專利名稱：一種從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗體分離純化領域，具體地，涉及一種從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法。
背景技術：
利用轉基因技術可以在哺乳動物乳腺生物反應器中高效地表達重組人蛋白。目前，世界上約有三十家公司致力于開發(fā)動物乳腺生物反應器表達的重組蛋白藥物，約有上百種重組蛋白正處于研發(fā)階段，包括越來越被重視的重組人抗體。然而，與其它重組蛋白相比，乳腺生物反應器表達的重組人抗體的純化有其特殊的困難。在轉基因哺乳動物乳液中， 除表達的重組人抗體之外，還有哺乳動物自身表達的抗體。哺乳動物自身表達的抗體作為一種外源蛋白，能夠導致部分人群的過敏甚至免疫混亂，因此需要嚴格限制其在純化所得人抗體蛋白產(chǎn)品中的含量。人抗體和動物抗體的結構相似，等電點、分子量等理化性質非常接近，導致兩者的分離難度極大，目前尚未看到分離人抗體和其它哺乳動物抗體的相關報道。免疫親和層析是一種利用分子與其對應的抗體之間特殊的、可逆性的親和結合作用而進行分離的層析技術。例如，將重組蛋白作為抗原可制備得到相應的抗體，將該抗體作為親和配基與適當基質偶聯(lián)形成親和介質，可以對分離物料中的目標蛋白質進行分離純化，該技術具有高效、快速、方便等優(yōu)點?？贵w可變區(qū)(Fab)片斷作為抗體的功能區(qū)域，可以單獨作為親和配基使用，同樣可以高效、快速地純化目標蛋白質。利用人抗體作為抗原，利用動物雜交瘤細胞技術可以制備針對人抗體種屬特征區(qū)域的單克隆抗抗體，并可以采用相關技術制備得到抗抗體的可變區(qū)片斷。由于人抗體和抗抗體的結合部位位于人抗體的恒定區(qū)，與重組人抗體的可變區(qū)無關，與人抗體針對的抗原種類無關，因此抗抗體或其可變區(qū)片斷可以有效地結合所有人抗體，包括重組全基因人抗體、嵌合抗體以及人源化抗體。由于抗抗體針對表位的是人抗體種屬特征區(qū)域，因此不會與其它任何哺乳動物的抗體發(fā)生結合，可以有效地分離乳腺生物反應器表達的重組人抗體以及相應的哺乳動物抗體；由于不同動物來源的抗抗體均可以有效地結合人抗體，因此不同動物來源的針對人抗體種屬特征區(qū)域的單克隆抗抗體或其可變區(qū)片斷均可用于偶聯(lián)制備親和介質。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法。為實現(xiàn)以上目的，根據(jù)本發(fā)明的從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法包括如下步驟(1)將乳腺生物反應器所產(chǎn)轉基因動物乳液進行脫脂預處理，獲得脫脂乳；(2)將所得脫脂乳進行去除酪蛋白處理，獲得含目標抗體的乳清液；(3)將所得乳清液進行免疫親和層析，從洗脫峰中獲得目標抗體。
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根據(jù)本發(fā)明的從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法，其中，所述的轉基因動物乳液為不同轉基因哺乳動物的乳液，優(yōu)選為牛乳；所述的重組人抗體優(yōu)選為重組抗⑶20人單克隆抗體、重組抗⑶25人單克隆抗體、重組抗乳腺癌人單克隆抗體BG6等，但本發(fā)明的保護不局限于此。根據(jù)本發(fā)明的從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法，其中，為了去除轉基因哺乳動物乳液原料中的脂類物質，避免其在后續(xù)純化步驟中對層析介質或膜造成污染，需要對乳液進行脫脂處理，所述步驟(1)脫脂預處理方法為座式離心或碟式離心，其中，對于座式離心法，室溫下10，OOOg離心30分鐘使原料分層并去除上層脂類，收集下層液體即脫脂乳；對于碟式離心法，將乳液原料加溫到48°C進料到碟式離心機中，3000g離心分離得到脫脂乳，其中，座式離心或碟式離心脫脂均可以去除原料中95%以上的脂類。根據(jù)本發(fā)明的從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法，其中，由于動物乳液原料中的酪蛋白以粒徑為30 300nm的膠束顆粒形式存在，容易在后續(xù)層析純化步驟中堵塞介質孔道，或在后續(xù)超濾步驟中堵塞超濾膜孔從而造成嚴重的污染，因此需要予以去除，所述步驟( 去除酪蛋白方法為酸性沉淀或鈣鹽沉淀或凝乳酶處理或超濾，具體方法為酸性沉淀法，在室溫下將步驟(1)所得脫脂乳調節(jié)pH到4. 0 5. 0，優(yōu)選pH值為 4. 5 4. 8，靜置15分鐘后離心收集上清液，得到乳清液；或者，鈣鹽沉淀法，在室溫下向步驟(1)所得脫脂乳中添加0. 1 0. 5M鈣鹽，靜置 15分鐘后離心收集上清液，得到乳清液；或者，凝乳酶法，室溫或37°C向步驟(1)所得脫脂乳中添加0.5% 1.5%的凝乳酶，靜置15分鐘后離心收集上清液，得到乳清液；其中，在上述方法中，酪蛋白去除效率同離心過程中采取的離心方式密切相關，采用座式離心10，OOOg離心30分鐘可以去除99%以上的酪蛋白顆粒，采取管式離心10，OOOg 離心10分鐘可以去除90%以上的酪蛋白顆粒；或者，超濾法，調節(jié)步驟⑴所得脫脂乳pH值到5.0 10.0，優(yōu)選pH值為6.0 8. 0，優(yōu)選采用截留分子量200 1000KD的超濾膜超濾，收集濾出液，得到乳清液，其中，超濾膜截留分子量越小，去除酪蛋白效率越高，但目標蛋白回收率較低且操作速度較慢。