本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種超臨界流體技術(shù)制備軟組織去細(xì)胞基質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

去細(xì)胞基質(zhì)是用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織/器官進(jìn)行去細(xì)胞處理，除去組織中可能引起排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分，保持組織/器官的三維結(jié)構(gòu)。與金屬、塑料等非動物來源的材料相比，去細(xì)胞基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)更接近人體組織，生物相容性更優(yōu)異，這使之成為組織工程修復(fù)中應(yīng)用最為廣泛的材料。去細(xì)胞的過程就是通過物理方法、化學(xué)方法和生物酶等方法除去組織/器官中的細(xì)胞，盡量降低其中的細(xì)胞成分等免疫原性物質(zhì)的含量。去細(xì)胞方法的有效性取決于多種因素，如細(xì)胞類型、組織密度、厚度和脂質(zhì)含量等。

軟組織去細(xì)胞基質(zhì)中，含有豐富的膠原蛋白、氨基聚糖等，具有良好的生物相容性和生物力學(xué)性能。多種軟組織去細(xì)胞基質(zhì)，如真皮去細(xì)胞基質(zhì)、小腸黏膜下層去細(xì)胞基質(zhì)、血管去細(xì)胞基質(zhì)等，在組織工程研究中已經(jīng)被廣泛用于皮膚、血管、腹壁等組織缺損的再生修復(fù)，并表現(xiàn)出良好的促進(jìn)組織再生能力。因此，將軟組織中的細(xì)胞成分，使之成為不含細(xì)胞的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)，可以用作合適細(xì)胞遷移、生長和增殖的生物支架材料。

現(xiàn)有的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝多采用蛋白酶和十二烷基硫酸鈉(sds)等溶液除去組織中的細(xì)胞，但這些試劑對組織的作用劇烈，對基質(zhì)成分破壞嚴(yán)重，容易導(dǎo)致組織基質(zhì)降解。另外，這些試劑不易除去，殘留在組織中可能會引起細(xì)胞毒性，生物相容性較差。

傳統(tǒng)的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝容易導(dǎo)致基質(zhì)成分容易被破壞，而且試劑殘留嚴(yán)重，植入組織中可能引起嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)。

傳統(tǒng)的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝可能導(dǎo)致基質(zhì)降解，力學(xué)性能下降。

傳統(tǒng)的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝需要耗費大量的時間除去組織中的殘留細(xì)胞和殘留的試劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種軟組織去細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，該方法去細(xì)胞效率高，對軟組織的基質(zhì)成分的破壞更小，同時使其免疫原性低，生物相容性好。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種軟組織去細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，該方法包括：使用超臨界流體技術(shù)制備軟組織去細(xì)胞基質(zhì)，所述軟組織為天然軟組織，所述天然軟組織包括小腸組織，血管組織，肌肉組織，心臟組織，瓣膜組織，肺組織，脾臟組織，腎臟組織，肝臟組織，胃組織，膽囊組織，脂肪組織，軟骨組織，氣管組織，食道組織，膀胱組織，輸尿管組織，輸卵管組織或子宮組織。

優(yōu)選地，該方法具體包括預(yù)處理，消毒，去細(xì)胞，漂洗和滅菌步驟。

優(yōu)選地，所述預(yù)處理為在4-10℃條件下，除去所述軟組織中的雜質(zhì)組織，洗凈待用。

優(yōu)選地，所述消毒為用過氧乙酸溶液、乙醇溶液和新潔爾滅中的一種振蕩浸泡或幾種混合后振蕩浸泡經(jīng)過預(yù)處理的軟組織，再用生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液或去離子水漂洗至ph為中性。

優(yōu)選地，所述過氧乙酸溶液的濃度為0.01-0.1wt％；所述乙醇溶液的濃度為1-10％；所述新潔爾滅的濃度為0.05-1wt％；所述浸泡時間為0.5-24h。優(yōu)選地，所述去細(xì)胞和漂洗均采用超臨界co2流體處理。

優(yōu)選地，所述去細(xì)胞步驟的流體處理的條件為：處理的時間為0.5-24h，處理的壓強(qiáng)為8-40mpa，處理的溫度為33-40℃，處理后的泄壓速度為0.1-1mpa/min。

優(yōu)選地，所述去細(xì)胞步驟的流體處理過程中加入甲醇、無水乙醇、三氟乙醇和丙酮中的一種或多種極性溶劑作為夾帶劑，所述夾帶劑體積為所述軟組織總體積的1-100倍。

優(yōu)選地，所述漂洗步驟的流體處理的條件為：處理的時間為6-48h，處理的壓強(qiáng)為8-40mpa，處理的溫度為33-40℃，處理后的泄壓速度為0.1-1mpa/min；所述漂洗步驟的流體處理過程中加入濃度為0.5-10wt％的三羥甲基氨基甲烷溶液或無水乙醇作為夾帶劑，夾帶劑的體積為組織體積的1-100倍。

