本發(fā)明涉及一種酶法高效制備角膜脫細(xì)胞基質(zhì)組織工程支架的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

角膜疾病的致盲率在眼科疾病中占據(jù)第二位，我國(guó)每年也有數(shù)百萬(wàn)角膜盲患者。角膜病的早期治療方法主要根據(jù)病因來(lái)對(duì)癥治療，晚期時(shí)，由于角膜多出現(xiàn)瘢痕、潰瘍等，需要手術(shù)替換病變角膜，即角膜移植術(shù)。角膜移植術(shù)是治療角膜盲最重要的方法。我國(guó)每年有數(shù)百萬(wàn)角膜盲患者，其中大部分患者更可以通過(guò)角膜移植術(shù)脫盲。角膜移植術(shù)的供體角膜絕大多數(shù)為人源角膜，因此數(shù)量極其有限，最終每年可以通過(guò)異體角膜移植術(shù)重見(jiàn)光明患者的只有數(shù)千例。這種情況下，替代材料的發(fā)展成為了角膜盲患者康復(fù)的希望，因而研究能夠替代角膜的組織工程材料成為一種迫切的需求。

角膜基質(zhì)層是構(gòu)成角膜的主要部分，占角膜厚度的90％，主要成分為角膜基質(zhì)細(xì)胞、膠原、糖蛋白和蛋白多糖。正常的角膜基質(zhì)由200-250層膠原纖維板構(gòu)成，交錯(cuò)排列，其中構(gòu)成角膜纖維板層的膠原纖維相互平行排列，直徑一致，集中分布于30nm附近，間距相等。角膜基質(zhì)特征性組織學(xué)結(jié)構(gòu)與角膜透明性狀密切相關(guān)，是其他組織所不能替代的。因此，角膜基質(zhì)組織的構(gòu)建是組織工程技術(shù)構(gòu)建角膜的主要任務(wù)、難點(diǎn)和關(guān)鍵所在。組織工程角膜載體材料需要有良好的三維立體結(jié)構(gòu)和功能蛋白以支持種子細(xì)胞的生長(zhǎng)，一定的機(jī)械強(qiáng)度，較好的透光度、屈光度、透氧性，以及良好的生物可降解性等等。角膜組織工程材料主要包括天然材料，人工材料及復(fù)合材料。天然材料包括羊膜，殼聚糖，膠原，異種角膜基質(zhì)等。人工材料是人工合成的高分子物質(zhì)，包括聚羥基乙酸，合成膠原等，但由于非酶性水解，未知的體內(nèi)代謝過(guò)程及產(chǎn)物，作為角膜組織工程的支架材料，仍需進(jìn)行深入的研究。另外，人工材料通常在曲率，透明度，機(jī)械強(qiáng)度，密度，孔隙率等性質(zhì)上與天然角膜有一定差異。引用兩種或兩種以上的材料，通過(guò)不同的配比、合成方法等調(diào)節(jié)材料的性質(zhì)，制成是復(fù)合材料。但在復(fù)合材料中，各部分的比例，混合方法，材料的具體物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)等，還需要進(jìn)一步研究。因此，由于角膜組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，人工和復(fù)合材料材料很難滿足角膜移植后組織層次的正常重建。

