧化碳的PDC途徑；圖2B例示了異丁醇途徑，由于PDC途徑的缺失或減少，該異丁醇途徑接受額外的 丙酮酸以高產(chǎn)率地形成異丁醇；圖EX4-1例示了在釀酒酵母Pdc-負(fù)型菌株GEV01584恒化進(jìn)化過程中隨時(shí)間變化 的碳源組成以及進(jìn)料速率。該圖顯示乙酸鹽怎樣在480小時(shí)的時(shí)間內(nèi)從0. 375g/L減少到 Og/L。其還顯示了總進(jìn)料速率。較高的進(jìn)料速率意味著生長速率較高。由于恒化器包含 200ml培養(yǎng)物，稀釋速率可以通過將進(jìn)料率除以200ml計(jì)算得到；圖EX4-2例示了與親本菌株GEVOl 187相比在YPD中進(jìn)化的(evolved) Pdc-負(fù)型 突變株GEV01863的生長。圖EX4-3例示了與親本菌株GEVOl 187不同，變體PCD突變株GEV01863在YPD培
養(yǎng)基中不產(chǎn)生乙醇。圖EXl-I例示了質(zhì)粒pGV1503的示意圖。圖EX1-2例示了質(zhì)粒pGV1537的示意圖。圖EX5-1例示了質(zhì)粒pGV1429的示意圖。圖EX5-2例示了質(zhì)粒pGV1430的示意圖。圖EX5-3例示了質(zhì)粒pGV1431的示意圖。圖EX5-4例示了質(zhì)粒pGV1472的示意圖。圖EX5-5例示了質(zhì)粒pGV1473的示意圖。圖EX5-6例示了質(zhì)粒pGV1475的示意圖。圖EX6-1例示了質(zhì)粒pGV1254的示意圖。圖EX6-2例示了質(zhì)粒pGV1295的示意圖。圖EX6-3例示了質(zhì)粒pGV1390的示意圖。圖EX6-4例示了質(zhì)粒pGV1438的示意圖。圖EX7-1例示了質(zhì)粒pGV1590的示意圖。圖EX7-2例示了質(zhì)粒P GV1726的示意圖。圖EX7-3例示了質(zhì)粒pGV1727的示意圖。圖EX8-1例示了質(zhì)粒pGV1056的示意圖。圖EX8-2例示了質(zhì)粒pGV1062的示意圖。圖EX8-3例示了質(zhì)粒pGV1102的示意圖。圖EX8-4例示了質(zhì)粒pGV1103的示意圖。圖EX8-5例示了質(zhì)粒pGV1104的示意圖。圖EX8-6例示了質(zhì)粒pGV1106的示意圖。圖EX8-7例示了質(zhì)粒P GV1649的示意圖。圖EX8-8例示了質(zhì)粒pGV1664的示意圖。
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圖EX8-9例示了質(zhì)粒pGV1672的示意圖。圖EX8-10例示了質(zhì)粒pGV1673的示意圖。圖EX8-11例示了質(zhì)粒pGV1677的示意圖。圖EX8-12例示了質(zhì)粒pGV1679的示意圖。圖EX8-13例示了質(zhì)粒pGV1683的示意圖。發(fā)明詳述除非上下文中另有明確表示，如在此處及所附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式 的“一種/ 一個(gè)”、“和”以及“該/所述”(“a"，“ and" and" the")包括復(fù)數(shù)的所指 對象。因此，例如，提及“一種/ 一個(gè)多核苷酸”包括多個(gè)這樣的多核苷酸，而提及“該/所 述微生物”包括提及一種或多種微生物等。除非另外限定，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬的技術(shù)領(lǐng)域一 個(gè)普通技術(shù)人員所理解的相同的含義。盡管與那些在此處描述的方法和材料相似或等價(jià)的 方法和材料可以用于所公開的方法和組合物中，此處描述了示例性的方法、裝置和材料。上文以及全文中討論的任何出版物僅是為了它們在本申請申請日之前的公開內(nèi) 容而提供的。都不應(yīng)理解為發(fā)明人由于在先公開的內(nèi)容而承認(rèn)本文的內(nèi)容不能置于這些內(nèi) 容之前。術(shù)語“微生物”包括來自古細(xì)菌域、細(xì)菌域和真核域(Domains Archaea，Bacteria and Eucarya)的原核和真核微生物種，后者包括酵母和絲狀真菌、原生動(dòng)物、藻類或高等原 生生物(Protista)。術(shù)語“微生物細(xì)胞”和“微生物(microbe)”與術(shù)語微生物可以互換使用。“細(xì)菌”或“真細(xì)菌”，指原核生物的一個(gè)域。細(xì)菌包括如下的至少11個(gè)不同 的類群(1)革蘭氏-陽性(gram+)細(xì)菌，其中有兩個(gè)主要的亞類⑴高G+C組(放 線菌(Actinomycetes)、分枝桿菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)、其它) (2)低 G+C 組(芽孢桿菌(Bacillus)、梭菌(Clostridia)、乳桿菌(Lactobacillus)、 U 胃 求胃(Staphylococci)、f連 求胃(Streptococci)、^帛 # (Mycoplasmas)) ； (2) ^ 形菌(Proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革蘭氏-陰性細(xì)菌(包括大多數(shù)“普 通”革蘭氏-陰性細(xì)菌)；(3)藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)，例如氧光能利用菌；(4)螺旋體 (Spirochetes)和相關(guān)物種；(5)浮游菌(Planctomyces) ； (6)擬桿菌(Bacteroides)、黃桿 菌(Flavobacteria) ； (7)衣原體(Chlamydia) ； (8)綠色硫細(xì)菌；(9)綠色非硫細(xì)菌(又稱 厭氧光能利用菌)；(10)抗輻射微球菌和相關(guān)菌；(11)熱袍菌(Thermotoga)和嗜熱棲熱腔 菌(Thermosipho thermophiles)?！案锾m氏-陰性細(xì)菌”包括球菌、非腸桿菌(nonenteric rods)和腸桿菌(enteric rods)。革蘭氏-陰性細(xì)菌的屬包括，例如，奈瑟氏菌屬(Neisseria)、螺菌屬(Spirillum)、 巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、布魯氏菌屬(Brucella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弗朗西 絲菌屬(Francisella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、博德特氏菌屬(Bordetella)、埃希氏 菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、弧菌屬(Vibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、擬桿 菌屬(Bacteroides)、乙酸桿菌屬(Acetobacter)、產(chǎn)氣桿菌屬(Aerobacter)、土壤桿菌屬 (Agrobacterium)、固氮菌屬(Azotobacter)、螺菌屬(Spirilla)、沙雷氏菌屬(Serratia)、弧菌屬、根瘤菌屬(Rhizobium)、衣原體屬(Chlamydia)、立克次體屬(Rickettsia)、密螺旋 體屬(Treponema)禾口梭形桿菌屬(Fusobacterium)。“革蘭氏陽性細(xì)菌”包括球菌、不產(chǎn)孢子的桿菌(nonsporulating rods)和產(chǎn) 孢子的桿菌(sporulating rods) 0革蘭氏陽性細(xì)菌的屬包括，例如，放線菌、芽孢桿 菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、丹毒絲菌 屬(Erysipelothrix) > ff lif M (Lactobacillus)、李其Jf 特菌屬(Listeria)、分枝桿菌 屬(Mycobacterium)、粘球菌屬(Myxococcus)、諾卡氏菌屬(Norcardia)、葡萄球菌屬 (Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口鏈霉菌屬(Streptomyces)。術(shù)語“屬”定義為*艮據(jù) Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea(細(xì)菌禾口 古細(xì)菌的分類大綱)(Garrity，G. M.，Lilburn, T. G.，Cole, J. R.，Harrison, S. H.，Euzeby， J. , and Tindall, BJ. (2007)The Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea. TOBA Release 7. 7, March 2007. Michigan State University Board of Trustees, [http:// www. taxonomicoutline. org/])定義為相關(guān)禾中的分類群。術(shù)語“種”定義為密切相關(guān)的生物體的集合，其具有大于97%的16S核糖體RNA序 列同源性和大于70%的基因組雜交，并且與所有其它生物體有充分的區(qū)別從而被認(rèn)為是不 同的單位。術(shù)語“重組微生物”與“重組宿主細(xì)胞”在此處可互換使用并指如下的微生物，所 述微生物經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)或過表達(dá)內(nèi)源多核苷酸，或表達(dá)異源性多核苷酸(例如包含在 載體中的那些)，或在內(nèi)源基因的表達(dá)上有變化。“變化”的意思是基因的表達(dá)、或RNA分子 水平或編碼一種或多種多肽或多肽亞基的等效RNA分子水平、或一種或多種多肽或多肽亞 基的活性被上調(diào)或下調(diào)，使得表達(dá)、水平或活性大于或小于在沒有該變化時(shí)所觀察到的。例 如，術(shù)語“改變”可以表示“抑制”，但是詞語“改變”的意思并不限于這個(gè)定義。關(guān)于基因序列的術(shù)語“表達(dá)”指該基因的轉(zhuǎn)錄，以及在適當(dāng)時(shí)，將所得的mRNA轉(zhuǎn)錄 物翻譯成蛋白質(zhì)。這樣，從上下文中可明確，蛋白質(zhì)的表達(dá)是由開放讀碼框序列的轉(zhuǎn)錄和翻 譯產(chǎn)生的。宿主細(xì)胞中期望產(chǎn)物的表達(dá)水平可基于細(xì)胞中存在的相應(yīng)mRNA的量或由所選 序列編碼的期望產(chǎn)物的量來決定。例如，從所選序列轉(zhuǎn)錄的mRNA可以由PCR或Northern
( 0M Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))。由所選序列編碼的蛋白質(zhì)可以通過多種方法 定量，例如，通過ELISA，通過測定蛋白質(zhì)生物活性的含量，或通過采用不依賴這種活性的測 定法，如蛋白質(zhì)印跡或放射免疫測定，其使用識(shí)別蛋白質(zhì)并與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)的抗體。參見 Sambrook et al，1989，見上文。所述多核苷酸通常編碼與產(chǎn)生期望代謝產(chǎn)物的代謝途徑有 關(guān)的目標(biāo)酶。術(shù)語“重組微生物”和“重組體宿主細(xì)胞”應(yīng)理解為不僅僅指具體的重組微生 物，還指這種微生物的子代或潛在子代。由于某些修飾可能因?yàn)橥蛔兓颦h(huán)境影響而在在后 代中產(chǎn)生，所以事實(shí)上這些子代可能與親本細(xì)胞不同，但是其仍然包含在此處所用的術(shù)語 的范圍之內(nèi)。術(shù)語“野生型微生物”描述出現(xiàn)在自然界的細(xì)胞，S卩，未經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。野 生型微生物可以被遺傳修飾以表達(dá)或過表達(dá)第一目標(biāo)酶。這種微生物可以在經(jīng)修飾而表達(dá) 或過表達(dá)第二目標(biāo)酶的微生物的產(chǎn)生中充當(dāng)親本微生物。依次類推，可以修飾經(jīng)修飾以表 達(dá)或過表達(dá)第一和第二目標(biāo)酶的微生物以使其表達(dá)或過表達(dá)第三目標(biāo)酶。
因此，“親本微生物”起到連續(xù)遺傳修飾事件的參照細(xì)胞的作用。每次修飾事件都 可以通過將核酸分子引入?yún)⒄占?xì)胞來完成。這種引入促進(jìn)目標(biāo)酶的表達(dá)或過表達(dá)。應(yīng)該理 解的是術(shù)語“促進(jìn)”包含通過對親本微生物中的例如啟動(dòng)子序列進(jìn)行遺傳修飾而活化編碼 目標(biāo)酶的內(nèi)源多核苷酸。還應(yīng)理解的是術(shù)語“促進(jìn)”包含向親本微生物中引入編碼目標(biāo)酶 的異源多核苷酸。術(shù)語“工程改造”指的是導(dǎo)致微生物中可查的變化的任何操作，其中所述操作包括 但不限于插入對于所述微生物是異源的多核苷酸和/或多肽和突變對于所述微生物是天 然的多核苷酸和/或多肽。術(shù)語“代謝上工程改造的”或“代謝上工程改造”涉及為了產(chǎn)生 期望的代謝產(chǎn)物而進(jìn)行的合理的途徑設(shè)計(jì)以及組裝生物合成基因、與操縱子相關(guān)的基因及 這些多核苷酸的控制元件?！按x上工程改造的”還可包括通過調(diào)節(jié)優(yōu)化代謝通量和使用遺 傳工程和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件優(yōu)化轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)功能，包括將與通向期望 途徑的中間物競爭的競爭性代謝途徑減少、破壞或敲除。術(shù)語“代謝上工程改造的微生物”和“修飾的微生物”在說明書中可以互換使用并 且不僅僅指特定的題述細(xì)胞，還涉及這種細(xì)胞的子代及潛在子代。因?yàn)榭赡芤蛲蛔兓蛘攮h(huán) 境影響而在后代中發(fā)生修飾，所以事實(shí)上這種子代可能與親本細(xì)胞不同，但是仍然包含在 此處所使用的術(shù)語范圍內(nèi)。此處所用的術(shù)語“突變”表明任何導(dǎo)致改變的核酸或多肽的對核酸和/或多肽的 修飾。突變包括，例如，多核苷酸中的點(diǎn)突變、缺失或單個(gè)或多個(gè)殘基的插入，其包括出現(xiàn)在 基因的蛋白編碼區(qū)內(nèi)的改變以及在蛋白編碼序列以外區(qū)域(例如，但不限于，調(diào)控或啟動(dòng) 子序列)中的改變。遺傳改變可以是任何形式的突變。例如，突變可以構(gòu)成點(diǎn)突變、移碼突 變、插入或部分或全部基因的缺失。此外，在一些修飾的微生物的實(shí)施方式中，微生物基因 組的一部分已經(jīng)被異源多核苷酸取代。在一些實(shí)施方式中，突變是天然存在的。在其他實(shí) 施方式中，突變是人工選擇壓力的結(jié)果。在其他實(shí)施方式中，微生物基因組中的突變是遺傳 工程改造的結(jié)果。術(shù)語“生物合成途徑”，也稱為“代謝途徑”，指的是為了將一種化學(xué)物質(zhì)(chemical specie)轉(zhuǎn)化為另一種化學(xué)物質(zhì)的一組合成代謝的或分解代謝的生化反應(yīng)。如果基因產(chǎn)物 平行或連續(xù)地作用于相同的底物，產(chǎn)生相同的產(chǎn)物，或作用于或產(chǎn)生在相同底物和代謝終 產(chǎn)物(即代謝產(chǎn)物)之間的代謝中間產(chǎn)物，那么他們屬于相同“代謝途徑”。此處使用的關(guān)于分子，且特別是酶和多核苷酸的術(shù)語“異源”表示分子在生物體中 表達(dá)，該生物體不同于分子所起源的生物體或在自然界中存在該分子的生物體，而與表達(dá) 水平無關(guān)，表達(dá)水平可能低于、等于或高于該分子在天然微生物中的表達(dá)水平。另一方面，此處使用的關(guān)于分子，且特別是酶和多核苷酸的術(shù)語“天然”或“內(nèi)源” 表示該分子在生物體中表達(dá)，該生物體是所述分子所起源的生物體或在自然界中存在該分 子的生物體，而與表達(dá)水平無關(guān)，表達(dá)水平可能低于、等于或高于該分子在天然微生物中的 表達(dá)水平。應(yīng)理解的是在重組微生物中可以修飾天然酶或多核苷酸的表達(dá)。術(shù)語“原料”定義為提供給微生物或能夠產(chǎn)生其他產(chǎn)物的發(fā)酵過程的原材料或原 材料的混合物。例如，碳源，如生物質(zhì)或由生物質(zhì)衍生的含碳化合物是供在發(fā)酵過程中產(chǎn)生 生物燃料的微生物用的原料。然而，原料可以包括碳源之外的營養(yǎng)物。術(shù)語“底物”或“合適的底物”指的是通過酶的作用轉(zhuǎn)化或要轉(zhuǎn)化為另一種化合物
