專利名稱：表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的重組酵母基因工程菌株，特別涉及一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌，還涉及其構(gòu)建方法，進(jìn)一步涉及所表達(dá)的重組蛋白及其在研制新型抗禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的重組抗原疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒 (Reticuloendotheliosis virus, REV)感染引起的，能夠?qū)е码u體免疫抑制的一種重要的病毒病，嚴(yán)重危害著世界的養(yǎng)雞業(yè)。隨著該病近年來呈現(xiàn)的新的變化，如發(fā)病日齡升高，感染發(fā)病后死亡率升高，混合感染和繼發(fā)感染嚴(yán)重等，使得對(duì)該病的防治越來越棘手，但傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)難度大，病毒弱化困難，而且致弱的病毒很容易返強(qiáng)，使其很難在生產(chǎn)中安全應(yīng)用。REV基因組編碼feig、Pol和Env三種蛋白，囊膜蛋白env進(jìn)一步分為Gp90和Gp20 兩種蛋白，其中Gp90蛋白在病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體方面具有重要作用，人們利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)及桿狀病毒等真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Gp90基因均進(jìn)行了體外表達(dá)，但是由于表達(dá)產(chǎn)物或者不能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，或者蛋白表達(dá)量低，要產(chǎn)生高滴度抗體需要多次加強(qiáng)免疫，因此，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，不適合用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。本項(xiàng)目所利用的甲醇酵母具有表達(dá)產(chǎn)物活性高，生產(chǎn)規(guī)模容易放大，成本低廉等特點(diǎn)，使得利用該系統(tǒng)開發(fā)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病亞單位疫苗具有很好應(yīng)用前景。本申請(qǐng)所應(yīng)用的疫苗具有上述價(jià)廉，生物活性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榉乐飘?dāng)前流行的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病提供確實(shí)、有效的工具和手段，并可為防制禽類免疫抑制病提供有效的參考和經(jīng)驗(yàn)。 由于新型疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗具有更低的成本，這將為該疫苗的應(yīng)用創(chuàng)造了一個(gè)很好的條件，投入應(yīng)用后既能有效的防止疫病造成的損失，同時(shí)也降低了養(yǎng)殖成本。該疫苗的研制將創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明所解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌株，其特征在于所述菌株為重組巴斯德畢赤酵母 (Pichia. pastoris) SMDl 168 工程菌株，該菌株(pPIC9KrREVgp90/SMDl 168)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC 5046，保藏日期為2011年7月8日；本發(fā)明所解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建以上所述的重組酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步驟(l)Gp90基因的擴(kuò)增
以禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV/HLJR0901的基因組為模板，GenBank登錄號(hào)為GQ415646，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出Gp90基因序列，如SEQ IDNO 1所示；所述的 HLJR0901株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC 5015，保藏日期為2011年 7月8日；(2)將擴(kuò)增出的片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pPIC9k-Gp90,電轉(zhuǎn)化酵母SMDl 168感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選，PCR鑒定，得到重組酵母菌株；(3)對(duì)重組酵母菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的高表達(dá)菌株，并將其馴化為工程菌株，即得。