根據(jù)本發(fā)明的從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法，其中，為了去除步驟( 所得乳清液中的乳清蛋白，主要包括乳清白蛋白和乳球蛋白等雜質，從而減輕后續(xù)免疫親和層析的分離壓力，可以優(yōu)選對乳清液進行粗分離處理，具體處理方法為超濾或疏水層析或離子交換層析或親和層析，具體方法為超濾，因為同乳清蛋白雜質相比，目標抗體的分子量較大(150KD)，所以可以采用截留分子量合適的超濾膜進行分離，為了保護目標蛋白活性，操作PH值應接近中性，其方法為將步驟(2)所得乳清液調節(jié)pH值到5.0 10.0，優(yōu)選pH值為6.0 8.0，優(yōu)選采用截留分子量30 100KD的超濾膜超濾，收集濃縮液，其中，超濾膜截留分子量越大，去除雜質效率越高且單元操作的速度較快，但目標蛋白回收率較低；或者，疏水層析，同乳清蛋白雜質相比，重組人抗體的疏水性較強，因此可以采用疏水層析進行分離，其方法為室溫加入硫酸銨粉末使步驟( 所得乳清液硫酸銨濃度為 0. 5 1. 5M，進樣到疏水層析柱中，使用低鹽緩沖液洗脫并收集含有重組人抗體的洗脫組分，獲得粗分離樣品，其中，疏水層析進樣鹽濃度越高，目標抗體回收率越高，但是純化倍數(shù)會逐漸降低；或者，離子交換層析，重組人抗體與乳清蛋白雜質的表面電勢存在顯著差異，因此可以用高載量的離子交換層析進行分離，其方法為室溫調節(jié)步驟( 所得乳清液PH為 5. 0 10. 0，進樣到離子交換層析柱中，使用高鹽緩沖液洗脫并收集含有重組人抗體的洗脫組分，獲得粗分離樣品；或者，親和層析，以蛋白A或蛋白G為親和配基的親和層析可以高效吸附抗體(包括重組人抗體和動物抗體)，從而有效地分離乳清蛋白雜質與抗體，其方法為室溫調節(jié)步驟(2)所得乳清液PH為5.0 10.0，進樣到親和層析柱中，使用高鹽緩沖液或低pH值緩沖液洗脫并收集含有重組人抗體的洗脫組分，獲得粗分離樣品。根據(jù)本發(fā)明的從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法，其中，所述步驟 (3)免疫親和層析，具體方法為將步驟⑵所得乳清液或經(jīng)粗分離處理的乳清液調節(jié)pH到5. 0 10. 0，優(yōu)選pH 值為6. 0 8. 0。根據(jù)重組人抗體的類型選擇合適的免疫親和層析介質、層析柱和進樣速度，將步驟(2)所得乳清液或經(jīng)粗分離處理的乳清液進樣到用平衡緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，層析過程使用^Onm紫外吸收波長進行蛋白檢測，進樣的乳清液體積為0. 5 10. 0倍層析柱體積，優(yōu)選為1. 0 3. 0倍層析柱體積；乳清液中重組人抗體同免疫親和介質的配基相結合保留在柱中，而轉基因動物抗體則無法保留，全部樣品進樣完畢后，用平衡緩沖液沖洗免疫親和層析柱中未保留的蛋白，直到紫外吸收波長回到基線，再用洗脫緩沖液洗脫，洗脫方式可為一步洗脫、階段洗脫、線形洗脫，收集洗脫液以得到重組人抗體蛋白的初步純化產(chǎn)品或純品。其中，所述免疫親和層析中，免疫親和層析介質采用瓊脂糖材料為基質，所述的配基可為?？谷丝箍贵w，羊抗人抗抗體，兔抗人抗抗體，豬抗人抗抗體，鼠抗人抗抗體，狗抗人抗抗體，?？谷丝箍贵w可變區(qū)片斷，羊抗人抗抗體可變區(qū)片斷，兔抗人抗抗體可變區(qū)片斷， 豬抗人抗抗體可變區(qū)片斷，鼠抗人抗抗體可變區(qū)片斷，狗抗人抗抗體可變區(qū)片斷，優(yōu)選為?？谷丝箍贵w；其中，所述免疫親和層析中，緩沖液體系可采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液；平衡緩沖液為 20-100mM, pH 6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液；洗脫緩沖液可采用鹽酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液、乙酸溶液，優(yōu)選濃度為0. 2 1. OM的乙酸溶液；其中，所述免疫親和層析中，必須選擇與重組人抗體種屬特征區(qū)域有免疫親和作用的動物單克隆抗體為配基的介質進行分離，才能夠高效分離重組人抗體和動物抗體。在免疫親和層析中，必須嚴格限制進樣量，使進樣中重組人抗體量小于親和層析柱中動物單克隆抗體量，才能夠防止免疫親和層析介質被飽和后重組人抗體發(fā)生穿透，影響重組人抗體在免疫親和層析過程中的回收率。根據(jù)本發(fā)明的從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法，其中，為了去除步驟C3)免疫親和層析所得穿透峰中的乳清蛋白雜質以及殘留的內(nèi)毒素等非蛋白類雜質獲得高純度的人重組抗體產(chǎn)品，可以對穿透峰進行精分離處理，方法為疏水層析或離子交換層析或凝膠過濾層析，具體方法為