16的任何物質(zhì)或化合物。該術(shù)語不僅僅包括單一的化合物，還包括化合物的組合，如包含至少 一種底物或其衍生物的溶液、混合物以及其他材料。此外，術(shù)語“底物”不僅包括提供適宜 作為起始材料使用的碳源的化合物，如任何生物質(zhì)衍生的糖，還包括如此處描述的在與代 謝工程改造的微生物有關(guān)的途徑中使用的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物代謝產(chǎn)物。術(shù)語“發(fā)酵”或“發(fā)酵過程”定義為這樣的過程，其中在包含原材料(如原料和營 養(yǎng)物)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中所述微生物將原材料(如原料)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。術(shù)語“細(xì)胞干重”或“CDW”指的是用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法將包含在微生 物內(nèi)的水去除以后微生物的重量。CDW以克表示。術(shù)語“生物燃料”指的是這樣的燃料，其中包含在該燃料中的所有的碳都衍生自生 物質(zhì)并通過微生物以生物化學(xué)方法轉(zhuǎn)化(至少部分轉(zhuǎn)化)為燃料。生物燃料進(jìn)一步定義為 一種包含小于0. 5個(gè)氧原子/碳原子的非_乙醇化合物。生物燃料本身就是燃料，但可以 與石油-衍生的燃料混合以產(chǎn)生燃料。生物燃料可用作石油化工-衍生的汽油、柴油或噴 氣燃料的替代品。術(shù)語“容積生產(chǎn)率”或“生產(chǎn)率”定義為單位時(shí)間每體積培養(yǎng)基形成的產(chǎn)物的量。 容積生產(chǎn)率是以克每升每小時(shí)(g/L/h)表示的。術(shù)語“產(chǎn)率”定義為每單位重量的原材料獲得的產(chǎn)物的量且可以表示為克產(chǎn)物每 克底物(g/g)。產(chǎn)率可以表示為理論產(chǎn)率的百分比?！袄碚摦a(chǎn)率”定義為由給定量底物能夠 產(chǎn)生的產(chǎn)物的最大量，如用于產(chǎn)生產(chǎn)物的代謝途徑的化學(xué)計(jì)量學(xué)所規(guī)定的。例如，葡萄糖成 為異丁醇的一種典型的轉(zhuǎn)化的理論產(chǎn)率是0. 41g/g。照這樣，0. 39g/g的由葡萄糖到異丁醇 的產(chǎn)率可以表示為理論值的95%或95%理論產(chǎn)率。術(shù)語“滴度(titer)”定義為溶液的濃度或溶液中物質(zhì)的濃度。例如，發(fā)酵液中生 物燃料的滴度描述為每升發(fā)酵液中的溶液中生物燃料的克數(shù)(g/L)?！凹嫘詤捬跎铩被颉凹嫘詤捬跷⑸铩倍x為在存在或不存在氧的條件下能夠生 長的生物?！皣?yán)格厭氧生物”或“嚴(yán)格厭氧微生物”定義為在存在氧時(shí)不能生長并且暴露于任 何氧濃度均不能存活的生物?！皡捬跎铩被颉皡捬跷⑸铩倍x為不能在氧的存在下生長的生物?！坝醒鯒l件”定義為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氧濃度對于需氧或兼性厭氧微生物而言足以 用作末端電子受體的條件。相反，“厭氧條件”定義為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氧濃度對于微生物而言太低而不能用作 末端電子受體的條件。厭氧條件可以通過將惰性氣體(如氮)充入發(fā)酵培養(yǎng)基直到作為氧 不再能夠用作微生物的末端電子受體來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，厭氧條件可以通過微生物消耗發(fā)酵中 的可用氧直至氧不能用作微生物的末端電子受體來實(shí)現(xiàn)?！坝醒醮x”指的是如下生化過程，其中氧被用作末端電子受體以由碳水化合物產(chǎn) 生能量，通常以ATP的形式。例如通過糖酵解和TCA循環(huán)發(fā)生有氧代謝，其中在氧的存在下， 將單個(gè)葡萄糖分子完全代謝為二氧化碳。相反，“無氧代謝”指的是其中氧不為包含在NADH中的電子最終受體的生化過程。 無氧代謝可以分為無氧呼吸，其中不同于氧的化合物被用作末端電子受體；和底物水平 磷酸化，其中利用來自NADH的電子以通過發(fā)酵性途徑產(chǎn)生還原產(chǎn)物。
在“發(fā)酵性途徑”中，NAD⑵H將其電子貢獻(xiàn)給通過產(chǎn)生NAD⑵H上攜帶的電子的 同一代謝途徑所產(chǎn)生的分子。例如，在某些酵母菌株的發(fā)酵性途徑之一中，通過糖酵解產(chǎn)生 的NAD (P) H將其電子傳遞給丙酮酸，產(chǎn)生乙醇。發(fā)酵性途徑通常在厭氧條件下有活性，但是 也可以發(fā)生在有氧條件下，在NADH沒有經(jīng)由呼吸鏈完全氧化的條件下。例如，高于某寫葡 萄糖濃度時(shí)，Crabtree陽性酵母在有氧條件下產(chǎn)生大量乙醇。術(shù)語“副產(chǎn)品”指的是與生物燃料或生物燃料前體的產(chǎn)生相關(guān)的不需要的產(chǎn)品。副 產(chǎn)品通常當(dāng)做廢品丟棄，增加了生產(chǎn)過程的成本。術(shù)語“非發(fā)酵酵母”是一種酵母，其不能展示出其中利用來自NADH的電子經(jīng) 由發(fā)酵性途徑產(chǎn)生還原產(chǎn)物的無氧代謝，例如由葡萄糖產(chǎn)生乙醇和C02。非發(fā)酵酵母 可以通過“德拉姆試管檢測，，(J. A. Barnett，R. W Payne, and D. Yarrow. 2000. Yeasts Characteristics and Identification. 3rd edition, p. 28-29. Cambridge University Press, Cambridge, UK.)或通過監(jiān)測發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇和CO2)的產(chǎn)生來確認(rèn)。此處所用的術(shù)語“多核苷酸”可以和術(shù)語“核酸”互換使用，并且指的是由兩種或多 種包括核苷酸、核苷或其類似物的單體組成的有機(jī)聚合物，包括但不限于任意長度的單鏈 或雙鏈、有義或反義脫氧核糖核酸(DNA)，以及在適當(dāng)時(shí)，任意長度的單鏈或雙鏈、有義或反 義核糖核酸(RNA)，包括siRNA。術(shù)語“核苷酸”指的是由結(jié)合到嘌呤或嘧啶堿并結(jié)合到磷酸 基團(tuán)的核糖或脫氧核糖組成幾種化合物中的任一，并且它們是核酸的基本結(jié)構(gòu)單元。術(shù)語 “核苷”指的是由嘌呤或嘧啶堿與脫氧核糖或核糖的組合組成的化合物(如鳥苷或腺苷)， 并且它特別存在于核酸中。術(shù)語“核苷酸類似物”或“核苷類似物”分別指的是這樣的核苷 酸或核苷，其中一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的原子被不同原子或不同的官能團(tuán)替換。因此，術(shù)語多核苷 酸包括任意長度的核酸、DNA、RNA、其類似物和片段。三個(gè)或更多個(gè)核苷酸的多核苷酸也稱 為核苷酸寡聚物或寡核苷酸?？梢岳斫獾氖谴颂幟枋龅亩嗪塑账岚ā盎颉保⑶掖颂幟枋龅暮怂岱肿影?“載體”或“質(zhì)?！?。因此，術(shù)語“基因”，也稱為“結(jié)構(gòu)基因”，指的是編碼特定氨基酸序列的 多核苷酸，其包含一種或多種蛋白質(zhì)或酶的全部或部分，并且可以包括調(diào)節(jié)性(不轉(zhuǎn)錄的) DNA序列，如啟動(dòng)子序列，其確定例如在何種條件下表達(dá)基因?；虻霓D(zhuǎn)錄區(qū)可以包括非翻 譯區(qū)(包括內(nèi)含子、5'-非翻譯區(qū)(UTR)和3' -UTR)，以及編碼序列。術(shù)語“操縱子”指的是由共同啟動(dòng)子作為單一轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄的兩種或更多種基因。 在一些實(shí)施方式中，構(gòu)成操縱子的基因是相鄰的基因?？梢岳斫獾氖强梢酝ㄟ^修飾該共同 啟動(dòng)子而修飾整個(gè)操縱子的轉(zhuǎn)錄(即，增加、減少或消除)。或者，可以修飾操縱子中的任何 基因或基因的組合以改變所編碼的多肽的功能或活性。修飾能夠?qū)е戮幋a多肽的活性的提 高。進(jìn)一步地，修飾可以賦予編碼的多肽新的活性。示例性新活性包括可選底物的應(yīng)用和 /或在可選環(huán)境條件中起作用的能力?！拜d體”是任何如下的手段，即可以通過該手段使核酸在生物體、細(xì)胞或細(xì)胞成分 之間增殖(propagate)和/或轉(zhuǎn)移。載體包括病毒、噬菌體、原病毒、質(zhì)粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子 和人工染色體如YAC (酵母人工染色體)，BAC (細(xì)菌人工染色體)和PLAC (植物人工染色 體)等，這些是“附加體(印isome)”，也就是說，其自主地復(fù)制或者可以整合入宿主細(xì)胞的 染色體內(nèi)。載體也可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一鏈內(nèi)由DNA和RNA 二者 組成的多核苷酸、多聚賴氨酸結(jié)合的DNA或RNA、多肽結(jié)合的DNA或RNA、脂質(zhì)體結(jié)合的DNA等，它們本質(zhì)上不是附加體，或者載體可以是包含一種或多種上述多核苷酸構(gòu)建體的生物 體，如土壤桿菌或細(xì)菌?！稗D(zhuǎn)化”指的是將載體引入宿主細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)導(dǎo)，或轉(zhuǎn)染)可以通過包 括化學(xué)轉(zhuǎn)化(例如乙酸鋰轉(zhuǎn)化)、電穿孔、顯微注射、基因槍(或粒子轟擊介導(dǎo)的傳遞)或土 壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在內(nèi)的許多方法中的任意一種來完成。此處使用的術(shù)語“酶”指的是催化或促進(jìn)一種或多種化學(xué)或生化反應(yīng)的任何物質(zhì)， 其通常包括全部或部分由多肽組成的酶，但是可以包括由不同分子(包括多核苷酸)組成 的酶。此處使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)/蛋白”或“多肽”表示由兩種或更多種氨基酸單體 (amino acidic monomer)和/或其類似物組成的有機(jī)聚合物。此處所使用的術(shù)語“氨基酸” 或“氨基酸單體”指的是包括甘氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體在內(nèi)的任何天然和/或合成的氨 基酸。術(shù)語“氨基酸類似物”指的是一個(gè)和多個(gè)單獨(dú)的原子被不同的原子或不同的官能團(tuán) 替換的氨基酸。因此，術(shù)語多肽包括任意長度的氨基酸聚合物，其包括全長蛋白質(zhì)，和肽以 及其類似物和片段。三個(gè)或更多個(gè)氨基酸的多肽也稱為蛋白寡聚物或寡肽。關(guān)于第一家族(family)或種的原始酶或基因的術(shù)語“同源物(homolog) ”指的第 二家族或種的不同的酶或基因，其是通過功能、結(jié)構(gòu)或基因組分析來確定的對應(yīng)于第一家 族或種的原始酶或基因的第二家族或種的酶或基因。最通常的情況，同源物會(huì)具有功能、結(jié) 構(gòu)或基因組相似性。使用基因探針和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物的技術(shù)是已知 的?？寺〉男蛄凶鳛橥次锏纳矸?identity)可以使用功能測定法和/或通過對基因的 基因組作圖來確認(rèn)。如果編碼蛋白質(zhì)的核酸序列與編碼第二蛋白質(zhì)的核酸序列具有相似的序列，則該 蛋白質(zhì)與第二蛋白質(zhì)具有“同源性”或與第二蛋白質(zhì)是“同源的”。或者，如果蛋白質(zhì)與第二 蛋白質(zhì)具有“相似的”氨基酸序列，則兩種蛋白質(zhì)具有同源性。(這樣，為術(shù)語“同源蛋白” 定義的含義為兩種蛋白質(zhì)具有相似的氨基酸序列)。術(shù)語“類似物”或“類似的”指的是僅在功能上彼此相關(guān)但不來自共同的譜系 (descetn)或不共有共同祖先序列的核酸或蛋白序列或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由于趨同進(jìn)化，類似物 在序列上可能不同但是可以共有相似的結(jié)構(gòu)。例如，如果兩種酶催化相同的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn) 物的反應(yīng)、兩種酶在序列上是無關(guān)的、且不論兩種酶在結(jié)構(gòu)上是否相關(guān)，那么這兩種酶是類 似物或者是類似的。一般的微生物1-丁醇的天然生產(chǎn)者，如丙酮丁醇梭菌是已知的，但是這些生物體在發(fā)酵過程中 也產(chǎn)生副產(chǎn)品如丙酮、乙醇和丁酸鹽。此外，這些微生物相對難以操作，可使用的手段比更 常用的生產(chǎn)宿主(例如釀酒酵母或大腸桿菌)少得多。另外，對這些天然生產(chǎn)者的生理學(xué) 和代謝調(diào)節(jié)知之甚少，妨礙了向高效率生產(chǎn)的快速進(jìn)展。此外，尚未鑒定出能夠以工業(yè)相關(guān) 量將葡萄糖代謝成為異丁醇的天然微生物。通過多種酵母菌種(包括釀酒酵母)產(chǎn)生異丁醇和其它燃料醇對于酒精飲料的蒸 餾者有特別的價(jià)值，對于他們來說燃料醇通常形成不需要的怪味(off-notes)。已經(jīng)證明了 在多種生長培養(yǎng)基中在野生型酵母中產(chǎn)生異丁醇，所述培養(yǎng)基從葡萄酒制備過程中的葡萄 酉翏(grape must)(Romano, et al. ， Metabolic diversity of Saccharomyces cerevisiae