其中所述的引物序列可為Gp90F :5’ AGCTACGTAATGGACTGTCTCACC 3’Gp90R 5 ’ AGAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCTTATGACGCCCAGC3’本發(fā)明所解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供所述的重組酵母工程菌株在表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90重組蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明所解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種由所述的重組酵母基因工程菌株表達(dá)的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90重組蛋白；及所述的重組蛋白在制備預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病疫苗藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所解決的第五個(gè)技術(shù)問題是提供一種預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病的重組抗原疫苗，其特征在于包含有效劑量的本發(fā)明所述的重組酵母基因工程菌株表達(dá)的重組蛋白和藥學(xué)上可接受的載體以及所述的重組抗原疫苗在制備預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所解決的第六個(gè)技術(shù)問題是提供了一種使用本發(fā)明所述的重組酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取以上所述的重組酵母工程菌株Iml接種于50ml MGY培養(yǎng)基中，30°C 300rpm 培養(yǎng)至OD6tltl為2-6時(shí)，接入發(fā)酵罐中，用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；( 轉(zhuǎn)速級(jí)聯(lián)到溶氧控制上，維持溶氧40%，溫度30°C，pH 6.0，培養(yǎng)20-2處，待溶氧升高，轉(zhuǎn)速下降時(shí)補(bǔ)加50%甘油，補(bǔ)加速度為15ml/L-h,補(bǔ)加4個(gè)小時(shí)，隨后進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)期，開始甲醇補(bǔ)量為3. 5ml/L *h，此階段持續(xù)2 5h，隨后根據(jù)發(fā)酵情況適度增加甲醇補(bǔ)量；(3)發(fā)酵72小時(shí)后收獲上清，進(jìn)行SDS-PAGE和Wfestern blot分析，并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。其中，所述的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基按照以下方法配制26. 7mL 85 % H3P04， 0. 93gCaS04 · 2H20，18. 2g K2SO4,14. 9g MgSO4 · 7H20，4. 13g KOH，40g 甘油溶解于去離子水中，定容至IL ；高壓滅菌后，pH為1 1. 5，溫度降到30°C后，用30% NH4OH調(diào)pH至5. 0。MGY培養(yǎng)基按現(xiàn)有常規(guī)方法配制。轉(zhuǎn)速級(jí)聯(lián)到溶氧控制上，機(jī)器根據(jù)溶氧的高低自動(dòng)調(diào)整轉(zhuǎn)速，溶氧升高超過設(shè)定值，則轉(zhuǎn)速下降，反之升高。所述的“根據(jù)發(fā)酵情況適度增加甲醇補(bǔ)量”是指以3. 5mL/L · !甲醇補(bǔ)料速度調(diào)節(jié)甲醇補(bǔ)料泵泵速，此階段持續(xù)2 證，使酵母適應(yīng)甲醇。酵母適應(yīng)甲醇后DO(溶解氧)會(huì)升高，提高補(bǔ)料速度到5mL/L · h，持續(xù)池，進(jìn)行DO升高操作，DO升高操作在30s或更短的時(shí)間內(nèi)完成，補(bǔ)料速度提高lmL/L-h, Ih后進(jìn)行DO升高操作，如果升高操作時(shí)間在30s內(nèi)，則補(bǔ)料速度再繼續(xù)提高lmL/L · h，如果升高操作時(shí)間超過35s，則補(bǔ)料速度維持不變，直至升高操作時(shí)間少于30s再繼續(xù)提高補(bǔ)料速度。以后一個(gè)小時(shí)左右進(jìn)行一次補(bǔ)料速度的調(diào)整， 直至補(bǔ)料速度達(dá)到12mL/L *h。如果DO升高操作時(shí)間超過lmin，則減少補(bǔ)料速度1 2mL/ L-h0 DO升高操作關(guān)閉補(bǔ)料泵，DO升高，當(dāng)升高超過設(shè)定值的10%，重新開啟補(bǔ)料泵。對(duì)工程菌進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，Gp90蛋白表達(dá)量達(dá)到37;3mg/L的水平。經(jīng) SDS-PAGE及Wfestern blot檢測(cè)證明表達(dá)的重組蛋白具有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和抗原性。本實(shí)驗(yàn)將重組蛋白制成重組抗原疫苗，免疫SPF雞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病重組抗原疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，使免疫雞獲得抵抗 REV攻擊的保護(hù)，并可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。此疫苗的研制成功將會(huì)加速新型基因工程疫苗替代傳統(tǒng)疫苗的步伐，并將為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病的防治帶來新的技術(shù)手段。