疏水層析，同乳清蛋白雜質以及內(nèi)毒素雜質相比，重組人抗體的疏水性不同，因此可以采用疏水層析進行分離，其方法為室溫加入硫酸銨粉末使得步驟C3)所得穿透峰硫酸銨濃度為0. 5 1. 5M，進樣到疏水層析柱中，使用低鹽緩沖液洗脫并收集含有重組人抗體的洗脫組分，其中，疏水層析進樣鹽濃度越高，目標抗體回收率越高，但是純化倍數(shù)會逐漸降低；或者，離子交換層析，重組人抗體與乳清蛋白雜質、內(nèi)毒素的表面電勢存在顯著差異，因此可以用高載量的離子交換層析進行分離，其方法為室溫調節(jié)步驟C3)所得穿透峰 pH為5. 0 10. 0，使用高鹽緩沖液穿透并收集含有重組人抗體的洗脫組分；或者，凝膠過濾層析，因為目標抗體的分子量與內(nèi)毒素雜質和乳清蛋白雜質差異較大，所以可以采用分離范圍合適的凝膠過濾層析進行分離，為了保護目標蛋白活性，操作 PH值應接近中性，其方法為將步驟(3)所得穿透峰進樣到pH近中性，介質為瓊脂糖，優(yōu)選為Superdex 200的凝膠過濾層析柱中，收集重組人抗體。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，由于采用了以動物抗人抗抗體的為配基的免疫親和層析，可根據(jù)重組人抗體和轉基因動物抗體之間恒定區(qū)表位的差異分離，可調節(jié)具體免疫親和層析的工藝條件，得到重組人抗體初步純化產(chǎn)品或純品；采用了凝膠過濾層析對初步純化產(chǎn)品進行了進一步的精制純化，得到了高純度重組人抗體純品；采用以免疫親和層析為核心的復合工藝方法，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，適于進行乳腺生物反應器表達的重組人抗體的規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品純度高，工藝回收率高。


圖1為分離純化工藝流程圖。圖2為離子交換分離純化重組人抗體的色譜圖。圖3為疏水層析分離純化重組人抗體的色譜圖。圖4為免疫親和層析分離純化重組人抗體的色譜圖。圖5為Superdex 200凝膠過濾分離純化重組人抗體的色譜圖。圖6為SDS-PAGE鑒定重組人抗原圖譜，其中，1為經(jīng)過預處理的乳清，2為離子交換層析含重組人抗體的組分，3為免疫親和層析洗脫峰即重組人抗體純品。
具體實施例方式本發(fā)明的方法通過以下實施例進行詳細說明。實施例1取IOOmL表達抗⑶20人單克隆抗體的轉基因牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L， 抗⑶20人單克隆抗體的濃度為1.4g/L，使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為 IOOOOg離心30分鐘去除脂類得到脫脂乳，脫脂乳加入適量乙酸調節(jié)PH到4. 6，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘去除酪蛋白，收集上清液得到乳清80mL，使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到8. 0，使用硫酸銨固體粉末調節(jié)乳清中硫酸銨濃度到0. 8M，進樣到用20mM，pH 8. 0含0. 8M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM,pH 7. 0含0. 8M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰105mL，層析譜圖如圖3所示。疏水層析洗脫峰調節(jié)pH到7. 0，進樣到用20mM，pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為豬抗人抗抗體可變區(qū)片斷，免疫親和層析介質的基質為瓊脂糖，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA ExplorerlOO，紫外^Onm 波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至 ^Onm紫外吸收信號回到基線，再用0. 5M乙酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰105mL，總蛋白濃度為1. Og/L，抗CD20人單克隆抗體濃度為0. 98g/L。取免疫親和層析洗脫峰30mL進樣到用20mM，pH 7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 200凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM, pH 7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集150mL處的蛋白峰共80mL，總蛋白濃度為0. 35g/L，抗⑶20人單克隆抗體濃度為0. 35g/L，純度100%，工藝回收率70%。實施例2取IOOmL表達抗⑶25人單克隆抗體的轉基因大鼠乳，大鼠乳總蛋白濃度為30g/L， 抗CD20人單克隆抗體的濃度為1. 6g/L，使用碟式離心機離心去除脂類得到脫脂乳，脫脂乳加入0. IM氯化鈣，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg 離心30分鐘去除酪蛋白，收集上清液得到乳清80mL，使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到7. 0，進樣到用20mM, pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液平衡好的DEAE Sepharose 4FF離子交換層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外 ^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH 7. 