19strains from spontaneously fermented grape musts,World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 :311_315，2003)，其中產(chǎn)生了 12_219mg/L 異丁醇，到補(bǔ)充的基本 士音養(yǎng)基(Oliviera, et al. (2005)World Journal of Microbiology and Biotechnology 21 :1569-1576)，其產(chǎn)生了 16_34mg/L 異丁醇。Dickinson 等人(J Biol Chem. 272 (43) 26871-8,1997)的研究已經(jīng)鑒定出在將支鏈氨基酸(例如，纈氨酸或亮氨酸)轉(zhuǎn)化為異丁醇 的內(nèi)源釀酒酵母途徑中使用了酶步驟。此處提供的重組微生物可以表達(dá)多種異源和/或天然目標(biāo)酶，該目標(biāo)酶與從合適 的碳源產(chǎn)生異丁醇的途徑有關(guān)。因此，代謝上“工程改造的”或“修飾的”微生物是經(jīng)由將遺傳物質(zhì)引入所選的宿 主或親本微生物中和/或通過修飾天然基因的表達(dá)，由此修飾或改變該微生物的細(xì)胞生理 學(xué)和生物化學(xué)而產(chǎn)生的。通過遺傳物質(zhì)的引入和/或?qū)?nèi)源基因表達(dá)的修飾，親本微生物 獲得新的性質(zhì)，例如產(chǎn)生新的或更大量的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的能力。如在此處所描述，親本微生 物中遺傳物質(zhì)的引入和/或?qū)?nèi)源基因表達(dá)的修飾導(dǎo)致新的或改良的產(chǎn)生異丁醇的能力。 在親本微生物中引入的遺傳物質(zhì)和/或表達(dá)得到修飾的基因含有基因、或部分基因，其編 碼與產(chǎn)生異丁醇的生物合成途徑相關(guān)的一種或多種酶，并且也可以包括用于表達(dá)這些基因 和/或調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)的別的元件，例如啟動(dòng)子序列。除了將遺傳物質(zhì)引入宿主或親本微生物之外，經(jīng)工程改造的或修飾的微生物還可 包括基因或多核苷酸的改變、破壞、缺失或敲除以改變該微生物的細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)。 通過基因或多核苷酸的改變、破壞、缺失或敲除，微生物獲得新的或改進(jìn)的性質(zhì)(如產(chǎn)生新 的代謝產(chǎn)物或更大量胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的能力，改進(jìn)代謝產(chǎn)物沿著所需途徑的流量和/或降低 副產(chǎn)物的產(chǎn)量)。此處提供的重組微生物還可以以在親本微生物中無法獲得的量產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。 “代謝產(chǎn)物”指的是通過代謝產(chǎn)生的任何物質(zhì)或特定代謝過程中所必需的物質(zhì)或參與特定 代謝過程的物質(zhì)。代謝產(chǎn)物可以是一種作為代謝的起始材料(如葡萄糖或丙酮酸)，中間產(chǎn) 物(如2-酮異戊酸)或終產(chǎn)物(如異丁醇)的有機(jī)化合物。代謝產(chǎn)物可以用于構(gòu)成更復(fù) 雜的分子，或其可以分解成簡單的分子。中間代謝產(chǎn)物可以由其他代謝產(chǎn)物合成，可能用于 制備更復(fù)雜的物質(zhì)，或分解成更簡單的化合物，常常伴有化學(xué)能量的釋放。示例性的代謝產(chǎn)物包括葡萄糖、丙酮酸和異丁醇。所述代謝產(chǎn)物異丁醇可以通過 代謝上經(jīng)工程改造以表達(dá)或過表達(dá)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的代謝途徑的重組微生物來產(chǎn) 生。將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的示例性代謝途徑可以由乙酰羥酸合酶(ALS)、酮醇酸還原異構(gòu) 酶(KARI)、二羥酸脫水酶(DHAD)、2-酮酸脫羧酶(KIVD)、醇脫氫酶(ADH)組成。因此，此處提供了產(chǎn)生異丁醇的重組微生物，且在一些方面所述重組微生物可以 包括目標(biāo)酶(如ALS、KARl、DHAD、KIVD和ADH)的高表達(dá)。本公開鑒定了在所述方法中有用的特定基因、本公開的組合物和生物體；然而會(huì) 被公認(rèn)的是與這些基因完全一致是沒有必要的。例如，在包含編碼多肽或酶的序列的特定 基因或多核苷酸中可以進(jìn)行改變，并篩選活性。通常這些改變包含保守突變和沉默突變?？?以使用本領(lǐng)域已知的方法篩選這些經(jīng)修飾或突變的多核苷酸和多肽的功能性酶的表達(dá)。由于遺傳密碼固有的簡并性，編碼基本上相同或功能上等同的多肽的其它多核苷 酸也可以用于克隆和表達(dá)編碼這些酶的多核苷酸。
正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，修飾編碼序列以提高其在特定宿主中的表達(dá)是有 利的。遺傳密碼具有64種可能密碼子，是冗余的，但是大多數(shù)生物體通常使用這些密碼子 的一個(gè)亞組。在某個(gè)種中最常被利用的密碼子稱為最佳密碼子，而那些不常使用的密碼子 被歸為罕見或利用率低的密碼子。密碼子可以被置換以反映宿主的優(yōu)選密碼子選擇，即有 時(shí)被稱為“密碼子優(yōu)化”或“控制種密碼子偏好”的過程。例如，可以制備含有特定原核或真核宿主所優(yōu)選的密碼子的優(yōu)化編碼序列(參 見，Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17 :477_508)，從而與產(chǎn)自非優(yōu)化序列的轉(zhuǎn)錄物 相比增加翻譯例或產(chǎn)生具有期望性質(zhì)(如更長的半衰期)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。也可以修飾 翻譯終止密碼子以反映宿主偏好。例如，釀酒酵母和哺乳動(dòng)物的典型終止密碼子分別是UAA 和UGA0單子葉植物的典型終止密碼子是UGA，而昆蟲和大腸桿菌通常使用UAA作為終止密 碼子(Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24 :216_218)。例如，美國專利號第 6015891 以及其中引用的參考文獻(xiàn)中提供了為在植物中表達(dá)而優(yōu)化核苷酸序列的方法。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，由于遺傳密碼的簡并性，多種核苷酸序列不 同的DNA化合物可以用于編碼本公開給定的酶。此處涉及的上述編碼生物合成酶的天然 DNA序列僅用于說明本公開的實(shí)施方式，而本公開包括具有編碼本公開方法中利用的酶的 蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。類似地，多肽通?？梢匀菰S其氨基 酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和插入而不損失或不顯著損失所需的活性。本 公開包括這些具有不同于此處描述的特定蛋白的氨基酸序列的多肽，只要所述修飾的或變 體多肽具有參照多肽的酶促合成代謝或分解代謝活性即可。此外，在此顯示的由DNA序列 編碼的氨基酸序列僅例示了本公開的實(shí)施方式。此外，對產(chǎn)生代謝產(chǎn)物有用的酶的同源物涵蓋在此處提供的微生物和方法中。如此處所使用的，當(dāng)氨基酸序列具有至少約30%、40%、50%、60%、65%、70%、 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99% 同一性時(shí)，兩 種蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)中的區(qū)域)基本上是同源的。為了測定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序 列的百分比同一性，比對序列以便進(jìn)行最佳的比較(例如，為了最佳的排列，可將缺口引入 第一和/或第二氨基酸或核酸序列中，且為了比較的目的非同源序列可以忽略)。在一個(gè)實(shí) 施方式中，為了比較目的而比對的參照序列的長度是參照序列長度的至少30%、通常為至 少40 %、更通常為至少50 %、甚至最通常為至少60 %，還甚至通常為至少70 %、80 %、90 %、 100%。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)在第一序列 中的位置由與第二序列中相應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，那么在那個(gè)位置 上所述分子是相同的(如在此所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源 性”)。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，其考慮缺口數(shù)和每 個(gè)缺口的長度，為了兩個(gè)序列的最佳比對需要弓I入缺口。當(dāng)對蛋白質(zhì)或肽使用“同源的”時(shí)，認(rèn)為不同的殘基位置是因保守氨基酸取代而不 同。“保守氨基酸取代”是這樣的取代，即其中氨基酸殘基由具有化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水 性)相似的側(cè)鏈(R基團(tuán))的另一氨基酸殘基所取代。一般而言，保守的氨基酸取代不會(huì)從 本質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能特性。在兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列因保守取代而相互有區(qū)別的情 況下，百分比序列同一性或同源性程度可以向上調(diào)整以校正取代的保守性。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員熟知實(shí)施這種調(diào)整的手段(參見，例如，Pearson W. R. Using the FASTA program tosearch protein and DNA sequence databases, Methods in Molecular Biology,1994, 25 :365-89，在此處通過提述并入)。下述六個(gè)組分別包含互為保守取代的氨基酸1)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T) ；2)天冬 氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K) ；5)異亮氨 酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、 色氨酸(W)。也稱作百分比序列同一性的多肽的序列同源性通常使用序列分析軟件來測量。 參見，例如 the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center,910University Avenue, Madison, Wis. 53705。蛋白質(zhì)分析軟件用指定給各種取代、缺失和其它修飾(包括保守氨基 酸取代)的同源性量度來匹配相似序列。比如，GCG包含可按默認(rèn)參數(shù)使用的程序如“Gap” 和“Bestfit”，以確定密切相關(guān)的多肽(如來自不同種生物體的同源多肽)之間或野生型蛋 白與其突變體蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參加，例如GCG Version 6.1。用于將分子序列與包含大量來自不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的 一種典型算法是計(jì)算機(jī)程序 BLAST(Altschul，S. F.，et al. (1990) “ Basic local alignment search tool. " J. MoI.Bioi.215 403-410 ；Gish, W. and States, DJ. (1993) " Identification of protein coding regions by database similarity search. " Nature Genet. 3:266_272 ；Madden, T.L. , et al. (1996) " Applications of network BLAST server “ Meth.Enzymol. 266 131-141 ；Altschul, S. F. , et al. (1997)" Gapped BLAST and PSI-BLAST :a new generation of protein database search programs. " Nucleic Acids Res.25 :3389_3402 ；Zhang, J. and Madden, T. L. (1997) " PowerBLAST :A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. " Genome Res. 7 :649_656),特別是 blastp 或 tblastn(Altschul，S.F.，et al. (1997) “ Gapped BLAST and PS1-BLAST :a new generation of protein database search programs. " Nucleic Acids Res. 25 3389-3402)。BLASTp 的典型參數(shù)是期望值(Expectation value) :10(缺省)；過濾器: seg(缺省)；產(chǎn)生一個(gè)缺口的罰分11(缺省)；延長一個(gè)缺口的罰分1(缺省)；最大比 對100(缺省)；字長11(缺省)；說明數(shù)(No. of descriptions) :100(缺省)；罰分矩陣 (Penalty Matrix) :BL0WSUM62。當(dāng)搜索包含來自大量不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫時(shí)，通常比較氨基酸序列。使用 氨基酸序列的數(shù)據(jù)搜索可以通過本領(lǐng)域已知的不同于blastp的算法來測量。例如，多肽 序列可以用GCG Version 6. 1中的程序FASTA來比較。FASTA提供對查詢序列和搜索序 列之間的重疊最佳的區(qū)域的比對及百分比序列同一性(Pearson，W. R. (1990) “ Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA" Meth. Enzymol. 183 :63_98)。 例如，氨基酸序列之間的百分比序列同一性可以使用如GCG Version 6.1中提供的FASTA 用其缺省參數(shù)(2的字長和PAM250的計(jì)分矩陣)來測定，在此通過提述并入。本公開提供了包含由合適底物以高產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇的生物化學(xué)途徑的代謝上經(jīng) 工程改造的微生物。本公開的代謝上經(jīng)工程改造的微生物包含在該生物體基因組之內(nèi)或在 該生物體內(nèi)基因組的外部的一個(gè)或多個(gè)重組多核苷酸。所述微生物可包含野生型生物體中存在的基因的減少、破壞或敲除和/或異源多核苷酸的引入和/或內(nèi)源多核苷酸的表達(dá)或 過表達(dá)。在一方面，本公開提供一種重組微生物，其包含與親本微生物相比表達(dá)提高的至 少一種目標(biāo)酶或者編碼親本生物體中不存在的酶。在另一或進(jìn)一步的方面，所述微生物包 含對至少一種基因的減少、破壞或敲除，該基因編碼與產(chǎn)生異丁醇所必需的代謝產(chǎn)物競爭 的酶。所述重組微生物產(chǎn)生至少一種與產(chǎn)生異丁醇的生物合成途徑有關(guān)的代謝產(chǎn)物。一般 而言，所述重組微生物包括至少一種重組代謝途徑，該途徑包含目標(biāo)酶并可以進(jìn)一步包括 在競爭性生物合成途徑中的酶的活性或表達(dá)的降低。該途徑在異丁醇的產(chǎn)生中起到修飾底 物或代謝中間產(chǎn)物的作用。目標(biāo)酶由源自合適生物源的多核苷酸編碼并表達(dá)。在一些實(shí)施 方式中，所述多核苷酸包含源自原核或真核來源并通過重組工程改造進(jìn)入本公開的微生物 的基因。在另一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包括對于宿主生物體是天然的基因?？梢岳斫獾氖强梢孕薷奈⑸锏姆秶园ㄟm合產(chǎn)生異丁醇的重組代謝途徑。在 多種實(shí)施方式中，微生物可以選自酵母微生物。用于產(chǎn)生異丁醇的酵母微生物可以基于如 下某些特征來選擇一種特征可以包括這樣的性質(zhì)，即微生物經(jīng)選擇以將各種碳源轉(zhuǎn)化為異丁醇。因 此，在一個(gè)實(shí)施方式中，此處公開的重組微生物可以將多種碳源轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，這些碳源包括 但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖及其混合物。另一種特征可以包括這樣的性質(zhì)，即野生型或親本微生物是非發(fā)酵性的。換句話 說，其不能在缺氧情況下代謝碳源，而酵母能夠在氧存在的情況下代謝碳源。非發(fā)酵酵母指 天然存在的酵母和經(jīng)遺傳修飾的酵母二者。在用發(fā)酵性酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵期間，氧化來自 糖酵解的NADH的主要途徑是通過產(chǎn)生乙醇。乙醇是通過醇脫氫酶(ADH)經(jīng)由乙醛的還原 產(chǎn)生的，乙醛是通過丙酮酸脫羧酶(PDC)自丙酮酸產(chǎn)生的。