鑒于這些問(wèn)題，近年來(lái)異種動(dòng)物組織因其來(lái)源豐富、成本低廉、并經(jīng)脫去異種細(xì)胞處理后制備的支架可商業(yè)化生產(chǎn)，在角膜組織重建中的應(yīng)用得到了越來(lái)越多的關(guān)注。動(dòng)物眼球作為肉類加工的副產(chǎn)品，大多數(shù)企業(yè)并未將其加工利用而是直接掩埋丟棄，不僅會(huì)造成環(huán)境污染，更是對(duì)資源的一種極大浪費(fèi)。因此以動(dòng)物眼球作為一種基礎(chǔ)材料制備角膜支架材料不僅提高肉類加工副產(chǎn)品的附加值，還能有效避免資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。不同種屬的動(dòng)物比較，豬角膜的免疫原性最低，而且豬、人眼角膜的應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系和強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)證明二者十分相似。豬角膜脫細(xì)胞后作為支架擁有天然角膜的結(jié)構(gòu)、厚度、曲率、韌性及微環(huán)境，其細(xì)胞外基質(zhì)成分能夠有效的支持細(xì)胞的黏附和移行，其含有的相關(guān)生物信息也能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，其固有的組織結(jié)構(gòu)層次能滿足有效構(gòu)建角膜內(nèi)皮層，并與角膜上皮、基質(zhì)細(xì)胞層有機(jī)整合，促進(jìn)組織再生。此外其透明度高，由于其直接來(lái)源于生物活體而具有良好的生物安全性和生物相容性，因而具有良好的應(yīng)用前景。但研究表明：處理工藝方法的不同會(huì)引起材料的孔徑大小以及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同。制備異種脫細(xì)胞支架的方法主要為物理法，化學(xué)法和生物法。物理法中較為常用的是反復(fù)凍融法和高靜壓法。但細(xì)胞的效率較差需要結(jié)合其他處理方法，或儀器過(guò)于昂貴，大大增加了應(yīng)用成本。化學(xué)法的應(yīng)用較為廣泛，主要包括去污劑處理法，酸、堿處理，去污劑的使用較為成熟，包括sds，tritonx-100等，但制備過(guò)程對(duì)基質(zhì)的膠原纖維有一定損傷和破壞，且去垢劑不易清洗干凈，殘留在組織中將對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生傷害作用。生物法主要為包括酶法(如胰酶)去細(xì)胞。胰酶可以較溫和地去除細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整與穩(wěn)定性，整個(gè)過(guò)程最大限度的保證了基質(zhì)層的結(jié)構(gòu)和功能的完整性和穩(wěn)定性。但胰酶破壞膠原蛋白的端肽，而且不能徹底去除去細(xì)胞處理(decellularizationoracellularization)過(guò)程中降解后所釋放出的遺傳物質(zhì)，有時(shí)很難避免用可能引起的免疫排斥反應(yīng)。此外，以膠原成分為主的角膜脫細(xì)胞基質(zhì)的力學(xué)性能差，韌性張力小，在體內(nèi)降解代謝過(guò)快，在含水條件下難以塑形，不利于人體器官的重建。因此，尋找有效的方法對(duì)角膜脫細(xì)胞支架進(jìn)行改性來(lái)提高其力學(xué)性能也是保障其未來(lái)應(yīng)用的必要措施，探索一種有效的制備脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的流程方法仍然是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶法高效制備角膜脫細(xì)胞基質(zhì)組織工程支架的方法；該方法通過(guò)處理天然豬角膜支架，將其制備成可替代的生物材料，解決供體角膜有限的難題。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種酶法高效制備角膜脫細(xì)胞基質(zhì)組織工程支架的方法，步驟如下：

(1)將豬角膜基質(zhì)板層置于稀釋的myroilysin中，在35～38℃條件下進(jìn)行脫細(xì)胞處理10～18h，然后生理鹽水、蒸餾水分別沖洗，制得豬角膜脫細(xì)胞支架板層；

(2)將步驟(1)制備的將豬角膜脫細(xì)胞支架放置在鉆臺(tái)上，滴加核黃素溶液20～40min，并在波長(zhǎng)為365nm的紫外燈下照射30～60min，然后生理鹽水、蒸餾水分別沖洗，制成核黃素交聯(lián)的豬角膜脫細(xì)胞支架；

(3)將步驟(2)制得的交聯(lián)的豬角膜脫細(xì)胞支架經(jīng)脫水、滅菌，4℃保存待用。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的myroilysin酶溶液，采用如下方法制備：