圖1為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90基因與載體構(gòu)建圖譜；圖2為pMD18T-Env載體構(gòu)建酶切鑒定結(jié)果；M :lkb DNA Marker (Fermentas) ；1 :pMD18T_env 酶切結(jié)果；2 :pMD18T 載體酶切結(jié)果；圖3為REV Gp90基因擴(kuò)增圖；M :2000 DNA Marker ；1 :Gp90 基因；2 陰性對(duì)照?qǐng)D4為pPIC9k_Gp90酶切鑒定結(jié)果；M :DL15000 Marker ；1 :pPIC9k_Gp90 ；2 :Gp90 基因圖5為酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定；M :2000 DNA markers ；1 陰性對(duì)照；2 陽性對(duì)照?qǐng)D6為表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析；M 蛋白分子量 Marker ；1 :SMD1168/pPIC9k 表達(dá)對(duì)照；2 :SMD1168/REV-Gp90 搖瓶誘導(dǎo)上清；3 :SMD1168/REV_Gp90 發(fā)酵上清圖7為表達(dá)產(chǎn)物的Wfestern blot分析；M 蛋白分子量 Marker ；1 :SMD1168/pPIC9k 對(duì)照；2-3 :SMD1168/pPIC9k-Gp90 表達(dá)蛋白上清圖8為抗體消長(zhǎng)曲線；圖9為抗體陽性率；圖 10 為 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果；圖11為免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1重組酵母工程菌株的構(gòu)建方法1材料和方法1.1質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞pMD18T-Env重組質(zhì)粒、REV Gp90單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10F，由本實(shí)驗(yàn)室制作。畢赤酵母菌種SMDl 168和載體pPIC9K購自hvitrogen公司。 HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體、FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗購買自Sigma公司。1.2試驗(yàn)試劑ExTaq 聚合酶，限制性內(nèi)切酶 SaLI、SnaBI、NotI、^icLriTaq 酶，Primestar HS DNA Polymerase, DNA Marker, T4 DNA連接酶，pMD18T載體均購自大連寶生物工程有限公司，核酸凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，組織DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司。其他試劑為分析純。1. 3儀器設(shè)備低溫高速離心機(jī)CS-15RCentrifuge (BECKMAN)、PCR 儀(Takara PCR Thermal cycler)、2301 型電泳儀(KLB)、Imagemaster R VDS 凝膠掃描儀(Pharmacia Biotech)、 倒置顯微鏡(Nikon TS100)、熒光顯微鏡(LEICAHC)、酶標(biāo)儀 Model_680 (BIO-RAD)、二氧化碳培養(yǎng)箱(FORMA SCIENTIFIC)、生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)、 BIO-RAD (Serial NO. 4IlBR 3336)電轉(zhuǎn)儀、空氣浴振蕩器HZQ-C (哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)。1.4REV Gp90基因的克隆與表達(dá)1. 4. 1重組質(zhì)粒pMD18T_Env的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成特異性擴(kuò)增Env基因的引物引物EnvF :5’ -ACGGAATTCATGGACTGTCTCACCAACCTC-3’EnvR :5’ -TTTGTCGACTCATTGACCTAGGGTATCCAT-3，構(gòu)建方法 取CEF原代細(xì)胞接毒REV-HLJR0901，7天后收毒，利用組織DNA提取試劑盒 (Omega)提取基因組DNA。以該基因組DNA樣品為模板，以envF和envR為上下游引物進(jìn)行常規(guī)PCR，擴(kuò)增得到env基因。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，其中含5yL 5XPS Buffer、2yL dNTP (2. 5mmol/L)、envF 和 envR 各 1 μ L (10pmol/L)、Prime Star HS lu, DNA 模板 1 μ L, 用 ddH20 補(bǔ)足 25 μ L。反應(yīng)條件:95 V 5min ；95 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 2min，35 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin0 1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)結(jié)束后，直接向上述反應(yīng)體系中加入IyLrTaq酶，72°C IOmin加入polyA。