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，可以 通過減少或消除天然PDC活性來將發(fā)酵性酵母工程改造成非_發(fā)酵性的。因此，由糖酵解 產(chǎn)生的大多數(shù)丙酮酸沒有被PDC消耗，并可用于異丁醇途徑。這種途徑的缺失增加了異丁 醇途徑可用的丙酮酸和還原當(dāng)量。發(fā)酵性途徑促成異丁醇的低產(chǎn)量和低生產(chǎn)率。因此，PDC 的缺失可以增加異丁醇的產(chǎn)量和生產(chǎn)率。第三個(gè)特征可以包括這樣的性質(zhì)，即選擇生物催化劑以將不同的碳源轉(zhuǎn)化為異丁在一個(gè)實(shí)施方式中，酵母微生物可以選自“酵母屬酵母進(jìn)化枝(Saccharomyces Yeast Clade)，，，由 Kurtzman 禾口 Robnett 在 1998 年定義為子囊菌酵母(ascomycetous yeast)分類 學(xué)類另U ( “ Identification and phylogeny of ascomycetous yeast from analysis of nuclear large subunit (26S)ribosomal DNA partial sequences. “ Antonie van Leeuwenhoek 73 :331_371，圖 2)。他們通過比較編碼核糖體大 亞基26S的基因5'末端的D1/D2域的核苷酸序列能夠測定約500個(gè)酵母種的相關(guān)性。在 釀酒酵母的D1/D2核苷酸序列和兩種來自這個(gè)酵母屬酵母進(jìn)化枝的距離最遠(yuǎn)的酵母(即乳 酸克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母)的配對比較中共享超過80%的同一性。術(shù)語“酵母屬狹義(Saccharomyces sensu stricto) ”分類群是這樣一組酵母 種，其與釀酒酵母高度相關(guān)(Rainieri，S. et al 2003. Saccharomyces Sensu Stricto Systematics, Genetic Diversity and Evolution. J. Biosci Bioengin 96(1)1—9.Saccharomyces sensu stricto yeast species include but are not limited to S. cerevisiae，S. cerevisiae, S. kudriavzevii, S，mikatae，S，bayanus, S. uvar υ m, S.carocanis and hybrids derived from these species(Masneuf et at. 1998. New Hybrids between Saccharomyces Sensu Stricto Yeast Species Found Among Wine and Cider Production Strains. Yeast 7(1)61-72)。在半子囊酵母(hemiascomycete yeast)的進(jìn)化過程中發(fā)生了古老的(rncient) 全基因組倍增(WGD)事件，并且該事件是使用比較基因組工具發(fā)現(xiàn)的(Keliis et al 2004" Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast S. cerevisiae. " Nature 428 :617_624. Dujon et al 2004" Genome evolution in yeasts. " Nature 430 :35_44. Langkjaer et al 2003" Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes. " Nature428 848-852. Wolfe and Shields 1997" Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome. “ Nature 387 :708_713)。使用這些主要的進(jìn)化事件，酵母 可以分成在WGD事件之后偏離共同祖先的種(此處稱“后-WGD酵母”)和在WGD事件之前 偏離酵母譜系的種(此處稱“前-WGD酵母”)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以選自后-WGD酵母屬，包括但不限 于酵母屬和假絲酵母屬。優(yōu)選的后-WGD酵母種包括釀酒酵母、葡萄汁酵母、貝酵母、奇異 酵母、S. castelli和光滑假絲酵母。在另一實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以選自前-全基因組倍增(pre-WGD)酵母 屬，其包括但不限于酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、伊薩酵母屬、德巴利 酵母屬、漢遜酵母屬、西洋蓍霉屬和裂殖酵母屬。代表性的前-WGD酵母種包括克魯弗酵 母、耐熱克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、K. waltii、乳酸克魯維酵母、熱帶假絲酵母、巴斯 德畢赤酵母、異常畢赤酵母、樹干畢赤酵母、東方伊薩酵母、罕見伊薩酵母、菱形伊薩酵母、 漢遜德巴利酵母、異常漢遜酵母、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。酵母微生物可以是Crabtree-陰性或是Crabtree-陽性的。具有Crabtree-陰性 表型的酵母細(xì)胞是任何不展現(xiàn)Crabtree效應(yīng)的酵母細(xì)胞。術(shù)語“Crabtree-陰性”指天然 存在的或經(jīng)遺傳修飾的生物體二者。簡單的說，Crabtree效應(yīng)定義為在有氧條件下培養(yǎng)時(shí) 微生物由于高濃度葡萄糖的存在(如50g-葡萄糖L—1)而抑制氧的消耗。換句話說，具有 Crabtree-陽性表型的酵母細(xì)胞由于葡萄糖的存在而無論氧的可用性為多少都繼續(xù)發(fā)酵， 而具有Crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞不會(huì)顯示葡萄糖介導(dǎo)的對氧消耗的抑制。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以選自具有Crabtree-陰性表型的 酵母，其包括但不限于如下的屬克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、伊薩酵母屬、漢遜酵母屬和假 絲酵母屬。Crabtree-陰性的種包括但不限于乳酸克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、異常 畢赤酵母、樹干畢赤酵母、東方伊薩酵母、罕見伊薩酵母、菱形伊薩酵母、異常漢遜酵母和產(chǎn) 朊假絲酵母。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以選自具有Crabtree-陽性表型的酵 母，包括但不限于酵母屬、克魯維酵母屬、接合酵母屬、德巴利酵母屬、畢赤酵母屬和裂殖酵 母屬。Crabtree-陽性酵母的種包括但不限于釀酒酵母、葡萄汁酵母、貝酵母、奇異酵母、 S. castelli、克魯弗酵母、耐熱克魯維酵母、光滑假絲酵母、拜耳接合酵母、魯氏接合酵母、漢遜德巴利酵母、巴斯德畢赤酵母和粟酒裂殖酵母。在一個(gè)實(shí)施方式中，工程改造酵母微生物以通過糖酵解將碳源(如葡萄 糖)轉(zhuǎn)化為丙酮酸，并且經(jīng)由經(jīng)工程改造的異丁醇途徑將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇(PCT/ US2006/041602、PCT/US2008/053514)。在國際專利申請?zhí)?PCT/US2006/041602 和 Dickinson et al. ,Journal of Biological Chemistry273 :25751_15756 (1998)中描述了 產(chǎn)生異丁醇的可選途徑。因此，經(jīng)工程改造的將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的異丁醇途徑可以包含如下反應(yīng)1.2丙酮酸一乙酰乳酸+CO22.乙酰乳酸+NADPH—2，3-二羥基異戊酸+NADP+3.2,3- 二羥基異戊酸一α -酮異戊酸4. α -酮異戊酸一異丁醛+CO25.異丁醛+NADPH —異丁醇+NADP+這些反應(yīng)通過如下酶來進(jìn)行1)乙酰乳酸合酶(ALS，EC4. 1. 3. 18)、2)酮酸還原 異構(gòu)酶(KARI，EC 1. 1. 1. 86)、3) 二羥酸脫水酶(DHAD, EC4. 2. 1. 9)、4) α -酮異戊酸脫羧酶 (KIVD, EC4. 1. 1. 1)和 5)醇脫氫酶(ADH, ECl. 1. 1. 1 或 1. 1. 1. 2)。在另一實(shí)施方式中，所述酵母微生物經(jīng)工程改造以過表達(dá)這些酶。例如，這些酶可 以由天然基因編碼。例如，ALS可以由枯草芽孢桿菌的alsS基因、L. Iactis的alsS基因、 或肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)的ilvK基因編碼。例如，KARI可以由大腸桿菌、谷氨酸 棒桿菌(C. glutamicum)、海沼甲烷球菌(M. maripaludis)或瘤胃壺菌E2的ilvC基因編碼。 例如，DHAD可以由大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌的ilvD基因編碼。KIVD可以由L. Iactis的 kivD基因編碼。ADH可以由釀酒酵母的ADH2、ADH6或ADH7編碼?？梢怨こ谈脑毂景l(fā)明的酵母微生物以使其具有提高的將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的 能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以經(jīng)工程改造以提高將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醛 的能力。在另一實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以經(jīng)工程改造以提高將丙酸轉(zhuǎn)化為酮異戊 酸的能力。在另一實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以經(jīng)工程改造以提高將丙酮酸轉(zhuǎn)化為2， 3_ 二羥基異戊酸的能力。在另一實(shí)施方式中，所述酵母微生物可以經(jīng)工程改造以提高將丙 酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸的能力。此外，可以通過基因/蛋白工程技術(shù)優(yōu)化編碼上述酶的任何基因(或此處提及的 任何其他酶的任何基因(或控制或調(diào)整其表達(dá)的任何調(diào)節(jié)元件))，如定向進(jìn)化或合理誘 變，這些技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。這些行為允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員優(yōu)化酶在 酵母中的表達(dá)和活性。此外，編碼這些酶的基因可以從其它真菌和細(xì)菌菌種中鑒定并且可以進(jìn)行表達(dá)以 調(diào)節(jié)這種途徑。多種生物體可以充當(dāng)這些酶的來源，包括但不限于酵母屬菌種，包括釀酒 酵母和葡萄汁酵母；克魯維酵母屬菌種，包括耐熱克魯維酵母、乳酸克魯維酵母和馬克思 克魯維酵母；畢赤酵母屬菌種；漢遜酵母屬菌種，包括多形漢遜酵母(H. polymorpha)；假 絲酵母屬菌種；毛孢子菌屬菌種(Trichosporon spp.) ；YamEukzyma屬菌種，包括Y. spp. Stipitis，球有孢圓酵母(Torulaspora pretoriensis)；裂殖酵母屬菌種，包括粟酒裂殖酵 母；隱球菌屬菌種(Cryptococcus spp.)；曲霉屬菌種(Aspergillus spp.)；脈孢菌屬菌種 (Neurospora spp.)或黑粉菌屬菌種(Ustilago spp.)。來自厭氧真菌的基因來源包括但不
25限于瘤胃壺菌屬菌禾中(Piromyces spp. )、Orpinomyces屬菌禾中或Neocallimastix屬菌禾中。 有用的原核酶的來源是包括但不限于大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、金 黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、芽孢桿菌屬菌種、梭菌屬菌種、棒桿菌屬菌種、假 單胞菌屬菌種、乳球菌屬菌種(Lactococcus spp.)、腸桿菌屬菌種(Enterobacter spp.)禾口 沙門氏菌屬菌種。一般的方法酵母微牛物中PDC的鑒定可以使用任何方法鑒定編碼具有丙酮酸脫羧酶(PDC)活性的酶的基因。PDC催化 丙酮酸脫梭以形成乙醛。一般而言，同源或相似的PDC基因和/或同源或相似的PDC酶可 以通過功能、結(jié)構(gòu)和/或遺傳分析來鑒定。在大多數(shù)情況下，同源或相似的PDC基因和/和 同源或相似的PDC酶會(huì)有功能、結(jié)構(gòu)或遺傳相似性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)可適用 于鑒定同源基因和同源酶。一般而言，類似基因和/或類似的酶可以通過功能分析來鑒定 并且會(huì)具有功能相似性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)可適用于鑒定類似基因和類似的 酶。例如，鑒定同源或類似基因、蛋白質(zhì)或酶的技術(shù)可以包括但不限于，使用基于基因/酶 的公開序列的引物通過PCR克隆PDC基因或使用設(shè)計(jì)用來擴(kuò)增PDC基因中保守區(qū)的簡并引 物通過簡并PCR克隆PDC基因。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用技術(shù)來鑒定具有功能同源 性或相似性的同源或類似的基因、蛋白質(zhì)或酶。這些技術(shù)包括通過針對所述活性的體外酶 測定法檢查細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的酶催化活性，然后通過純化分離具有所述活性的酶，通過 如Edman降解確定所述酶的蛋白質(zhì)序列，為最可能的核酸序列設(shè)計(jì)PCR引物、通過PCR對所 述DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，以及克隆所述核酸序列。用于鑒定同源或相似基因和/或同源或相似 的酶、類似基因和/或類似酶或蛋白質(zhì)的技術(shù)還包括將關(guān)于候選基因或酶的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫 如BRENDA、KEGG或MetaCYC比較。候選基因或酶可以根據(jù)此處的教導(dǎo)在上述數(shù)據(jù)中鑒定。 此外，PDC活性可以從表型上確定。例如，可以評價(jià)在發(fā)酵條件下的乙醇產(chǎn)生。乙醇產(chǎn)生的 缺乏可能預(yù)示著酵母微生物不具有PDC活性?；虿迦牖蛉笔Э梢允褂萌魏畏椒ㄒ詫⒑怂岱肿右虢湍钢校⑶乙阎S多這樣的方法。例如， 轉(zhuǎn)化和電穿孔是將核酸引入酵母細(xì)胞的常用方法。參見，例如Gietz et al. , Nucleic Acids Res. 27 :69-74(1992) ；Ito et al.,J.Bacterol. 153 163-168(1983)；禾口Becker and Guarente, Methods in Enzymoiogy 194:182—187(1991)。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)同源重組的原理，發(fā)生目標(biāo)基因整合到酵母微生物的 DNA片段或目標(biāo)基因中。