上述方法制備的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.超臨界co2擴(kuò)散系數(shù)大，傳質(zhì)速度快，能在短時間內(nèi)滲透到軟組織基質(zhì)內(nèi)部，在數(shù)分鐘或者數(shù)小時就能滲透到軟組織基質(zhì)內(nèi)部，而傳統(tǒng)的化學(xué)試劑通常需要1天甚至數(shù)天才能完全滲透至軟組織基質(zhì)內(nèi)部，作用于組織中的細(xì)胞；

2.co2具有良好的脂質(zhì)溶解性能，可以溶解細(xì)胞中的脂質(zhì)成分，破壞細(xì)胞膜的完整性；

3.泄壓過程中，壓力下降時細(xì)胞因胞內(nèi)外壓差較大而急劇膨脹發(fā)生破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，便于后續(xù)處理中將細(xì)胞內(nèi)容物更徹底地除去，降低軟組織基質(zhì)中的免疫原性；

4.泄壓過程中，co2由超臨界狀態(tài)恢復(fù)至氣態(tài)，快速從軟組織基質(zhì)中逃逸出來，不易殘留在組織中，避免化學(xué)試劑在軟組織基質(zhì)中殘留，減少用于除去基質(zhì)中化學(xué)試劑的漂洗時間，縮短去細(xì)胞處理的時間周期；

5.超臨界co2流體技術(shù)制備的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)，去細(xì)胞效率高，對軟組織的基質(zhì)成分的破壞更小，得到的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)免疫原性低、生物相容性好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1a為實施例1中制備得到的豬小腸黏膜下層去細(xì)胞后放大10倍的組織染色圖；

圖1b為實施例1中制備得到的豬小腸黏膜下層去細(xì)胞后放大20倍的組織染色圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

生物衍生材料是指天然生物組織經(jīng)過特殊處理后形成的一種生物材料。近年來去細(xì)胞組織基質(zhì)(acellulartissuematrix)越來越多的被用于生物衍生材料。

傳統(tǒng)的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝容易導(dǎo)致基質(zhì)成分容易被破壞，而且試劑殘留嚴(yán)重，植入組織中可能引起嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)。

傳統(tǒng)的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝可能導(dǎo)致基質(zhì)降解，力學(xué)性能下降。

傳統(tǒng)的軟組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝需要耗費大量的時間除去組織中的殘留細(xì)胞和殘留的試劑。

而超臨界co2擴(kuò)散系數(shù)大，傳質(zhì)速度快，能在短時間內(nèi)滲透到軟組織基質(zhì)內(nèi)部，在數(shù)分鐘或者數(shù)小時就能滲透到軟組織基質(zhì)內(nèi)部，而傳統(tǒng)的化學(xué)試劑通常需要1天甚至數(shù)天才能完全滲透至軟組織基質(zhì)內(nèi)部，作用于組織中的細(xì)胞；

co2具有良好的脂質(zhì)溶解性能，可以溶解細(xì)胞中的脂質(zhì)成分，破壞細(xì)胞膜的完整性；

泄壓過程中，壓力下降時細(xì)胞因胞內(nèi)外壓差較大而急劇膨脹發(fā)生破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，便于后續(xù)處理中將細(xì)胞內(nèi)容物更徹底地除去，降低軟組織基質(zhì)中的免疫原性；

泄壓過程中，co2由超臨界狀態(tài)恢復(fù)至氣態(tài)，快速從軟組織基質(zhì)中逃逸出來，不會殘留在組織中，避免化學(xué)試劑在軟組織基質(zhì)中殘留，減少用于除去基質(zhì)中化學(xué)試劑的漂洗時間，縮短去細(xì)胞處理的時間周期。

所以，本發(fā)明的發(fā)明人將超臨界流體技術(shù)用于制備軟組織去細(xì)胞基質(zhì)。

采用超臨界流體技術(shù)去軟組織細(xì)胞基質(zhì)包括如下步驟：

預(yù)處理，消毒，去細(xì)胞，漂洗和滅菌步驟。

在一個優(yōu)選的實施方式中，預(yù)處理為在低溫條件下，去除組織中的其他組織成分，洗凈待用。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，消毒為用過氧乙酸溶液、乙醇溶液、或新潔爾滅浸泡的一種振蕩浸泡或幾種混合后振蕩浸泡經(jīng)過預(yù)處理的軟組織，再用水漂洗至ph為中性；

過氧乙酸溶液的濃度優(yōu)選為0.01-0.1wt％；乙醇溶液的濃度優(yōu)選為1-10％；新潔爾滅的濃度優(yōu)選為0.05-1wt％；浸泡時間優(yōu)選為0.5-24h。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，去細(xì)胞采用超臨界co2流體處理；

去細(xì)胞步驟的流體處理的條件為：處理的時間優(yōu)選為0.5-24h，處理的壓強(qiáng)優(yōu)選為8-40mpa，處理的溫度優(yōu)選為33-40℃，處理后的泄壓速度優(yōu)選為0.1-1mpa/min；

去細(xì)胞步驟的流體處理過程中加入甲醇、無水乙醇、三氟乙醇和丙酮的一種或多種作為夾帶劑，所述夾帶劑的體積為所述軟組織組織體積的1-100倍。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，漂洗采用超臨界co2流體處理；

