專利名稱：截短的IP₃受體V33K-NT及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向藥物功效預(yù)測方法的技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及截短的IP3受體 V33K-NT及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3受體)是調(diào)節(jié)Ca2+釋放的配體門控通道。該受體可以結(jié)合IP3后被激活。IP3受體是四聚體。每個(gè)亞單位包括2700個(gè)殘基，每個(gè)亞基N末端 (NT, 1-604)附近具有1&結(jié)合中心(IBC，2M-604)，C-末端具有6個(gè)跨膜蛋白。最末端的一對跨膜區(qū)域，連同其四個(gè)亞單位的每個(gè)轉(zhuǎn)彎環(huán)區(qū)，構(gòu)成孔隙結(jié)構(gòu)。當(dāng)3 4個(gè)部位被IP3 占據(jù)時(shí)，IP3受體復(fù)合物構(gòu)象發(fā)生改變，打開孔隙結(jié)構(gòu)，儲存的Ca2+隨即釋放。1擬6年P(guān)errin首次在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現(xiàn)象。以一束單一波長的偏振光照射溶液中的熒光物質(zhì)，后者可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光。如果被激發(fā)的熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，該物質(zhì)仍將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運(yùn)動狀態(tài)，該物質(zhì)發(fā)出的偏振光將區(qū)別于原有激發(fā)光的偏振特性，也就是所謂熒光去偏振現(xiàn)象。近年來，以這種物理學(xué)現(xiàn)象為基礎(chǔ)的技術(shù)正在生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域中扮演著越來越重要的角色。本申請人將熒光偏振現(xiàn)象結(jié)合現(xiàn)代物理中的熱動力學(xué)應(yīng)用于藥學(xué)研究當(dāng)中，發(fā)明了一套高通效的藥物功效預(yù)測技術(shù)。該套藥物功效預(yù)測技術(shù)需要一種截短的IP3 受體，這種受體仍然具有結(jié)合IP3的功能，并且適合于IP3受體靶標(biāo)藥物的熒光偏振分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供截短的IP3受體V3;3K-NT，該受體的33位氨基酸發(fā)生突變，但是仍然具有結(jié)合IP3的功能，并且適合于IP3受體靶標(biāo)藥物的熒光偏振分析。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是截短的IP3受體V3I-NT，為IP3Rl 的N末端1-604殘基的突變體，所述突變體的序列具有序列表中SEQ ID N0:3所述的氨基酸序列，其33位氨基酸是由纈氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述截?cái)嗟腎P3受體肽段用于IP3R靶向藥物的篩選。進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述截短的IP3受體用于IP3R靶向藥物的篩選時(shí)，包括以下步驟
所述截短的IP3受體用于IP3R靶向藥物的篩選時(shí)，包括以下步驟
A.提供熒光標(biāo)記配體、作為競爭配體的待測化合物、以及3種包含IP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的受體多肽；分別為受體IBC、受體NT和所述截短的IP3受體V3I-NT ；所述受體IBC是位于 IP3R受體2M-604位的IP3結(jié)合中心，所述受體NT是野生型的位于IP3R受體1-604位的 IP3受體N末端片段；
B.競爭結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)將所述步驟A中的熒光標(biāo)記配體、待測化合物、至少一種受體多肽置于容器內(nèi)混合；
C.通過熒光偏振技術(shù)測定所述步驟B的容器在不同溫度下對應(yīng)的熒光各向異性度A，計(jì)算對應(yīng)溫度下待測化合物與相應(yīng)受體多肽競爭結(jié)合時(shí)的平衡解離常數(shù)忍值，根據(jù)平衡解離常數(shù)忍值計(jì)算得到相應(yīng)溫度下的焓變ΔΗ，每種受體的焓變ΔΗ分別表示為ΔΗ ιβ。、ΔΗντ 禾口 Δ Hy33K ；
D.計(jì)算ΔΗ IBC與ΔHnt的差值，ΔΗ IBC與Δ Hnt的差值用Δ ( AHibc _ΝΤ)表示，Δ ( ΔΗ IBC_NT)的絕對值越小，則待測化合物的藥效越強(qiáng)；或者計(jì)算Δ Hv33k和Δ Hnt的差值，Δ Hv33k和 ΔHnt的差值用Δ (ΔΗν )表示，Δ (ΔΗν33Κ_ΝΤ)的絕對值越大，則待測化合物的藥效越強(qiáng)。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明首次測定了不同溫度下配體的解離平衡常數(shù)KD值，首次測定了不同溫度下配體結(jié)合的自由能變。(2)本發(fā)明與目前最精確的藥物功效預(yù)測技術(shù)相比，比如電生理技術(shù)(electro physiology)，核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance)等，它能更準(zhǔn)確的預(yù)測藥物效能(efficacy)，因?yàn)樗ㄟ^熱動力學(xué)可以把藥物對靶點(diǎn)的作用進(jìn)行精確的量化。