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式，將包含含有至少一種酵母標(biāo)記基因和/或待 整合基因的模塊(內(nèi)部模塊)的整合盒用與目標(biāo)整合位點(diǎn)兩端的DNA片段同源的DNA片 段(引起重組的序列)從兩側(cè)包圍。在通過合適的方法用所述整合盒轉(zhuǎn)化酵母之后，引 起重組的序列之間的同源重組可以導(dǎo)致內(nèi)部模塊取代基因組中對應(yīng)于整合盒中引起重組 之序列的兩個(gè)位點(diǎn)間的染色體區(qū)域(Orr-Weaver et al.，Proc Natl Acad Sci USA 78 6354-6358(1981))。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于將目標(biāo)基因整合入酵母微生物的整合盒包括在適當(dāng)啟動(dòng) 子和終止子控制下的異源基因以及選擇標(biāo)記，它們由引起重組的序列從側(cè)翼包圍，用于異 源基因整合入酵母染色體。在一個(gè)實(shí)施方式中，異源基因包括適當(dāng)?shù)奶烊换?，期望增加天然基因的拷貝?shù)。選擇標(biāo)記基因可以是用于酵母的任何標(biāo)記基因，包括但不限于HIS3、 TRPl、LEU2、URA3、bar、ble、hph和kan。引起重組的序列可以隨意選擇，取決于適合于所需 用途的理想整合位點(diǎn)。在另一實(shí)施方式中，將基因整合入酵母微生物的染色體可以通過隨機(jī)整合發(fā)生 (Kooistra, R. , Hooykaas, P. J. J. , Steensma, H. Y. 2004. Yeast 21 :781_792)。此外，在一個(gè)實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)從基因組去除某些引 入的標(biāo)記基因。例如，URA3標(biāo)記的丟失可以通過將含URA3的細(xì)胞鋪板在含有FOA (5-氟-乳 清酸)的培養(yǎng)基中并選擇FOA抗性菌落而獲得(Boeke,J. et al, 1984,Mol. Gen. Genet, 197， 345-47)。包含在本公開的酵母細(xì)胞內(nèi)的外源核酸分子可以任何形式保持在細(xì)胞中。例如， 外源核酸分子可以整合入細(xì)胞的基因組或保持在附加體狀態(tài)，這種狀態(tài)可以穩(wěn)定地傳遞 (“遺傳”)給子細(xì)胞。這樣的染色體外遺傳元件(如質(zhì)粒等)能夠額外包含確保這樣的遺 傳元件在子細(xì)胞中存在的選擇標(biāo)記。此外，可以將酵母細(xì)胞穩(wěn)定地或暫時(shí)地轉(zhuǎn)化。此外，此 處所述的酵母細(xì)胞可以含有如上所述的特定外源核酸分子的單個(gè)拷貝或多個(gè)拷貝。酶活件的降低在本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母微生物可以具有降低的酶活性，例如降低的丙酮酸脫羧酶 活性。如此處使用的關(guān)于特定酶活性的術(shù)語“降低”指的是與在相同種的可比較的酵母細(xì) 胞中測量的相比較低的酶活性水平。術(shù)語降低還指與相同種的可比較的酵母細(xì)胞中測量 的相比消除了酶活性。這樣，缺乏丙酮酸脫羧酶活性的酵母細(xì)胞被視為具有降低的丙酮酸 脫羧酶活性，因?yàn)?，即使不是全部，也是大部分的可比較的酵母菌株具有至少一些丙酮酸 脫梭酶活性。這種降低的酶活性可以是較低的酶濃度和/或較低的酶比活性的結(jié)果?？?以使用許多不同的方法以產(chǎn)生具有降低的酶活性的酵母。例如，可以使用常用的誘變或 敲除技術(shù)工程改造酵母細(xì)胞以使其具有被破壞的酶編碼基因座。參見，例如Methods in Yeast Genetics(1997 版)，Adams, Gottschling, Kaiser 禾口 Stems, Cold Spring Harbor Press (1998) 0此外，可以引入導(dǎo)致具有降低活性的酶的某寫點(diǎn)突變。或者，可以使用反義技術(shù)來降低酶活性。例如，可以工程改造酵母以使其包含編碼 反義分子的cDNA，該反義分子阻止酶的產(chǎn)生。如此處所用的術(shù)語“反義分子”包括含有對應(yīng) 于內(nèi)源多肽編碼鏈的序列的任意核酸分子。反義分子還可以具有側(cè)翼序列(如調(diào)節(jié)序列)。 因此，反義分子可以是核酶或反義寡核苷酸。核酶可具有任意的一般結(jié)構(gòu)，包括但不限于， 發(fā)夾、錘頭或斧頭(axhead)結(jié)構(gòu)，只要該分子切割RNA。具有降低的酶活性的酵母可以用多種方法鑒定。例如，具有降低的丙酮酸脫羧酶 活性的酵母可以使用普通方法容易地鑒定，該方法可以包括，例如，通過氣相層析測量乙醇 的形成。異源基因的過表達(dá)從天然或異源核酸分子過表達(dá)多肽的方法是已知的。這些方法包括，但不限于，構(gòu) 建核酸序列使得調(diào)節(jié)元件促進(jìn)編碼所需多肽的核酸序列的表達(dá)。通常調(diào)節(jié)元件是在轉(zhuǎn)錄水 平調(diào)節(jié)其他DNA序列表達(dá)的DNA序列。因此，調(diào)節(jié)元件包括，但不限于，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等。 例如，外源基因可以在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子控制之下。而且，已知在酵母種自外源 核酸分子表達(dá)多肽的方法。例如，已知用于在克魯維酵母屬和酵母屬內(nèi)表達(dá)外源多肽的核酸構(gòu)建體(參見，對于克魯維酵母屬，例如美國專利號4，859，596和4，943，529，以及對于酵 母屬，例如，Gellissen等人Gene 190(1) :87_97 (1997))。此外，某些質(zhì)粒也可以含有著絲 粒序列。這些著絲粒質(zhì)粒通常是單拷貝或低拷貝質(zhì)粒。無著絲粒序列并利用2微米(釀酒 酵母)或1.6微米(乳酸克魯維酵母)復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒是高拷貝質(zhì)粒。選擇標(biāo)記可以是原 養(yǎng)型的，如HIS3、TRP1、LEU2、URA3或ADE2，或者抗生素抗性，如bar、ble、hph或kan。在另一實(shí)施方式中，異源調(diào)控元件可以用于激活或抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。此外，當(dāng) 表達(dá)需要受到抑制或消除時(shí)，可以通過已知的缺失技術(shù)來消除相關(guān)的酶、蛋白質(zhì)或RNA的 基因。如在此處所述，本公開范圍內(nèi)的任何酵母可以通過針對所表達(dá)、過表達(dá)或抑制的 特定酶的選擇技術(shù)來鑒定。鑒定具有所需表型的菌株的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。 這些方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR和核酸雜交技術(shù)如Northern和Southern分析，改變 在特定底物上或在特定底物、化合物、選擇劑等存在下的生長能力。在一些情況下，免疫組 織化學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)可以通過探測編碼多肽的表達(dá)來確定細(xì)胞是否包含特定核酸。例 如，對于編碼的酶具有特異性的抗體可以用于確定特定酵母細(xì)胞是否包含該編碼的酶。進(jìn) 一步，生物化學(xué)技術(shù)可以用于通過檢測作為酶多肽表達(dá)的結(jié)果產(chǎn)生的產(chǎn)物來確定細(xì)胞是否 包含編碼酶多肽的特定核酸分子。例如，用編碼乙酰乳酸合酶的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞并檢測與無 載體的細(xì)胞相比乙酰乳酸濃度的增加同時(shí)表明載體存在且基因產(chǎn)物有活性。檢測特定酶 活性或特定產(chǎn)物存在的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如，乙酰乳酸的存在可以按 Hugenholtz and Starrenburg, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 17-22 (1992)所描述的方 法來測定。酶活性的增加可以進(jìn)一步工程改造本發(fā)明的酵母微生物以使其具有增加的酶活性。如此處所用 的關(guān)于特定酶活性的術(shù)語“增加的”指的是與在相同種的可比較的酵母細(xì)胞中測量的相比 更高的酶活性水平。例如，特定酶的過表達(dá)可以導(dǎo)致在細(xì)胞中該酶的活性水平增加。糖酵 解或異丁醇途徑中涉及的酶活性的增加會(huì)導(dǎo)致異丁醇的生產(chǎn)率和產(chǎn)量的增加。增加酶活性的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這些技術(shù)可以包括通過增加的拷 貝數(shù)和/或使用強(qiáng)啟動(dòng)子、引入減輕對酶的負(fù)調(diào)節(jié)的突變、引入增加比活性和/或降低對底 物的Km的特定突變、或通過定向進(jìn)化來增加酶的表達(dá)。參見，例如Methods in Molecular Biology(vol. 231), ed. Arnold and Georgiou, Humana Press (2003)。麗此處公開的生物催化劑可將多種碳源轉(zhuǎn)化為異丁醇，術(shù)語“碳源”通常指適合用 作供原核或真核生物細(xì)胞生長用的碳的來源的物質(zhì)。碳源包括，但不限于，生物質(zhì)水解產(chǎn) 物、淀粉、蔗糖、纖維素、半纖維素、木糖和木質(zhì)素，以及這些底物的單體成分。碳源可以包括 各種不同形式的多種有機(jī)化合物，包括，但不限于聚合物、碳水化合物、酸類、醇類、醛類、酮 類、氨基酸類、多肽類等。這些包括，例如多種單糖(例如，葡萄糖、右旋糖(D-葡萄糖)、麥 芽糖、寡糖、多糖)、飽和或不飽和脂肪酸、琥珀酸鹽/酯、乳酸鹽/酯、乙酸鹽/酯、乙醇等， 或其混合物。光合生物可以額外地產(chǎn)生作為光合作用產(chǎn)物的碳源。在一些實(shí)施方式中，碳 源可以選自生物質(zhì)水解產(chǎn)物和葡萄糖。所用術(shù)語“C2-化合物”指的是包括兩個(gè)碳原子的有機(jī)化合物，包括但不限于乙醇和乙酸鹽/酯，該“C2-化合物”用作碳源供經(jīng)工程改造的酵母用，所述酵母在所有丙酮酸脫 羧酶(PDC)基因中帶有突變，導(dǎo)致所述基因的丙酮酸脫羧酶活性降低。術(shù)語“原料”定義為提供給微生物或發(fā)酵過程的、可以自其產(chǎn)生其他產(chǎn)物的原材料 或原材料的混合物。例如，碳源(如生物質(zhì)或由生物質(zhì)衍生的含碳化合物)是供在發(fā)酵過 程中產(chǎn)生生物燃料的微生物用的原料。然而，原料可以含有除碳源外的營養(yǎng)物。術(shù)語“傳統(tǒng)的碳水化合物”指的是產(chǎn)生自專用植物如甘蔗、玉米和小麥的糖和淀 粉。通常，這些專用植物在植物的某些部分(如谷粒)中集中了糖和淀粉，該部分被收獲并 加工以提取糖和淀粉。傳統(tǒng)的碳水化合物被用作食物，以及較低程度地被用作碳源供產(chǎn)生 生物燃料和化學(xué)品的發(fā)酵過程用。此處所用的術(shù)語“生物質(zhì)”主要是指綠色植物的莖、葉和含淀粉部分，并且主要由 淀粉、木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和/或果膠組成。生物質(zhì)可以通過化學(xué)處理或酶處理分 解成組成該生物質(zhì)的單體糖和酚類。(Wyman，CE. 2003 Biotechnological Progress 19: 254-62)。這樣所得的物質(zhì)稱為生物質(zhì)水解產(chǎn)物，對其進(jìn)行中和并處理以除去痕量的可能不 利地影響生物催化劑的有機(jī)物質(zhì)，然后用作原料供使用生物催化劑的發(fā)酵用。此處所用的術(shù)語“淀粉”是指容易通過消化酶水解的葡萄糖的聚合物。淀粉通常 集中在植物的專門部分，如馬鈴薯、玉米粒、稻粒、麥粒和甘蔗莖。此處所用的術(shù)語“木質(zhì)素”是指聚合物材料，其主要由連接的酚類單體化合物(如 對香豆醇、松柏醇和芥子醇)組成，其形成植物中結(jié)構(gòu)剛性的基礎(chǔ)并且常常是指作為植物 的木質(zhì)部分。木質(zhì)素也被視為植物細(xì)胞壁的非-碳水化合物部分。此處所用的術(shù)語“纖維素”是指化學(xué)式(C6HltlO5)n的β-葡萄糖的長鏈高分子多糖 碳水化合物，通常與木質(zhì)素和任何半纖維素一起存在于植物細(xì)胞壁中。術(shù)語“半纖維素”指的是一類植物細(xì)胞壁多糖，其可以為幾種雜聚物中的任一。這 些包括木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡糖醛酸木聚糖、葡甘露聚糖和 半乳甘露聚糖。半纖維素的單體成分包括但不限于D_半乳糖、L-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠 李糖、L-巖藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡糖醛酸。這類多糖與纖維素一起存在于幾乎 所有的細(xì)胞壁中。半纖維素重量比纖維素低且不能通過熱水或螯合劑萃取，但是可以通過 堿性水溶液萃取。半纖維的高分子鏈結(jié)合交聯(lián)纖維網(wǎng)絡(luò)中的果膠和纖維素，形成大多數(shù)植 物細(xì)胞的細(xì)胞壁。特征為以高產(chǎn)率產(chǎn)牛異丁醇的微牛物為了使生物催化劑最經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生異丁醇，期望產(chǎn)生高產(chǎn)率。優(yōu)選地，產(chǎn)生的唯一產(chǎn) 物是異丁醇。額外的產(chǎn)物導(dǎo)致產(chǎn)率的減少以及資本和生產(chǎn)費(fèi)用的增加，特別是如果副產(chǎn)品 價(jià)值很小或沒有價(jià)值。副產(chǎn)品還需要額外的資本和生產(chǎn)費(fèi)用來講這些產(chǎn)物與異丁醇分離。微生物以高于理論值的5%的產(chǎn)率將一種或多種由生物質(zhì)衍生的碳源轉(zhuǎn)化為異丁 醇。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于10%。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的50%。在 一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的60%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的70%。 在又一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的80%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的 85%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的90%。在又一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值 的95 %。在又一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的97.5%。更具體而言，微生物以高于理論值的5%的產(chǎn)率將由生物質(zhì)衍生的葡萄糖轉(zhuǎn)化為