用Axgen試劑盒回收PCR產(chǎn)物。取PCR產(chǎn)物連接PMD18T載體(TAKARA)，連接體系如下5yL Solution 1,4μ L PCR回收產(chǎn)物，1 μ L PMD18T載體，于16°C連接過夜。常法轉(zhuǎn)化ToplOF，感受態(tài)細(xì)胞，37°C溫箱培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落，37°C搖床培養(yǎng)10-1 后保存菌種，提取質(zhì)粒，用EcoRl和Mll進(jìn)行酶切鑒定，并測(cè)序驗(yàn)證。1.4. 2Gp90基因引物設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)定的REV/HLJR0901株的Gp90基因序列，利用01igo6. 0分子生物學(xué)軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，同時(shí)在引物中引入相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)，引物由北京英俊生物有限公司合成，引物序列如下所示
Gp90F :5’ AGCTACGTAATGGACTGTCTCACC 3’Gp90R :5’ AGAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCTTATGACGCCCAGC3'1. 4. 3Gp90基因各片段的獲得以重組質(zhì)粒pMD18T-enV為模板，用Gp90特異性引物擴(kuò)增Gp90基因。反應(yīng)體系為 ddH20 33. 2 μ L.5XPS Buffer 10μ L.dNTP Mixture 4 μ L、上、下游引物各 1 μ L、Primestar HS DNA Polymerase 0. 5 μ L、模板 0· 3 μ L。PCR 反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1.5min,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠試劑盒回收 PCR產(chǎn)物，按說明書操作。1.4.4表達(dá)載體的構(gòu)建將回收的PCR產(chǎn)物與載體PPIC9K分別用SnaBI和NotI雙酶切，回收，凝膠回收操作按試劑盒說明書進(jìn)行。將載體與外源片段以摩爾比1 3的比例混合，用T4DNA連接酶于22°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化E. coli DH10F，感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，以SnaBI和NotI雙酶切及PCR進(jìn)行鑒定，并測(cè)序確證(北京英俊)，鑒定陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒pPIC9k-Gp90，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90基因與載體構(gòu)建圖譜如圖1所示。1. 4. 5酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化用限制性內(nèi)切酶McI對(duì)制備的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，酚-氯仿-異戊醇抽提，乙醇沉淀回收后，與畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞混合，用BIO-RAD (Serial NO. 41IBR 3336)電轉(zhuǎn)儀在參數(shù)為2. 0kV、25yF、200Q條件下進(jìn)行電擊，立即加入Iml預(yù)冷的lmol/L 山梨醇，溫浴后將內(nèi)容物涂布于含100μβ/πιΜ418抗性的YPDS平板，30°C培養(yǎng)3_7d。1. 4. 6重組酵母菌株的PCR篩選1. 4. 6. 1重組酵母菌PCR鑒定引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)目的基因插入兩側(cè)的表達(dá)載體核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，并由上海博亞生物技術(shù)公司合成。引物序列為5， AOXl 弓丨物5， -gactggttccaattgagaagc-3，3， AOXl 弓丨物5， -gcaaatggcattctgacatcc-3，1.4. 6.2重組酵母基因組DNA的提取取少量轉(zhuǎn)化菌單個(gè)菌落培養(yǎng)物置Ep管中，加100 μ L滅菌水，100°C煮沸IOmin以消解酵母菌細(xì)胞壁，液氮冰凍30min，100°C煮沸l(wèi)Omin，12000r/min離心lOmin，取上清液， 即為重組酵母基因組DNA。1. 4. 6. 3PCR 擴(kuò)增鑒定以重組酵母基因組DNA為模板，用特異引物對(duì)整合到巴斯德畢赤酵母SMD1168染色體DNA中的Gp90基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10 XPCR Buffer 5. 0 μ L、25mmol/LMgCl2 3. 0 μ L、5，A0X1 引物 QOpmol/ μ L)0. 5μ L、3，AOXl 引物(20pmol/μ L) 0. 5 μ L.Tap 酶 0. 5 μ L、dNTP (10mmol/L) 1· 0μ L、基因組DNA模板5. 0 μ L，以滅菌水補(bǔ)體積至50 μ L。擴(kuò)增反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 0. 5min、 55°C 0. 