0含IM NaCl的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰lOOmL，層析譜圖如圖2所示。離子交換層析洗脫峰調節(jié)pH到8. 0，進樣到用20mM，pH 8. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為?？谷丝箍贵w，免疫親和層析介質的基質為葡聚糖，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTAExplorer 100，紫外 ^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用0. 4M磷酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰 105mL，總蛋白濃度為1.0g/L，抗⑶25人單克隆抗體濃度為0. 99g/L，純度99%，工藝回收率66%。對本實施例中預處理乳清、離子交換層析組分以及親和層析組分進行SDS-PAGE分析，結果如圖6所示。實施例3取IOOmL表達抗乳腺癌人單克隆抗體BG6的轉基因小鼠乳，小鼠乳總蛋白濃度為 30g/L，抗⑶20人單克隆抗體的濃度為1. 8g/L，使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘去除脂類得到脫脂乳，脫脂乳加入0. 6%凝乳酶，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘去除酪蛋白，收集上清液得到乳清80mL，使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到6. 0，使用上海之信儀器有限公司DDB-300型恒流蠕動泵和Millipore公司300KD中空纖維膜柱進行超濾，循環(huán)5次， 循環(huán)緩沖液使用20mM，pH 6. 0的磷酸鹽緩沖液，最終收集透出液體80mL。
超濾透出液調節(jié)pH到9. 0，進樣到用20mM，pH 9. 0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為大鼠抗人抗抗體，免疫親和層析介質的基質為聚苯乙烯，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTAExplorer 100，紫外 ^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. O的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用0. 6M硫酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰102mL，總蛋白濃度為1.2g/L，抗乳腺癌人單克隆抗體BG6濃度為119g/L，純度99%， 工藝回收率67%。實施例4取IOOmL表達抗⑶20人單克隆抗體的轉基因狗乳，狗乳總蛋白濃度為31g/L，抗 ⑶20人單克隆抗體的濃度為1. 5g/L，調節(jié)pH到10. 0，進樣到用20mM，pH 10. O的磷酸鹽緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為小鼠抗人抗抗體，免疫親和層析介質的基質為聚甲基丙烯酸甲酯，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用1. OM乙酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰 120mL，總蛋白濃度為1. Og/L，抗CD20人單克隆抗體濃度為0. 99g/L。取免疫親和層析洗脫峰30mL進樣到用20mM，pH 8. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 200凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM, pH 8. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，層析譜圖如圖5所示，收集150mL處的蛋白峰共80mL，總蛋白濃度為0. ^g/L，抗⑶20人單克隆抗體濃度為0. ^g/L，純度100%， 工藝回收率60%。實施例5取IOOmL表達抗⑶25人單克隆抗體的轉基因羊乳，羊乳總蛋白濃度為30g/L， 抗⑶20人單克隆抗體的濃度為2. 0g/L,使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為 IOOOOg離心30分鐘去除脂類得到脫脂乳。脫脂乳調節(jié)pH到5. 0，進樣到用20mM，pH 5. 0的磷酸鹽緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為狗抗人抗抗體，免疫親和層析介質的基質為聚丙烯酰胺，柱內(nèi)徑 3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測， 流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 5. 0的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，層析譜圖如圖4所示，再用0. 8M乙酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰118mL，總蛋白濃度為1. 