29異丁醇。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的10%。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值 的50%。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的60%。在另一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論 值的70%。在又一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的80%。在又一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理 論值的85%。在又一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的90%。在又一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于 理論值的95%。在又一實(shí)施方式中，產(chǎn)率高于理論值的97. 5%。紐M爾寸表汰·PdC- ■剩■物在酵母中，丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛是對丙酮酸池的主要消耗(圖2A)，而因此，是與異 丁醇途徑競爭的主要因素。這種反應(yīng)由丙酮酸脫羧酶(PDC)酶催化。酵母微生物中的這種 酶活性的降低導(dǎo)致用于異丁醇途徑的丙酮酸和還原當(dāng)量的可用性增加，并可以在表達(dá)丙酮 酸依賴性異丁醇途徑的酵母微生物中改進(jìn)異丁醇的產(chǎn)生和產(chǎn)率(圖2B)。PDC活性的降低可以由如下方式實(shí)現(xiàn)1)編碼PDC的結(jié)構(gòu)基因的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的 突變或缺失，或2)在給定生物體中所有PDC基因的突變或缺失。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子”可以指 定反向作用的蛋白質(zhì)或核酸以增加或減少基因組中不同基因座的轉(zhuǎn)錄。例如，在釀酒酵母 中，編碼PDC1，5，6基因正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的PDC2基因可以被缺失；報(bào)道缺失了 PDC2基因的釀 酒酵母僅具有野生型 PDC 活性的 10% (Hohmann, Mol Gen Genet, 241 :657_666 (1993))。 或者，例如，將PDC的所有結(jié)構(gòu)基因(如在釀酒酵母中的PDC1、PDC5、PDC6或在乳酸克魯維 酵母中的PDC1)缺失。包含對所有三個(gè)PDC等位基因的破壞的Crabtree-陽性酵母菌株(如釀酒酵母菌 株)不再通過發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。然而，由PDC催化的反應(yīng)的下游產(chǎn)物乙酰輔酶A是合成代謝 產(chǎn)生必要分子所需要的。因此，Pdc突變體不能單獨(dú)在葡萄糖中生長，還需要二-碳的碳源， 或者乙醇或乙酸鹽，以合成乙酰輔酶A (Flikweert MT, de Swaaf M, van Dijken JP, Pronk JT.FEMS Microbiol Lett. 1999May 1 ；174(1) :73_9· PMlD 10234824 and van Maris AJ, Geertman JM,Vermeulen A,Groothuizen MK,Winkler AA,Piper MD,van Dijken JP,Pronk JT. Appl Environ Microbiol. 2004 Jan ；70(1) :159_66. PMID :14711638)。因而，在一個(gè)實(shí) 施方式中，這種Crabtree-陽性酵母菌株可以進(jìn)化以產(chǎn)生PDC突變體酵母的變體，其不需 要二碳分子且在葡萄糖上與野生型具有相似的生長速率?？梢允褂冒ê慊鬟M(jìn)化或系列 稀釋的任何方法來產(chǎn)生能夠在作為單一碳源的葡萄糖上以類似于野生型的速率生長的、缺 失三個(gè) PDC 等位基因的菌株變體(van Maris et al，，Directed Evolution of Pyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomyces cerevisiae, Yielding a C2_independentt Glucose-Tolerant, and Pyruvate-Hyperproducing Yeast, Applied and Environmental Microbiology,2004，70(1)，159-166)。在以高產(chǎn)率由碳源產(chǎn)生異丁醇的方法中，將所述酵母微生物在包含碳源的適當(dāng)培
養(yǎng)基中培養(yǎng)。另一個(gè)示例性的實(shí)施方式提供了用于產(chǎn)生異丁醇的方法，包括在包含碳源的合適 培養(yǎng)基中的本發(fā)明的重組酵母微生物，所述碳源可以通過本發(fā)明的酵母微生物轉(zhuǎn)化為異丁醇。在某些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基分離異丁醇。例如，可以通過本 領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法(如蒸餾、全蒸發(fā)或液_液提取)從培養(yǎng)基分離異丁醇。實(shí)施例通用方法樣品制各將來自發(fā)酵液的樣品(2mL)儲(chǔ)存在_20°C以供后續(xù)的底物和產(chǎn)物分析。 分析之前，將樣品解凍，然后以14，OOOXg離心10分鐘。上清通過0.2μπι濾器過濾。使用 可靠的標(biāo)準(zhǔn)品(>99%，購自Sigma-Aldrich)和5-點(diǎn)校準(zhǔn)曲線(用1_戊醇作為內(nèi)標(biāo)物用 于氣相層析分析)進(jìn)行底物和產(chǎn)物的分析。光密度和細(xì)胞干重的測定在600nm用DU 800分光光度計(jì)(Beckman-Coulter， Fulierton, CA, USA)測定酵母培養(yǎng)物的光密度。視需要稀釋樣品以得到0. 1-0. 8的光密 度。通過離心50mL培養(yǎng)基之后傾析上清液來測定細(xì)胞干重。用50mL milliQ水洗滌細(xì)胞 團(tuán)塊一次，離心并將團(tuán)塊用25mL milliQ水再次洗滌。然后將細(xì)胞團(tuán)塊在80°C下干燥至少 72小時(shí)。通過從包含干細(xì)胞團(tuán)塊的離心管的重量中扣去離心管的重量計(jì)算得到細(xì)胞干重。氣相層析對乙醇和異丁醇的分析在配備有DB-FFAP柱(Agilent Technologies ； 長度30m，ID 0. 32mm，膜厚度0. 25 μ Μ)或等效連接到火焰電離檢測器(FID)的HP 5890 氣相層析儀中進(jìn)行。溫度程序如下注射器20(TC ；探測器30(TC ；烤箱10(TC，1分鐘； 700C /分鐘梯度升溫至235°C，然后維持2. 5分鐘。高效液相層析在配備有Aminex HPX-87H離子排阻柱(Bio-Rad，300x7. 8mm)或 等同物和H+陽離子保護(hù)柱或等同物的HP-1100高效液相層析系統(tǒng)上進(jìn)行對葡萄糖和有機(jī) 酸的分析。有機(jī)酸使用HP-1100 UV檢測器(210nm，8nm 360nm參比)檢測，而葡萄糖用 HP-1100折射率檢測器來檢測。柱溫是60°C。這種方法用0.008N硫酸水溶液作為恒定流 動(dòng)相。流速設(shè)為0. 6mL/min，注入量是20 μ L而運(yùn)行時(shí)間是30分鐘。厭氧分批發(fā)酵厭氧分批培養(yǎng)在30°C下在用塞密封的IOOmL血清瓶中進(jìn)行。使用 初始葡萄糖濃度為20g/L葡萄糖的總共20mL合成培養(yǎng)基(Kaiser et al,Methods in Yeast Genetics, a Cold Spring Harbor Laboratory Manual (1994))。在 24 禾口 48 小時(shí)取出 2mL 樣品。在48小時(shí)后或當(dāng)所有葡萄糖耗盡時(shí)結(jié)束發(fā)酵。通過如上所述的氣相層析和/或高 效液相層析來處理和分析樣品。酵母轉(zhuǎn)化-乳酸克魯維酵母根據(jù)Kooistra等，Yeast 21 :781_792 (2004)通過 電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。釀酒酵母的乙酸鋰轉(zhuǎn)化通過乙酸鋰法轉(zhuǎn)化了菌株(Gietz et al.，Nucleic Acids Res. 27 =69-74(1992)。通過在室溫下以2700rcf離心2分鐘從過夜培養(yǎng)物收集細(xì)胞，所述 培養(yǎng)物以大約0.8 1.0的OD6tltl生長在50mL成分確定的(SC)乙醇培養(yǎng)基中。將細(xì)胞團(tuán)塊 再懸浮在50mL無菌水中，通過離心法收集(2700rcf ；2min ；室溫)，然后重懸在25mL蒸餾水 中。通過離心收集(2700 rcf ；2min ；室溫)細(xì)胞，并重懸在ImL的IOOmM乙酸鋰中。將細(xì) 胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌的1. 5ml管中，并通過全速離心10秒收集。將細(xì)胞重懸在體積為細(xì)胞團(tuán) 塊體積四倍的IOOmM碳酸鋰中(例如，100 μ L細(xì)胞團(tuán)塊用400 μ L)。向制成的DNA混合物 (72 μ 1 50% PEGUO μ 1 IM碳酸鋰、3 μ 1煮沸的鮭精DNA和5 μ 1的各質(zhì)粒)加入15 μ 1細(xì) 胞懸液并通過渦旋振蕩混合，其間短暫停頓5次。將細(xì)胞/DNA懸液在30°C下溫育30分鐘 并在42°C下溫育22分鐘。通過全速離心10秒收集細(xì)胞并重懸在100 μ 1 S0S(1M山梨醇， 0. 34% (w/v)酵母提取物，0.68% (w/v)蛋白胨，6. 5mM CaCl2)中。將所述細(xì)胞懸液鋪在適當(dāng)?shù)倪x擇性瓊脂平板上。酵母菌落PCR:從瓊脂培養(yǎng)基取酵母細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到30 μ 1 0.2% SDS中，然后在 90°C加熱4分鐘。離心沉降(spun down)細(xì)胞，并將1 μ 1上清用于使用標(biāo)準(zhǔn)Taq(NEB)的 PCR。 ^ ^ 除非特別聲明，通常采用用于克隆和質(zhì)粒構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方 法(Sambrook & Russell)。培養(yǎng)基YP 包含(w/v)酵母提取物、2% (w/v)蛋白胨。YPD為包含2% (w/v)葡萄糖 的YP，YPE為包含2% (w/v)乙醇的YP。SC+Complete :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加劑 (包括氨基酸和營養(yǎng)物，不包括組氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)和6. 7g/LDifC0TM Yeast Nitrogen Base、0. 076g/L 組氨酸、0. 076g/L 色氨酸、0. 380g/L 亮氨酸和 0. 076g/L 尿嘧啶。SC-HWUL :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加劑(包 括氨基酸和營養(yǎng)物，不包括組氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)和6. 7g/LDifC0 Yeast Nitrogen Base。SC-WLU :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加劑(包括 氨基酸和營養(yǎng)物，不包括組氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6. 7g/L不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base 禾口 0. 076g/L 組氛酸。SC-HWU :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加劑(包括 氨基酸和營養(yǎng)物，不包括組氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6. 7g/L不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base 禾口 0. 380g/L 亮氛酸。SC-乙醇-HWU (w/v)乙醇、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加劑 (包括氨基酸和營養(yǎng)物，不包括組氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base 禾口 0. 380g/L 亮氛酸。上述培養(yǎng)基的固體形式含2% (w/v)瓊脂。菌株、質(zhì)粒和引物序列表1詳細(xì)顯示了本文公開的菌株的表型
權(quán)利要求
產(chǎn)生異丁醇的方法，該方法包括提供包含產(chǎn)生異丁醇的代謝途徑的重組微生物，所述微生物經(jīng)選擇從而以至少5％的理論產(chǎn)率從碳源產(chǎn)生異丁醇；在包含提供碳源的原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，直至產(chǎn)生可回收量的異丁醇；和回收異丁醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物經(jīng)選擇從而以大于約10%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生 異丁醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物經(jīng)選擇從而以大于約20%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生 異丁醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物經(jīng)選擇從而以大于約50%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生 異丁醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述重組微生物經(jīng)工程改造從而與親本微生物相比具 有降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物在至少一種丙酮酸脫羧酶(PDC)基因 中包含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物包含部分缺失的丙酮酸脫羧酶(PDC) 基因，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物完全缺失丙酮酸脫羧酶(PDC)基因，其 導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物包含對與至少一種丙酮酸脫羧酶 (PDC)基因相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)的修飾，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物包含對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的修飾，其導(dǎo)致丙 酮酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)錄降低。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物在所有丙酮酸脫羧酶(PDC)基因中包 含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而表達(dá)將丙酮 酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的異源代謝途徑。