5min、72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin01. 4. 7重組酵母菌株的小量誘導(dǎo)表達(dá)將PCR鑒定陽性的酵母轉(zhuǎn)化子接種于50ml BMGY培養(yǎng)基中，30°C 300rpm培養(yǎng)至 OD600為2-6時(shí)，1500g離心5min收集菌體，換10ml BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5d，每隔24h取樣并同時(shí)加入0.5%的甲醇。甲醇誘導(dǎo)5d后收集上清，保存于-70°C備檢，表達(dá)的重組蛋白其序列如SEQ ID NO. 2所示。1. 4. 8重組酵母菌株的發(fā)酵取保存菌種Iml接種于50mlMGY培養(yǎng)基中，30°C 300rpm培養(yǎng)至OD6tltl為2_6時(shí)，接入發(fā)酵罐中，用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。維持溶氧40%，溫度30°C，pH6. 0，培養(yǎng)20-24h， 待溶氧升高，轉(zhuǎn)速下降時(shí)補(bǔ)加50%甘油，補(bǔ)加速度為15ml/L*h，補(bǔ)加4個(gè)小時(shí)，隨后進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)期，開始甲醇補(bǔ)量為3.5ml/L*h，此階段持續(xù)2 證，使酵母適應(yīng)甲醇。酵母適應(yīng)甲醇后DO會(huì)升高，提高補(bǔ)料速度到5mL/L · h，持續(xù)2h，進(jìn)行DO升高操作，DO升高操作在30s 或更短的時(shí)間內(nèi)完成，補(bǔ)料速度提高lmL/L · h，Ih后進(jìn)行DO升高操作，如果升高操作時(shí)間在30s內(nèi)，則補(bǔ)料速度再繼續(xù)提高lmL/L · h，如果升高操作時(shí)間超過35s，則補(bǔ)料速度維持不變，直至升高操作時(shí)間少于30s再繼續(xù)提高補(bǔ)料速度。以后一個(gè)小時(shí)左右進(jìn)行一次補(bǔ)料速度的調(diào)整，直至補(bǔ)料速度達(dá)到12mL/L · h。如果DO升高操作時(shí)間超過lmin，則減少補(bǔ)料速度1 2mL/L · h0隨時(shí)觀察罐內(nèi)泡沫情況，泡沫過多需滴加無菌的消泡劑。發(fā)酵72后收獲上清，進(jìn)行SDS-PAGE和Wfestern blot分析，并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。1.4.9重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)取等體積誘導(dǎo)上清與2X上樣緩沖液混合，100°C煮沸l(wèi)Omin，取10μ L處理好的蛋白樣品用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。1. 4. 10 重組蛋白的 Westernblot 檢測(cè)目的蛋白電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上，將膜封閉，加入1 500稀釋的REV Gp90單克隆抗體，輕輕搖動(dòng)混勻，于37°C作用Ih后，洗滌NC膜，將洗滌后的膜置于適量 1 5000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG為二抗液中，室溫作用37°C作用45min，洗滌NC膜3 次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。1.4. 11蛋白濃度的測(cè)定總蛋白濃度以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bradford法進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行薄層掃描，確定目的蛋白含量，進(jìn)而換算得到目的蛋白濃度。1.5重組蛋白免疫原性的檢測(cè)1. 5. 1免疫動(dòng)物疫苗的制備將發(fā)酵上清用PBS(PH7.4)分別稀釋至5 μ g/0. !3ml、10 μ g/0. 3ml、 20μ g/0. ;Μ1、40μ g/0. ;Μ1、80μ g/0. :3ml，與等體積法國佐劑((ISA50 V2)購自 SEPPIC 公司)乳化。取3周齡SPF雞60只，分6組，每組10只。1、2、3、4、5組為表達(dá)蛋白免疫組1組免疫劑量為5 μ g/0. 3ml/只，2組免疫劑量為10 μ g/0. 3ml/只，3組免疫劑量為20 μ g/0. 3ml/ 只；4組免疫劑量為40 μ g/0. 3ml/只；5組免疫劑量為80 μ g/0. 3ml/只；6組為非免疫對(duì)照組，免疫途徑均為肌肉注射，一免后3w進(jìn)行二免。1. 5. 2REV抗體檢測(cè)及攻毒試驗(yàn)各組免疫后每周采血，用REV抗體檢測(cè)試劑盒(IDEXX公司)檢測(cè)抗體滴度，并于二免后3周各組取5只以IXIO5TCID5ci劑量攻擊REV/HLJR0901病毒(REV/HLJR0901 病毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC 5015)，攻毒后觀察7-10天，剖殺，采集血液、肝臟、脾臟、法氏囊及胸腺，提取DNA，用 Real-time PCR方法檢測(cè)血液中的病毒載量，并用免疫組化試驗(yàn)對(duì)肝臟、脾臟、法氏囊及胸腺中的病毒含量進(jìn)行檢測(cè)。各組余下的5只仍每周定期采血至第22周，檢測(cè)抗體。試驗(yàn)在負(fù)壓隔離器(澳大利亞進(jìn)口)中進(jìn)行。2 結(jié)果2. lpMD18T-Env 載體構(gòu)建結(jié)果挑取單個(gè)菌落，37°C搖床培養(yǎng)10-1 后保存菌種，提取質(zhì)粒，用EcoRl和Mll進(jìn)行酶切鑒定，并測(cè)序驗(yàn)證。酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。2. 2REV Gp90 基因的擴(kuò)增以pMDIST-env為模板，用Gp90特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得與預(yù)期大小一致的119 Ibp的DNA條帶，結(jié)果如圖3所示。2. 3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建PCR和雙酶切鑒定均顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pPirak-Gp90構(gòu)建正確，測(cè)序結(jié)果證實(shí)目的片段Gp90及閱讀框均正確。酶切鑒定結(jié)果如圖4所示。2. 4重組酵母菌株的PCR篩選以His+轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，用酵母5，A0X1和3，A0X1通用引物PCR驗(yàn)證目的DNA與酵母基因組整合情況，結(jié)果有11個(gè)轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出1. 7kb的片段，說明重組菌株中整合了 Rev Gp90基因，如圖5所示。陰性轉(zhuǎn)化子僅可以擴(kuò)增得到AOXl基因O. 21Λ)； 陽性轉(zhuǎn)化子可以擴(kuò)增得到整合的Gp90(l. 7kb)和AOXl基因(2. 2kb)。2. 5重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)2. 5. 1表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表達(dá)上清經(jīng)10 % SDS-PAGE分析，由圖6所示，在90kDa處由明顯目的蛋白條帶，而陰性對(duì)照在此處沒有條帶，證明Gp90蛋白得到分泌表達(dá)。蛋白濃度測(cè)定表明，Gp90小量誘導(dǎo)表達(dá)量為65mg/L，發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)量為37;3mg/L。2. 4. 2 表達(dá)產(chǎn)物的 Western blot 分析以制備的REV Gp90為一抗，對(duì)表達(dá)的REV Gp90蛋白進(jìn)行^festern blot (圖7所示)分析，結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物可以與Gp90單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，表明所表達(dá)的Gp90蛋白具有良好的反應(yīng)活性。2. 5表達(dá)產(chǎn)物免疫原性的檢測(cè)2. 5.1抗體滴度的檢測(cè)SPF雞于3周齡一免，一免后3周二免，免疫劑量分為5、10、20、40、80 μ g/只，免疫后采血檢測(cè)抗體滴度。由抗體消長(zhǎng)曲線可知，免疫后1-5周為抗體滴度增長(zhǎng)期，二免后2 周抗體滴度快速升高，并于2-3周達(dá)到最高，分別為5 μ g :2186, IOyg :2776，20 μ g :3851 ； 40 μ g 4557 ；80μ g :5435，陽轉(zhuǎn)率為80 %, 80 %, 100 %, 100 %, 100 % 5-8 周為高抗體滴度維持期，持續(xù)約4周，然后開始下降；9-12周為抗體滴度下降期，3-4周后下降趨勢(shì)結(jié)束， 抗體滴度進(jìn)入維持階段；13-18周為平臺(tái)期，各劑量組抗體滴度維持在5μ g :1600,10μ g 2300，20 μ g 2800 ；40 μ g :3500 ；80 μ g :4200,陽轉(zhuǎn)率為50 %, 60 %, 80 %, 80 %, 80 % 抗體消長(zhǎng)曲線和抗體陽性率如圖8、9所示。2. 5. 2攻毒保護(hù)試驗(yàn)
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二免后3周，對(duì)各試驗(yàn)組雞腹腔注射REV(HLJR0901株)1 X IO5TCID5tl，采集攻毒后 7d、IOd抗凝血，提取血液DNA，用Real time PCR檢測(cè)血液中的病毒含量；于攻毒后IOd剖殺，制作病理切片，利用免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)體內(nèi)臟器中的病毒含量。Real-time PCR結(jié)果表明(圖10所示)，與未免疫組(6. 89X 106copies/ml)相比，5yg和IOyg免疫組血液中病毒載量有所降低，分別為7. 21X104copies/ml血液和6. 49 X 102copies/ml血液，但仍可檢出；而20、40、80μβ免疫組在血液中未檢到病毒。免疫組化試驗(yàn)表明，未免疫組攻毒后法氏囊、肝臟、脾臟、胸腺中均有大量陽性信號(hào)；5-10 μ g免疫組僅有少量陽性信號(hào)；20-80 μ g免疫組未見明顯陽性信號(hào)。其結(jié)果與病毒載量檢測(cè)結(jié)果相符，結(jié)果如圖11所示。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌株，其特征在于所述菌株為重組巴斯德畢赤酵母(Pichia.pastoris) SMDl 168工程菌株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC 5046。