5g/L，抗⑶25人單克隆抗體濃度為1. 49g/L，純度99%，工藝回收率89%。實施例6取IOOmL表達抗⑶20人單克隆抗體的轉基因兔乳，兔乳總蛋白濃度為33g/L， 抗⑶20人單克隆抗體的濃度為1.8g/L，使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為 IOOOOg離心30分鐘去除脂類得到脫脂乳，脫脂乳加入適量鹽酸調節(jié)PH到5. 0，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘去除酪蛋白，收集上清液得到乳清80mL，調節(jié)pH到6. 0，進樣到用20mM，pH 6. 0的磷酸鹽緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為羊抗人抗抗體，免疫親和層析介質的基質為聚乙稀醛， 柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用0. 7M磷酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰105mL，總蛋白濃度為1. 5g/ L，抗⑶20人單克隆抗體濃度為1. 49g/L，純度99%，工藝回收率87%。實施例7取IOOmL表達抗⑶20人單克隆抗體的轉基因馬乳，馬乳總蛋白濃度為30g/L，抗 CD20人單克隆抗體的濃度為2. lg/L，使用碟式離心機離心去除脂類得到脫脂乳，脫脂乳加入0.2M磷酸鈣，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘去除酪蛋白，收集上清液得到乳清80mL，使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清PH到7. 0，進樣到用20mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖液平衡好的蛋白A親和層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTAExplorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測， 流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH7. O含IM NaCl的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰105mL。蛋白A親和層析洗脫峰調節(jié)pH到7. 0，進樣到用20mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為兔抗人抗抗體可變區(qū)片斷，免疫親和層析介質的基質為陶瓷，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GEAKTAExplorer 100，紫外 ^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至觀此！!!紫外吸收信號回到基線，再用0. 9M磷酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰118mL，總蛋白濃度為1. 6g/L,抗⑶25人單克隆抗體濃度為1. 59g/L，純度99%，工藝回收率89%。實施例8取IOOmL表達抗⑶20人單克隆抗體的轉基因豬乳，豬乳總蛋白濃度為33g/L， 抗⑶20人單克隆抗體的濃度為1.4g/L，使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為 IOOOOg離心30分鐘去除脂類得到脫脂乳，脫脂乳加入適量硫酸調節(jié)pH到4. 8，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘去除酪蛋白，收集上清液得到乳清80mL，使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到7. 0，進樣到用20mM， PH 7. O的磷酸鹽緩沖液平衡好的蛋白G親和層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米， 層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用 20mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH 7.0 含IMNaCl的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰lOOmL。蛋白G親和層析洗脫峰調節(jié)pH到8. O，進樣到用20mM，pH 8. O的磷酸鹽緩沖液平衡好的免疫親和層析柱中，免疫親和配基為馬抗人抗抗體，免疫親和層析介質的基質為瓊脂糖，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA ExplorerlOO，紫外^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH 8. 0的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm 紫外吸收信號回到基線，再用1. OM鹽酸溶液一步洗脫并收集洗脫峰105mL，總蛋白濃度為 1. 0g/L，抗CD20人單克隆抗體濃度為0. 98g/L。取免疫親和層析洗脫峰30mL進樣到用20mM，pH 7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的kpharose 6B凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM, pH 7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集150mL處的蛋白峰共80mL，總蛋白濃度為0. 35g/L，抗⑶20人單克隆抗體濃度為0. 35g/L，純度100%，工藝回收率70%。
