本發(fā)明涉及一種芐撐巴比妥類化合物作為pcsk9拮抗劑的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種芐撐巴比妥類化合物在降低低密度脂蛋白中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

pcsk9是一種可溶性的內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶，為哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的成員之一。主要在肝臟合成，在腸道、腎臟及腦也有低水平的表達(dá)。pcsk9在肝細(xì)胞中以非活化的形式存在，一旦釋放到血液中就可以與ldl受體結(jié)合，透過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入肝細(xì)胞后降解。肝細(xì)胞表面的ldl受體就會(huì)減少，而血液中的ldl過多會(huì)導(dǎo)致血脂水平的升高。先天pcsk9變異人群的高酯血癥發(fā)病率低。當(dāng)前對(duì)于pcsk9拮抗劑的研究，仍然集中于單克隆抗體的方向，然而單克隆抗體作為藥物應(yīng)用于臨床，在使用上有諸多不便。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種芐撐巴比妥類化合物在作為pcsk9拮抗劑中的應(yīng)用，以及進(jìn)一步的，一種芐撐巴比妥類化合物在降低低密度脂蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種芐撐巴比妥類pcsk9拮抗劑在作為pcsk9拮抗劑中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，本發(fā)明的應(yīng)用中的芐撐巴比妥類pcsk9拮抗劑，為結(jié)構(gòu)式v所示的化合物，

以及其溶劑化物和藥學(xué)上可以接受的鹽。

作為優(yōu)選，結(jié)構(gòu)式v中，r1，r2分別是h，-or’，-oc(o)r”，-oso2r”，-oc(o)nr’r”，-o-亞烷基-or’，-o-亞烷基-nr’r”，-so2r’，-s(o)r，-sr，-nr’r”，-nhc(o)r’，-nhc(o)or’，-nhc(o)nr’r”，-nr’c(o)r”，-nr’c(o)or”，-nr’c(o)nr”r”’中的任意一種，或者有取代或未經(jīng)取代的烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基中的任意一種，

x是取代或未經(jīng)取代的烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基中的任意一種，

y是取代或未經(jīng)取代的烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基中的任意一種。

作為優(yōu)選，結(jié)構(gòu)式v中，r1，r2分別是h，烷基。

作為優(yōu)選，結(jié)構(gòu)式v中，r1，r2是h。

作為優(yōu)選，結(jié)構(gòu)式v中，x是取代或未取代的芳基和雜芳基。

作為優(yōu)選，結(jié)構(gòu)式v中，y是取代或未取代的芳基和雜芳基。

作為優(yōu)選，結(jié)構(gòu)式v中，芐撐巴比妥類pcsk9拮抗劑形成組合物。

更優(yōu)選的，芐撐巴比妥類pcsk9拮抗劑為下列三種化合物中的任意一種：

更優(yōu)選的，芐撐巴比妥類pcsk9拮抗劑的用量為：100μm至50μm。

本發(fā)明還提供一種芐撐巴比妥類化合物在降低低密度脂蛋白中的應(yīng)用，其特征在于，包括上述任意一項(xiàng)所述的芐撐巴比妥類化合物。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的芐撐巴比妥類化合物在作為pcsk9拮抗劑中的應(yīng)用和在降低低密度脂蛋白中的應(yīng)用，能夠有效降低低密度脂蛋白的濃度。并且，本發(fā)明提供了一種小分子的芐撐巴比妥類化合物作為pcsk9拮抗劑，制造方便且易于進(jìn)入臨床應(yīng)用。

附圖說明

圖1是超速過濾親和力篩選過程示意圖；

圖2是超速離心親和力篩選過程示意圖；

圖3是超速離心親和力篩選結(jié)果；

圖4是ldl攝取實(shí)驗(yàn)的viva2956的結(jié)果；

圖5是ldl攝取實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖來說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

本實(shí)施方式提供一種化合物在降低血液中低密度脂蛋白中的應(yīng)用。本應(yīng)用中包括向受試者施用降低低密度脂蛋白有效量的本文化合物，混合物和組合物。