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而提高將丙酮 酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的天然代謝途徑的活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述重組微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而表達(dá)將丙酮 酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的代謝途徑，其中所述微生物包含至少一種由異源基因編碼的酶和至少一 種由天然基因編碼的酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物經(jīng)選擇以包含將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的 天然代謝途徑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物為酵母進(jìn)化枝(Saccharomycesclade)的 酵母微生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以高于約10%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以高于約20%的理論產(chǎn)2率產(chǎn)生異丁醇。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)選擇從而以高于約50%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)工程改造從而與親本生物體 相比具有降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物在至少一種丙酮酸脫羧酶 (PDC)基因中包含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脫羧酶 基因，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物完全缺失丙酮酸脫羧酶基因， 其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物包含對與至少一種丙酮酸脫羧 酶基因相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)的修飾，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物包含對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的修飾，其 導(dǎo)致丙酮酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)錄降低。
26.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物在所有丙酮酸脫羧酶(PDC)基 因中包含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
27.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而表達(dá)將 丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的異源代謝途徑。
28.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而提高將 丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的天然代謝途徑的活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而表達(dá)將 丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的代謝途徑，其中所述途徑包含至少一種由異源基因編碼的酶和至少 一種由天然基因編碼的酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)選擇從而包含將丙酮酸轉(zhuǎn)化 為異丁醇的天然代謝途徑。
31..根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述重組酵母微生物以基本上等同于親本微生物 生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
32.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物為酵母屬(Saccharomyces)狹義酵母微生物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述酵母屬狹義酵母微生物選自如下的 種之一釀酒酵母(S. cerevisiae)、釀酒酵母(S. cerevisiae)、庫德里阿茲威酵 母(S. kudriavzevii)、S.mikatae、貝酵母(S. bayanus)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、 S. carocanis或其雜禾中。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述微生物經(jīng)選擇從而以大于約10%的理論產(chǎn)率產(chǎn) 生異丁醇。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述微生物經(jīng)選擇從而以大于約20%的理論產(chǎn)率產(chǎn) 生異丁醇。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述微生物經(jīng)選擇從而以大于約50%的產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述重組酵母微生物具有降低的丙酮酸脫羧酶 (PDC)活性。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物在至少一種丙酮酸脫羧酶 (PDC)基因中包含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物在所有丙酮酸脫羧酶(PDC)基 因中包含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脫羧酶 (PDC)基因，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物完全缺失丙酮酸脫羧酶基因， 其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
42.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物包含對與至少一種丙酮酸脫羧 酶基因相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)的修飾，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
43.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物包含對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的修飾，其 導(dǎo)致丙酮酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)錄的降低。
44.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而表達(dá)將 丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的異源代謝途徑。
45.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而提高將 丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的天然代謝途徑的活性。
46.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)進(jìn)一步工程改造從而表達(dá)將 丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的代謝途徑，其中所述代謝途徑包含至少一種由異源基因編碼的酶和 至少一種由天然基因編碼的酶。
47.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)選擇從而包含將丙酮酸轉(zhuǎn)化 為異丁醇的天然代謝途徑。
48.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述重組酵母微生物以基本上等同于親本微生物生 長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
49.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酵母微生物為Crabtree-陽性酵母微生物。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述Crabtree-陽性酵母微生物選自如下的屬之一 酵母屬、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母 屬(Debaryomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述Crabtree-陽性酵母微生物選自釀酒酵母、葡萄 fhf^fij、貝胃(Saccharomyces paradoxus) >Saccharomyces castelli、3SL 酵母(Saccharomyces kluyveri)、耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光 滑假絲酵母(Candida glabrata)、拜耳接合酵母(Z. bailli)、魯氏接合酵母(Z.rouxii)、 漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastorius)、粟酒裂 殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或葡萄汁酵母。
52.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以大于約10%的理論產(chǎn) 率產(chǎn)生異丁醇。
53.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以大于約20%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。
54.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以大于約50%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。
55.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)工程改造而從與親本微生物相比 具有降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物在至少一種丙酮酸脫羧酶 (PDC)基因中包含突變。
57.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物在所有丙酮酸脫羧酶(PDC)基 因中包含突變，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
58.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脫羧酶 基因，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
59.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物完全缺失丙酮酸脫羧酶基因， 其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
60.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物包含對與至少一種丙酮酸脫羧 酶基因相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)的修飾，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
61.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組微生物包含對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的修飾，其導(dǎo)致 丙酮酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)錄降低。
62.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)工程改造從而表達(dá)將丙酮酸 轉(zhuǎn)化為異丁醇的異源代謝途徑。
63.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)工程改造從而提高將丙酮酸 轉(zhuǎn)化為異丁醇的天然代謝途徑的活性。
64.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)工程改造從而表達(dá)將丙酮酸 轉(zhuǎn)化為異丁醇的代謝途徑，其中所述代謝途徑包含至少一種由異源基因編碼的酶和至少一 種由天然基因編碼的酶。
65.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組酵母微生物以基本上等同于親本微生物生 長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
66.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述重組微生物經(jīng)選擇從而包含將丙酮酸轉(zhuǎn)化為異 丁醇的天然代謝途徑。
67.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物為后-WGD(全基因組倍增)酵母。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述后-W⑶酵母選自酵母屬或假絲酵母屬之一。
69.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述后-WGD酵母選自釀酒酵母、葡萄汁酵母、貝酵 母、奇異酵母、Saccharomyces castelli和光滑假絲酵母。
70.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以大于約10%的理論產(chǎn) 率產(chǎn)生異丁醇。
71.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以大于約20%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。
72.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)選擇從而以大于約50%的理論產(chǎn)率產(chǎn)生異丁醇。
73.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)工程改造從而與親本微生物相比具有降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物在至少一種丙酮酸脫羧酶 (PDC)基因中包含突變，其導(dǎo)致所述基因的丙酮酸脫羧酶活性降低。
75.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物在所有丙酮酸脫羧酶(PDC)基 因中包含突變，其導(dǎo)致所述基因的丙酮酸脫羧酶活性降低。
76.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脫羧酶 基因，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