此外，本發(fā)明還對比了在去除酪蛋白步驟、粗分離步驟、免疫親和層析步驟和精分離步驟中采用不同方法和不同實驗條件下，分離回收目標抗體的純度和回收率，其結果如表1所示。表1不同方法、不同實驗條件下分離目標抗體的結果
權利要求
1.一種從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將轉基因哺乳動物乳液進行脫脂預處理，獲得脫脂乳；(2)將所得脫脂乳進行去除酪蛋白處理，獲得含目標抗體的乳清液；(3)將所得乳清液進行免疫親和層析，從洗脫峰中獲得目標抗體，其中，免疫親和層析介質的配基為針對人抗體種屬特征區(qū)域的單克隆抗抗體或其可變區(qū)。
2.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，脫脂預處理步驟為座式離心，室溫下IOOOOg 離心30分鐘；或碟式離心，48°C、3000g離心。
3.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，去除酪蛋白步驟為(1)酸性沉淀法，室溫調節(jié)脫脂乳pH為4.0 5. 0，靜置后離心收集上清液；或(2)鈣鹽沉淀法，室溫向脫脂乳中添加0.1 0. 5M鈣鹽，靜置后離心收集上清液；或(3)凝乳酶法，室溫或37°C向脫脂乳中添加0.5% 1.5%的凝乳酶，靜置后離心收集上清液；或(4)超濾法，調節(jié)脫脂乳pH值為6.0 8. 0，采用截留分子量200 1000KD的超濾膜超濾，收集濾出液。
4.根據(jù)權利要求3所述方法，其特征在于，酸性沉淀法中室溫調節(jié)脫脂乳pH值為 4. 5 4. 8 ；超濾法中調節(jié)脫脂乳pH值為6. 0 8. 0。
5.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，免疫親和層析步驟中所使用的免疫親和層析緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；平衡緩沖液為20 lOOmM，pH 6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液；洗脫緩沖液為鹽酸溶液或磷酸溶液或硫酸溶液或乙酸溶液。
6.根據(jù)權利要求5所述方法，其特征在于，免疫親和層析步驟中所使用的免疫親和層析緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液；洗脫緩沖液為濃度0. 2 1. OM乙酸溶液。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，免疫親和層析中，調節(jié)乳清液pH為5.0 10. 0。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，免疫親和層析過程乳清液體積為0.5 10. 0倍層析柱體積。
9.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述方法還包括將免疫親和層析中穿透峰進行精分離處理的步驟，所述精分離處理步驟為(1)疏水層析，室溫加入硫酸銨粉末使得穿透峰硫酸銨濃度為0.5-1. 5M，使用低鹽緩沖液洗脫、并收集含有重組人抗體的洗脫組分；或(2)離子交換層析，室溫調節(jié)穿透峰pH為5.0-10. 0，使用高鹽緩沖液洗脫、并收集含有重組人抗體的洗脫組分；或(3)凝膠過濾層析，介質為Superdex200。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗體分離純化領域，具體地，涉及一種從轉基因哺乳動物乳液中分離重組人抗體的方法。該方法包括如下步驟(1)將轉基因哺乳動物乳液進行脫脂預處理，獲得脫脂乳；(2)將所得脫脂乳進行去除酪蛋白處理，獲得含目標抗體的乳清液；(3)將所得乳清液進行免疫親和層析，從洗脫峰中獲得目標抗體，其中，免疫親和層析介質的配基為針對人抗體種屬特征區(qū)域的單克隆抗體或其可變區(qū)。本方法還包括將免疫親和層析中穿透峰進行精分離處理。本發(fā)明生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，適于乳腺生物反應器表達的重組人抗體的規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品純度高，工藝回收率高。
文檔編號C07K1/30GK102311498SQ20111024062
公開日2012年1月11日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權日2011年8月19日
發(fā)明者張焱, 羅堅, 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所