從熱動力學(xué)的角度來說，藥物與靶點(diǎn)結(jié)合是兩種過程的推動結(jié)果，即熵(entropy，物質(zhì)混亂的程度)，和焓(enthalpy，物質(zhì)能量)。把熱動力學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合起來，則我們可以根據(jù)藥物與靶點(diǎn)結(jié)合的熵值和焓值來推測藥物與靶點(diǎn)結(jié)合后對其造成了多大的改變，從而預(yù)測該藥物對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生了多大的影響。更為重要的是，通過這一技術(shù)，我們可以把藥物對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的影響進(jìn)行量化，比較精確的預(yù)測出藥物的功效。通過對8種已知藥物的實(shí)驗(yàn)，并與電生理技術(shù)對比，證明了熒光偏振技術(shù)對藥物功效預(yù)測的準(zhǔn)確性。(3)本發(fā)明的第二個(gè)特點(diǎn)是它的微型實(shí)驗(yàn)性質(zhì)，本發(fā)明所需實(shí)驗(yàn)耗材的費(fèi)用只有其它傳統(tǒng)技術(shù)的一半。核磁共振技術(shù)需要大量高純度的靶點(diǎn)蛋白，而電生理技術(shù)由于成功率非常低，也需要非常多的帶有研究靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與其它實(shí)驗(yàn)試劑。而熒光偏振技術(shù)則不同，它對靶點(diǎn)蛋白的純度與數(shù)量的需求相當(dāng)小。通過應(yīng)用現(xiàn)代機(jī)器人技術(shù)與高精度微量液體取樣技術(shù)，本申請人實(shí)現(xiàn)了該技術(shù)的微型實(shí)驗(yàn)性質(zhì)，大大降低了所需實(shí)驗(yàn)耗材，從而減小了新藥研發(fā)的費(fèi)用。(4)本發(fā)明的第三個(gè)特點(diǎn)是它的高通效，本發(fā)明技術(shù)能以較高的成功率同時(shí)預(yù)測上百種藥物的功效。傳統(tǒng)藥理研究中預(yù)測藥物功效的技術(shù)，如電生理技術(shù)(electro physiology)操作十分復(fù)雜，且失敗率非常高(98%)，因此對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求相當(dāng)高。一位擁有10年以上經(jīng)驗(yàn)的電生理博士后研究員，可能會花上2天的時(shí)間才能預(yù)測一種候選藥物的功效。對于核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance)，其耗費(fèi)的時(shí)間起碼在2天以上的時(shí)間。一個(gè)新藥研發(fā)項(xiàng)目最初的候選藥物通常超過10萬個(gè)，經(jīng)過初篩以后進(jìn)入藥學(xué)研究階段的藥物通常也超過1萬個(gè)。因此，如果單一藥物的預(yù)測時(shí)間都要幾天的時(shí)間，那么對于上萬種藥物都進(jìn)行精確預(yù)測所花費(fèi)的時(shí)間和費(fèi)用是非常高昂的?；跓晒馄窦夹g(shù)操作簡單的特點(diǎn)，本申請人通過結(jié)合現(xiàn)代機(jī)器人技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了該技術(shù)的高通效性， 使該技術(shù)能同時(shí)預(yù)測上百種藥物的功效。因此，本發(fā)明能大大縮減實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)省研發(fā)費(fèi)用。


圖1為Δ ( AHibc _m)值與藥效的關(guān)系圖。圖2為Δ ( Δ Hv33mt)值與藥效的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明裝置的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1 IP3Rl的N末端片段的表達(dá)和純化
本實(shí)施例IP3Rl的N末端片段是指具有IP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的IP3受體多肽片段，包括NT (殘基 1-604) ；IBC (殘基 224-604)。IP3Rl的N端片段的擴(kuò)增模板是缺失Sl剪切位點(diǎn)的IP3Rl全長基因，分別用兩對引物擴(kuò)增制備NT和IBC，基因定量時(shí)使用的參考基因?yàn)镮P3Rl全長(Si+) (GenBank登錄號GQ233032)。使用 QuickChange mutagensis kit 試劑盒(Stragene，La Jolla, CA)將 Sl剪切位點(diǎn)插入到IBC片段中。將PCR產(chǎn)物連接到pGEX-6p-2載體(GE Healthcare)，使用BamHI/XhoI的酶切，分別形成pGEX-NT和pGEX-IBC。形成的pGEX-NT和pGEX-IBC都包含一個(gè)N端GST標(biāo)簽，該N端GST標(biāo)簽是通過PreScission蛋白酶剪切位點(diǎn)與IP3R片段連接。得到的所有終產(chǎn)物序列通過DNA測序驗(yàn)證。在將GST標(biāo)簽切掉后，IP3R片段仍然保留 5個(gè)外源N端殘基。因?yàn)镮P3和NT、IBC的解離平衡常數(shù)相似，因此可以推斷這幾個(gè)外源殘基也不會影響IP3的結(jié)合。