77.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物完全缺失丙酮酸脫羧酶基因， 其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
78.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組微生物包含對與至少一種丙酮酸脫羧酶基 因相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)的修飾，其導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的丙酮酸脫羧酶活性降低。
79.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組微生物包含對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的修飾，其導(dǎo)致 丙酮酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)錄的降低。
80.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)工程改造從而表達(dá)將丙酮酸 轉(zhuǎn)化為異丁醇的異源代謝途徑。
81.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)工程改造從而提高將丙酮酸 轉(zhuǎn)化為異丁醇的天然代謝途徑的活性。
82.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)工程改造從而表達(dá)將丙酮酸 轉(zhuǎn)化為異丁醇的代謝途徑，其中所述代謝途徑包含至少一種由異源基因編碼的酶和至少一 種由天然基因編碼的酶。
83.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物經(jīng)選擇從而包含將丙酮酸轉(zhuǎn)化 為異丁醇的天然代謝途徑。
84.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述重組酵母微生物以基本上等同于親本微生物生 長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
85.產(chǎn)生異丁醇的方法，該方法包括提供重組微生物，其包含a)產(chǎn)生異丁醇的代謝途徑，所述微生物經(jīng)選擇從而從碳源產(chǎn)生異丁醇；b)與親本微生物相比降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性；在包含提供碳源的原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，直至產(chǎn)生可回收量的異丁醇；和回收異丁醇。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述微生物為酵母進(jìn)化枝的酵母。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，其中所述微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于親本微 生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
88.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述微生物為酵母屬狹義酵母。
89.根據(jù)權(quán)利要求88的方法，其中所述酵母屬狹義酵母微生物選自釀酒酵母、釀酒酵 母、庫德里阿茲威酵母、S. mikatae、貝酵母、葡萄汁酵母、S. carocanis或其雜種。
90.根據(jù)權(quán)利要求88的方法，其中所述微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于親本微 生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
91.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述微生物為Crabtree-陰性酵母微生物。
92.根據(jù)權(quán)利要求91的方法，其中所述Crabtree-陰性酵母微生物選自如下的屬之一 克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、漢遜酵母屬(Hansenula)或假絲 酵母屬。
93.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述Crabtree-陰性酵母微生物選自乳酸克魯 維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、 異常畢赤酵母(Pichia anomala)、樹干畢赤酵母屬(Pichia stipitis)、東方伊薩酵母 (I.orientalis)、罕見伊薩酵母(I. occidentalis)、菱形伊薩酵母(I. scutulata)、異常 漢遜酵母(Hanenusula anomala)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)或 Kluyveromyces waltii ο
94.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述酵母微生物為Crabtree-陽性酵母微生物。
95.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于親 本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
96.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中所述Crabtree-陽性酵母微生物選自如下的屬之一 酵母屬、克魯維酵母屬、接合酵母屬、德巴利酵母屬、畢赤酵母屬或裂殖酵母屬。
97.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中所述Crabtree-陽性酵母微生物選自釀酒酵母、葡萄 汁酵母、貝酵母、奇異酵母、Saccharomyces castelli、克魯弗酵母、耐熱克魯維酵母、光滑 假絲酵母、拜耳接合酵母、魯氏接合酵母、漢遜德巴利酵母、巴斯德畢赤酵母、粟酒裂殖酵母 或葡萄汁酵母。
98.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述微生物為后-WGD(全基因組倍增)酵母。
99.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中后-W⑶酵母選自酵母屬或假絲酵母屬之一。
100.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中所述后-WGD酵母選自釀酒酵母、葡萄汁酵母、貝酵 母、奇異酵母、Saccharomyces castelli和光滑假絲酵母。
101.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于 親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
102.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述微生物為前-WGD(全基因組倍增)酵母。
103.根據(jù)權(quán)利要求102的方法，其中所述前-WGD酵母選自如下的屬之一酵母屬、克 魯維酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、伊薩酵母屬、西洋蓍霉 屬(Yarrowia)或裂殖酵母屬。
104.根據(jù)權(quán)利要求102的方法，其中所述前-WGD酵母選自克魯弗酵母、耐熱克魯維酵 母、馬克思克魯維酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克魯維酵母、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、巴斯德畢赤酵母、異常畢赤酵母屬、樹干畢赤酵母屬、漢遜德巴利酵母、異常 漢遜酵母、東方伊薩酵母、罕見伊薩酵母、菱形伊薩酵母、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。
105.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述微生物為非發(fā)酵酵母微生物。
106.根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述非發(fā)酵酵母微生物選自如下的屬之一絲孢 酵母屬(Tricosporon)、紅酵母屬(Rhodotorula)或 Myxozyma0
107.根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述非發(fā)酵酵母微生物選自以下的茁牙絲孢 _ 母(Tricosporon pullulans)、口譽(yù) 紅 _ 母(Rhodotorula lignophila)或 Myxozyma vanderwaltii> ZiIf f^BJ (Candida ethanolica) > Debaromyces carsonii gJc Pichia castillae。
108.重組微生物，其包含a)產(chǎn)生異丁醇的代謝途徑，所述微生物經(jīng)選擇從而從碳源產(chǎn)生異丁醇；b)與親本微生物相比降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性。
109.根據(jù)權(quán)利要求108的重組微生物，其中所述微生物為Crabtree-陰性酵母微生物。
110.根據(jù)權(quán)利要求109的重組微生物，其中所述Crabtree-陰性酵母微生物選自如下 的屬之一克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、伊薩酵母屬、漢遜酵母屬或假絲酵母屬。
111.根據(jù)權(quán)利要求109的重組微生物，其中所述Crabtree-陰性酵母微生物選自乳酸 克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、異常畢赤酵母、樹干畢赤酵母、東方伊薩酵母、罕見伊薩酵 母、菱形伊薩酵母、異常漢遜酵母、產(chǎn)朊假絲酵母菌或Kluyveromyces waltii.
112.根據(jù)權(quán)利要求108的重組微生物，其中所述微生物為酵母進(jìn)化枝的酵母。
113.根據(jù)權(quán)利要求112的重組微生物，其中所述酵母微生物經(jīng)工程改造從而使其以基 本上等同于親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性 不改變。
114.根據(jù)權(quán)利要求108的重組微生物，其中所述微生物為酵母屬狹義酵母。
115.根據(jù)權(quán)利要求114的重組微生物，其中所述酵母屬狹義酵母微生物選自釀酒酵 母、釀酒酵母、庫德里阿茲威酵母、S. mikatae、貝酵母、葡萄汁酵母、S. carocanis或這些種 的雜種。
116.根據(jù)權(quán)利要求114的方法，其中所述酵母微生物經(jīng)工程改造從而以基本上等同于 親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改變。
117.根據(jù)權(quán)利要求108的重組微生物，其中所述微生物為Crabtree-陽性酵母微生物。
118.根據(jù)權(quán)利要求117的重組微生物，其中所述微生物經(jīng)工程改造從而使其以基本上 等同于親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性不改 變。
119.根據(jù)權(quán)利要求117的重組微生物，其中所述Crabtree-陽性酵母微生物選自如下 屬之一酵母屬、克魯維酵母屬、接合酵母屬、德巴利酵母屬、畢赤酵母屬或裂殖酵母屬。
120.根據(jù)權(quán)利要求117的重組微生物，其中所述Crabtree-陽性酵母微生物選自釀酒 酵母、葡萄汁酵母、貝酵母、奇異酵母、Saccharomyces castelli、克魯弗酵母、耐熱克魯維 酵母、光滑假絲酵母、拜耳接合酵母、魯氏接合酵母、漢遜德巴利酵母、巴斯德畢赤酵母、粟 酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。
121.根據(jù)權(quán)利要求108的重組微生物，其中所述微生物為后-WGD(全基因組倍增)酵母。
122.根據(jù)權(quán)利要求121的重組微生物，其中所述酵母微生物經(jīng)工程改造從而使其以基 本上等同于親本微生物生長速率的生長速率不依賴C2-化合物在葡萄糖上生長而PDC活性 不改變。
123.根據(jù)權(quán)利要求121的重組微生物，其中所述后_WGD(全基因組倍增)酵母選自酵 母屬或假絲酵母屬之一。
124.根據(jù)權(quán)利要求121的重組微生物，其中所述后-WGD酵母選自釀酒酵母、葡萄汁酵 母、貝酵母、奇異酵母、Saccharomyces castelli和光滑假絲酵母。
125.根據(jù)權(quán)利要求108的重組微生物，其中所述微生物為前-WGD(全基因組倍增)酵母。
126.根據(jù)權(quán)利要求125的重組微生物，其中所述前-WGD酵母選自如下的屬之一酵母 屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、伊薩酵母屬、西洋 蓍霉屬或裂殖酵母屬。
127.根據(jù)權(quán)利要求125的重組微生物，其中所述前-WGD酵母選自克魯弗酵母、耐熱克 魯維酵母、馬克思克魯維酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克魯維酵母、熱帶假絲酵母、巴 斯德畢赤酵母、異常畢赤酵母、樹干畢赤酵母、漢遜德巴利酵母、異常漢遜酵母、東方伊索酵 母、罕見伊薩酵母、菱形伊薩酵母、解酯西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。
128.根據(jù)權(quán)利要求108的重組微生物，其中所述微生物為非發(fā)酵酵母微生物。
129.根據(jù)權(quán)利要求128的重組微生物，其中所述非發(fā)酵酵母微生物選自如下的屬之 一絲孢酵母屬、紅酵母屬或Myxozyma。
130.根據(jù)權(quán)利要求128的重組微生物，其中所述非發(fā)酵酵母微生物選自茁牙絲孢酵 (Rhodotorula lignophila) Myxozyma vanderwaltii>Debaromyces carsonii gJc Pichia castillae。9
全文摘要
本發(fā)明公開了產(chǎn)生異丁醇的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括提供用包含至少一種外源基因的異丁醇產(chǎn)生途徑的轉(zhuǎn)化的微生物。所述微生物經(jīng)選擇從而以至少10％的理論產(chǎn)率由碳源產(chǎn)生異丁醇。所述方法包括在含有提供碳源的原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物直至產(chǎn)生異丁醇。所述方法包括回收異丁醇。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物為具有Crabtree-陰性表型的酵母。在另一實(shí)施方式中，所述微生物為具有Crabtree-陽性表型的酵母微生物。本發(fā)明公開了產(chǎn)生異丁醇的微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物包含含有至少一種外源基因的異丁醇產(chǎn)生途徑，并經(jīng)選擇從以至少10％的理論產(chǎn)率由碳源產(chǎn)生可回收量的異丁醇。
文檔編號C12R1/645GK101952448SQ200880127344
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月23日
發(fā)明者克里斯托弗·史密斯, 凱瑟琳·A·鄧登, 尤維尼·古納沃德納, 彼得·邁因霍爾德, 瓊·尤拉諾, 里德·M·R·費(fèi)爾德曼, 阿里斯托斯·阿里斯蒂杜 申請人:格沃股份有限公司