1.本發(fā)明的化合物具有圖中v的結(jié)構(gòu)：

其中，r1，r2獨(dú)立的地是h，-or’，-oc(o)r”，-oso2r”，-oc(o)nr’r”，-o-亞烷基-or’，-o-亞烷基-nr’r”，-so2r’，-s(o)r，-sr，-nr’r”，-nhc(o)r’，-nhc(o)or’，-nhc(o)nr’r”，-nr’c(o)r”，-nr’c(o)or”，-nr’c(o)nr”r”’，或者有取代或未經(jīng)取代的烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基。

其中，x是取代或未經(jīng)取代的烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基。

其中，y是取代或未經(jīng)取代的烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基。

作為一種優(yōu)選方案，r1，r2是h。

作為一種優(yōu)選方案，x是雜芳基。

作為一種優(yōu)選方案,y是取代的苯基。

本實(shí)施方式中在經(jīng)過篩選之后，降低ldl的化合物v，較佳的為如下三種化合物：

三種化合物在本發(fā)明中分別被命名為viva2488，viva5589以及viva2956。

在這三種化合物中，降低ldl最佳的為viva2956。

含有本發(fā)明化合物的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的游離形式或可藥用鹽形式的符合通式(i)的化合物作為活性成分；一種或多種藥用載體物質(zhì)和/或稀釋劑。

以下介紹篩選的方法：

2.篩選與pcsk9具有較強(qiáng)結(jié)合力的分子：

篩選方法a，超速過濾親和力篩選，過程如圖1所示，具體如下：

用篩選緩沖鹽溶液25mmhepes，ph＝7.9，300mmnacl準(zhǔn)確配置濃度為50μmpcsk9蛋白和100μmldlr溶液，分別與2μm化合物viva2956進(jìn)行混合，使總體積為550μl，在25℃下孵育30min后，取50μl作為樣品r0，余下的500μl轉(zhuǎn)移至蛋白超濾濃縮離心管中，pcsk9用30kd尺寸的超濾濃縮離心管，ldlr用10kd尺寸的超濾濃縮離心管。在轉(zhuǎn)速13000rmp條件下離心至過濾膜上層剩余50μl蛋白溶液，加入450μl篩選緩沖鹽溶液，混合均勻后繼續(xù)離心至50μl，重復(fù)一次，最后得到50μl蛋白溶液作為樣品r3。在r0和r3樣品中加入150μl乙腈，混合均勻后，經(jīng)轉(zhuǎn)速13000rmp離心時(shí)間10min后除去沉淀的蛋白，得到上清溶液，取上清溶液進(jìn)行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(μplc/ms)分析，得到r0和r3樣品中化合物viva2956的色譜峰高值r0和r3，計(jì)算pcsk9的r3/r0和ldlr?；衔飗iva2956的r3/r0＝128％，ldlr的r3/r0＝261％。

圖1中蛋白14為pcsk9。化合物15為pcsk9拮抗劑。有拮抗作用的化合物15用實(shí)心三角形來表示，其它形狀如星形和圓形表示待篩選的化合物分子。

篩選方法b，超速離心親和力篩選，過程如圖2所示，具體如下：

用篩選緩沖鹽溶液25mmhepes，ph＝7.9，300mmnacl準(zhǔn)確配置濃度為30μm的pcsk9蛋白，與濃度為2μm的待篩選化合物進(jìn)行混合，混合后總體積為150μl，在25℃下孵育30min，放入超速離心機(jī)，經(jīng)轉(zhuǎn)速90000rmp離心時(shí)間70min后取出，快速將樣品分成上、中、下三層樣品，分別為樣品ct、cm、cb，每層樣品體積為50μl，在每層樣品中分別加入150μl乙腈，混合均勻，在轉(zhuǎn)速13000rmp離心時(shí)間10min后除去沉淀的蛋白，得到上清溶液，取上清溶液進(jìn)行l(wèi)c/ms分析，得到ct和cb樣品中化合物的色譜峰高值ct和cb，計(jì)算cb/ct的值，化合物viva2956的cb/ct＝1.54。

圖2中，第一化合物11，表示與pcsk9強(qiáng)結(jié)合的化合物，第二化合物12表示與pcsk9弱結(jié)合的化合物，第三化合物13表示與pcsk9不結(jié)合的化合物。