2.構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步驟(1)Gp90基因的擴(kuò)增以禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV/HLJR0901的基因組為模板，GenBank登錄號(hào)為 GQ415646，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出Gp90基因序列，如SEQ IDNO 1所示；所述的 HLJR0901株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為 CGMCC 5015；(2)將擴(kuò)增出的片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPIC9k-Gp90， 電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選，PCR鑒定，得到重組酵母菌株；(3)對(duì)重組酵母菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的高表達(dá)菌株，并將其馴化為工程菌株，即得。
3.權(quán)利要求1所述的重組酵母工程菌株在表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90重組蛋白中的應(yīng)用。
4.由權(quán)利要求1所述的重組酵母基因工程菌株表達(dá)的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒 Gp90重組蛋白。
5.權(quán)利要求4所述的重組蛋白在制備預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病疫苗藥物中的應(yīng)用。
6.一種預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病的重組抗原疫苗，其特征在于包含有效劑量的權(quán)利要求4所述的重組蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求6所述的重組抗原疫苗在制備預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病藥物中的應(yīng)用。
8.一種使用權(quán)利要求1所述的重組酵母工程菌株發(fā)酵的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取權(quán)利要求1所述的重組酵母工程菌株Irnl接種于50mlMGY培養(yǎng)基中， 30 0C 300rpm培養(yǎng)至0D_為2_6時(shí)，接入發(fā)酵罐中，用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)轉(zhuǎn)速級(jí)聯(lián)到溶氧控制上，維持溶氧40%，溫度30°C，pH6.0，培養(yǎng)20-24h，待溶氧升高，轉(zhuǎn)速下降時(shí)補(bǔ)加50%甘油，補(bǔ)加速度為15ml/L*h，補(bǔ)加4個(gè)小時(shí)，隨后進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)期， 開始甲醇補(bǔ)量為3. 5ml/L · h，此階段持續(xù)2 5h，隨后根據(jù)發(fā)酵情況適度增加甲醇補(bǔ)量；(3)發(fā)酵72小時(shí)后收獲上清，進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot分析，并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。
9.如權(quán)利要求8所述的重組酵母工程菌株發(fā)酵的方法，其特征在于所述的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基按照以下方法配制26. 7mL 85% H3P04,0. 93g CaS04 · 2H20，18. 2g K2SO4,14. 9g MgSO4 · 7H20，4. 13g K0H，40g甘油溶解于去離子水中，定容至IL ；高壓滅菌后，pH為1 1. 5，溫度降到30°C后，用30% NH4OH調(diào)pH至5. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明的重組酵母工程菌株，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC 5046。對(duì)工程菌進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)，Gp90蛋白表達(dá)量達(dá)到373mg/L的水平。經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)證明表達(dá)的重組蛋白具有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和抗原性。將重組蛋白制成重組抗原疫苗，免疫SPF雞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該重組抗原疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，使免疫雞獲得抗REV攻擊的保護(hù)，并可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。
文檔編號(hào)C07K14/15GK102321547SQ201110245478
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者王永強(qiáng), 王笑梅, 祁小樂, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龍 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所