漂洗步驟的流體處理的條件為：處理的時間優(yōu)選為6-48h，處理的壓強(qiáng)優(yōu)選為8-40mpa，處理的溫度優(yōu)選為33-40℃，處理后的泄壓速度優(yōu)選為0.1-1mpa/min；

漂洗步驟的流體處理過程中加入濃度優(yōu)選為0.5-10wt％的三羥甲基氨基甲烷或無水乙醇溶液作為夾帶劑，夾帶劑的體積為組織體積的1-100倍。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，采用γ射線輻照滅菌。

實施例1

對軟組織采用超臨界流體技術(shù)進(jìn)行去細(xì)胞，以豬小腸黏膜下層為例，包括如下步驟：

預(yù)處理：取豬小腸空腸段，在低溫環(huán)境下，將漿膜層、肌層和黏膜層刮除，用清水漂洗至澄清，得到豬小腸黏膜下層；

消毒：用濃度為0.02wt％的過氧乙酸溶液和濃度為4％的乙醇溶液振蕩浸泡2h，用清水漂洗至ph為中性；

去細(xì)胞：用超臨界co2流體處理2h，壓強(qiáng)為20mpa，溫度為37℃，加入無水乙醇的作為夾帶劑，無水乙醇的體積為豬小腸黏膜下層體積的20倍，泄壓速度為0.5mpa/min；

漂洗：用超臨界co2流體處理20h，壓強(qiáng)為20mpa，溫度為37℃，加入濃度為2wt％的三羥甲基氨基甲烷溶液作為夾帶劑，泄壓速度為0.5mpa/min；

滅菌：采用γ射線輻照滅菌，輻照劑量為25kgy。

實施例2

對軟組織采用超臨界流體技術(shù)進(jìn)行去細(xì)胞，以豬小腸黏膜下層為例，包括如下步驟：

預(yù)處理：取豬小腸空腸段，在低溫環(huán)境下，將漿膜層、肌層和黏膜層刮除，用清水漂洗至澄清，得到小腸黏膜下層；

消毒：用濃度為0.08wt％的過氧乙酸溶液或濃度為0.1wt％的新潔爾滅溶液振蕩浸泡0.5h，用清水漂洗至ph為中性；

去細(xì)胞：用超臨界co2流體處理0.5h，壓強(qiáng)為30mpa，溫度為37℃，加入無水乙醇和丙酮的混合物作為夾帶劑，無水乙醇和丙酮的混合物的體積為豬小腸黏膜下層體積的30倍，泄壓速度為0.2mpa/min；

漂洗：用超臨界co2流體處理15h，壓強(qiáng)為30mpa，溫度為37℃，加入濃度為0.5wt％的三羥甲基氨基甲烷溶液作為夾帶劑，泄壓速度為1mpa/min；

滅菌：采用射線輻照滅菌，輻照劑量為25kgy。

實施例3

對豬小腸黏膜下層采用超臨界流體技術(shù)進(jìn)行去細(xì)胞，包括如下步驟：

預(yù)處理：取豬小腸空腸段，在低溫環(huán)境下，將漿膜層、肌層和黏膜層刮除，用清水漂洗至澄清，得到豬小腸黏膜下層；

消毒：用濃度為0.04wt％的過氧乙酸溶液和濃度為5％的乙醇溶液振蕩浸泡1h，用清水漂洗至ph為中性；

去細(xì)胞：用超臨界co2流體處理3.5h，壓強(qiáng)為10mpa，溫度為37℃，加入無水乙醇和丙酮的混合物作為夾帶劑，無水乙醇和丙酮的混合物的體積為豬小腸黏膜下層體積的10倍，泄壓速度為1mpa/min；

漂洗：用超臨界co2流體處理12h，壓強(qiáng)為10mpa，溫度為37℃，加入濃度為4％的乙醇溶液作為夾帶劑，泄壓速度為0.2mpa/min；

滅菌：采用伽馬射線輻照滅菌，輻照劑量為25kgy。

實施例4

對實施例1中去細(xì)胞處理前后的豬小腸黏膜基質(zhì)進(jìn)行he染色，如圖1a和1b所示，圖1a為放大10倍圖，圖1b為放大20倍圖，染色結(jié)果表明，實施例1中處理后的豬小腸黏膜下層中基本看不到細(xì)胞了，說明該工藝可以有效除去豬小腸黏膜下層基質(zhì)中的細(xì)胞，降低基質(zhì)的免疫原性。

實施例5

參考國家標(biāo)準(zhǔn)yy/t0606.25-2014對實施例1至實施例3去細(xì)胞處理前后的豬小腸黏膜基質(zhì)進(jìn)行了dna殘留量檢測，經(jīng)上述去細(xì)胞工藝處理后，豬小腸黏膜下層基質(zhì)中的dna殘留量為41.89ng/mg，去細(xì)胞基質(zhì)材料中dna殘留低于50ng/mg。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。