超速離心親和力篩選結(jié)果圖3所示，cb/ct的值越大，親合結(jié)合越強(qiáng)。

下面的方法用來測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)pcsk9-ldlr之間結(jié)合的抑制活性。對(duì)于每個(gè)化合物測(cè)定了多個(gè)濃度下的抑制率，進(jìn)而推算出其ic50值，即在此濃度下結(jié)合的ldlr為不加入化合物時(shí)的一半。

3.pcsk9-ldlr抑制活性的測(cè)定

3.1、材料

a、二甲基亞砜(dmso)(sigmad5879)

b、吐溫20(tween20)

c、透明96孔板(costar42592)

d、檢測(cè)緩沖液(25mmhepes,300mmnacl,ph7.9,0.2％bsa)

e、pbs緩沖液

f、鏈親和素(streptavidin)

g、生物素化的pcsk9蛋白

h、帶his標(biāo)簽的ldlr蛋白

i、一抗：anti-hisantibody(tiangenab102-02)

j、二抗：ab-hrp(santacruzbiotechnologysc-2005)

k、四甲基聯(lián)苯胺(tmb)(bbilifesciencest0759)

l、待測(cè)化合物：stk952488、stk385589和zinc09042956

3.2、測(cè)試方法

在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay(elisa))中，以鏈親和素(streptavidin)包被實(shí)驗(yàn)板并特異性吸附上生物素化的pcsk9蛋白。隨后分別加入化合物viva2488，viva5589或viva2956，常溫孵育30分鐘。之后再加入帶his標(biāo)簽的ldlr蛋白，常溫孵育1小時(shí)。反復(fù)洗板(pbs中加入0.2％tween20)后經(jīng)由一抗、二抗的特異性偶聯(lián)及tmb反應(yīng)，最終經(jīng)由450nm處消光來測(cè)定結(jié)合在板上的ldlr蛋白量。在實(shí)驗(yàn)中，隨著三個(gè)化合物濃度的升高，pcsk9和ldlr的結(jié)合被逐漸阻斷。最終測(cè)得的ic50值分別為1.8e-4m(viva488)，2.9e-4m(viva5589)和4.9e-5m(viva2956)。

4.ldl攝取實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)中所用材料的來源：

hepg2細(xì)胞來源上海中科院細(xì)胞庫

ldluptakeassaykit購于biovision，cat.no.k585-100

pcsk9抗體購于r&d公司，cat.no.af3888

4.1將hepg2細(xì)胞按照40，000個(gè)細(xì)胞/孔的密度種于96孔透明細(xì)胞培養(yǎng)板中，37度co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

4.2第二天，棄去hepg2培養(yǎng)基更換為含有10％脫脂血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)。

4.3第三天，

(1)配置終濃度為100μm，50μm,20μm和10μm的化合物，使其最終dmso含量為0.5％。終濃度為50μg/ml和25μg/ml的pcsk9抗體最為陽性對(duì)照。

(2)將化合物或抗體與25μg/ml的pcsk9蛋白于4度冰箱中預(yù)孵育1小時(shí)；

(3)取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用100μl的分析緩沖液assaybuffer洗滌細(xì)胞3次；

(4)將用含10％脫脂血清培養(yǎng)基配制的f-ldl(70μg/ml)、不同濃度的化合物或抗體和pcsk9蛋白的混合物加入細(xì)胞中，37度co2培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)。這里的f-ldl，是指進(jìn)行過熒光標(biāo)記后的ldl。

(5)用100μlassaybuffer洗滌4次。

(6)tecan酶標(biāo)儀測(cè)熒光值，ex/em＝540/575nm；

(7)將終濃度為1μg/mldapi，0.1％tritionx100加入到細(xì)胞中，孵育15分鐘；

(8)用酶標(biāo)儀讀取熒光，ex/em＝364/454nm；

(9)分析數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，化合物viva2956在100μm和50μm有大約30％左右的抑制作用，在20μm和10μm濃度下無抑制作用。

如圖5所示，pcsk9抗體在50μg/ml的濃度下接近100％抑制，在25μg/ml濃度作用下有50％左右的抑制作用。

由于本發(fā)明的芐撐巴比妥類pcsk9拮抗劑屬于小分子物質(zhì)，因此能夠通過化學(xué)合成的方法制備，與大分子的拮抗劑相比，便于進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，降低成本。