將這些產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到五coli AVB101, 1 ml培養(yǎng)物，37°C在LB培養(yǎng)基(含100 ug/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)12h，然后放置在22°C直到OD66tl達(dá)到1.5，添加誘導(dǎo)劑異丙基-β- D-半乳糖苷(IPTG)，15°C，誘導(dǎo)20h，使蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)后的菌液，離心(6000g，5min)收集菌體，固體重懸于Tris/EDTA培養(yǎng)基 (TEM; 50 mM Tris 和 1 m M EDTA, / H=8. 3)。在上述菌懸液中添加溶菌酶(100 ug/ml)和RNAase (10 ug/ml)后，冰上放置 30分鐘，然后裂解液超聲粉碎。離心(30，000g，60min), 50 ml上清液中添加0.5 ml glutathione Sepharose 4B beads (GST柱材料)20°C持續(xù)旋轉(zhuǎn)30分鐘使其結(jié)合。所有的 GST柱材料填充到PD-10空層析柱中，使用添加了 ImM 4°C二硫蘇糖醇(DTT)的無Ca 2+細(xì)胞類似液CLM培養(yǎng)液沖洗5次。GST柱材料然后在0.5 ml (1柱床體積)的CLM培養(yǎng)液中，和1 mM 二硫蘇糖醇和120單位/ml的GST標(biāo)簽蛋白PreScission蛋白酶，4°C，孵育12h。收集洗脫的不含 PreScission 蛋白酶的 IP3R 片段。蛋白濃度以 γ-球蛋白(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Hertfordshire, UK)作為對照標(biāo)準(zhǔn)，使用DC蛋白定量試劑盒(去垢劑兼容)
對蛋白進(jìn)行定量。蛋白樣品使用4-12% NuPage凝膠分離。樣品通過銀染技術(shù)或使用iBlot系統(tǒng)(Invitr0gen，CarlSbad，CA)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。分別使用對應(yīng)于殘基62 to 75 (Cardyetal. , 1997)或者326 to 343 (Si剪切位點(diǎn))多肽的抗血清，鑒定NT和IBC。實(shí)施例2 V33K NT的制備
V33K NT的制備通過QuickChange mutagensis kit試劑盒制備，所使用的引物為Pl 和P2，如表1所示。上述引物的具體序列與序列表中對應(yīng)關(guān)系如下表1所示 表權(quán)利要求
1.截短的IP3受體V33K-NT，為IP3Rl的N末端1_604殘基的突變體，所述突變體的序列具有序列表中SEQ ID N0:3所述的氨基酸序列，其特征在于，其33位氨基酸是由纈氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷?br> 2.如權(quán)利要求1所述的一種截短的IP3受體V33K-NT的應(yīng)用，其特征在于，所述截短的 IP3受體V33K-NT用于IP3R靶向藥物的篩選。
3.如權(quán)利要求1所述的一種截短的IP3受體V33K-NT的應(yīng)用，其特征在于，所述截短的 IP3受體V33K-NT用于IP3R靶向藥物的篩選時(shí)，包括以下步驟A.提供熒光標(biāo)記配體、作為競爭配體的待測化合物、以及3種包含IP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的受體多肽；分別為受體IBC、受體NT和所述截短的IP3受體V33K-NT ；所述受體IBC是位于 IP3R受體224-604位的IP3結(jié)合中心，所述受體NT是野生型的位于IP3R受體1-604位的 IP3受體N末端片段；B.競爭結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)將所述步驟A中的熒光標(biāo)記配體、待測化合物、至少一種受體多肽置于容器內(nèi)混合；C.通過熒光偏振技術(shù)測定所述步驟B的容器在不同溫度下對應(yīng)的熒光各向異性度A， 計(jì)算對應(yīng)溫度下待測化合物與相應(yīng)受體多肽競爭結(jié)合時(shí)的平衡解離常數(shù)忍值，根據(jù)平衡解離常數(shù)忍值計(jì)算得到相應(yīng)溫度下的焓變ΔΗ，每種受體的焓變ΔΗ分別表示為ΔΗ ιβ。、ΔΗντ 禾口 Δ Hy33K ；D.計(jì)算ΔΗIBC與ΔHnt的差值，ΔΗ IBC與Δ Hnt的差值用Δ ( AHibc _ΝΤ)表示，Δ ( ΔΗ IBC_NT)的絕對值越小，則待測化合物的藥效越強(qiáng)；或者計(jì)算Δ Hv33k和Δ Hnt的差值，Δ Hv33k和 ΔHnt的差值用Δ (ΔΗν )表示，Δ (ΔΗν33Κ_ΝΤ)的絕對值越大，則待測化合物的藥效越強(qiáng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種截短的IP3受體V33K-NT，為IP3R1的N末端1-604殘基的突變體，其33位氨基酸是由纈氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。該受體的33位氨基酸發(fā)生突變，但是仍然具有結(jié)合IP3的功能，并且適合于IP3受體靶標(biāo)藥物的熒光偏振分析。該受體在IP3受體靶向藥物功效預(yù)測中應(yīng)用時(shí)，將其與待測化合物和選定的熒光標(biāo)記配體三者混合，使待測化合物競爭性結(jié)合，通過測定結(jié)合過程中的焓變來預(yù)測待測化合物的藥物功效。
文檔編號C07K14/705GK102286094SQ201110242128
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者丁兆 申請人:四川匯宇制藥有限公司