(i)將經(jīng)過(guò)活化的深海細(xì)菌(myroidesprofundi)d25菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，14～16℃發(fā)酵培養(yǎng)70～75h；將發(fā)酵液離心取上清液，向上清液中加入硫酸銨至硫酸銨飽和度為60％，收集沉淀，經(jīng)tris-hcl重懸、透析后離心，再經(jīng)離子交換層析分離純化，g75分子篩分離純化，制得彈性蛋白酶myroilysin粗酶液；

(ii)將步驟(i)制得的彈性蛋白酶myroilysin粗酶液經(jīng)截留分子量為10000da的超濾管超濾濃縮，制得濃縮液，然后添加質(zhì)量百分比15％的甘油，分裝保存在-80℃，即得。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(i)中，離子交換層析為用deae陰離子柱通過(guò)0～0.8m的nacl梯度洗脫分離純化。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(ii)中，濃縮液中myroilysin酶的濃度為1.8～2.2mg/ml。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，稀釋的myroilysin酶溶液為用ph9.0的50mmtris-hcl緩沖液稀釋myroilysin酶溶液，制得甘油體積百分比占18～22％、myroilysin酶質(zhì)量濃度為100～1000μg/ml的myroilysin酶溶液。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(1)中，myroilysin酶質(zhì)量濃度為100μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理18h；myroilysin酶質(zhì)量濃度為300μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理16h；myroilysin酶質(zhì)量濃度為500μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理16h；myroilysin酶質(zhì)量濃度為800μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理10h；myroilysin酶質(zhì)量濃度為1000μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理10h。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，豬角膜基質(zhì)板層與稀釋的myroilysin酶溶液的質(zhì)量體積比為1：20～30。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，處理為在轉(zhuǎn)速為80rpm的條件下震蕩處理。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，核黃素溶液的濃度為1mg/ml。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，脫水為在無(wú)菌甘油中脫水22～28h。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，滅菌為在20k的條件下輻照滅菌。

有益效果

1、在角膜中，膠原纖維束構(gòu)成片狀緊密相連形成透鏡結(jié)構(gòu)，角膜的主要成分是膠原。海洋彈性蛋白酶myroilysin具有膨脹但不降解膠原蛋白的特性，可有效去除細(xì)胞及單性蛋白成分；因此，本發(fā)明制得的脫細(xì)胞支架仍保留足夠的機(jī)械強(qiáng)度，并且形成了一定的孔隙，脫水后透明度較高，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移；

2、通過(guò)海洋彈性蛋白酶myroilysin制備豬角膜脫細(xì)胞支架，不結(jié)合任何物理方法或化學(xué)試劑，屬于單純的酶法。該方法制得的脫細(xì)胞支架無(wú)細(xì)胞毒性，具有更良好的生物相容性；與人工材料相比，其物理化學(xué)性質(zhì)與天然角膜更為相似，由于材料與正常角膜一致，因而移植后可以更好地行使角膜的生物學(xué)功能，促進(jìn)機(jī)體角膜的重建，為角膜脫細(xì)胞基質(zhì)組織工程支架的臨床應(yīng)用和推廣奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明：

圖1.豬角膜脫細(xì)胞支架的照片；

其中：a：豬角膜脫細(xì)胞支架在甘油脫水前；b：豬角膜脫細(xì)胞支架在甘油中脫水24h后；

圖2.豬角膜脫細(xì)胞支架的蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，he染色)染色照片；

其中：a：天然豬角膜基質(zhì)；b：100μg/mlmyroilysin在37℃下處理18h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；c：200μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；d：300μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；e：500μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；f：800μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；g：1000μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；h：1500μg/mlmyroilysin在37℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；i：100μg/mlmyroilysin在20℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；j：100μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；k：200μg/mlmyroilysin在25℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；l：200μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；

圖3：通過(guò)其他處理方法制備的豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)的蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，he染色)染色照片；

其中：a：通過(guò)超純水及2mnacl，0.2％tritonx-100處理制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；b：通過(guò)0.5％sds處理制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；c：通過(guò)0.25％胰酶及1％tritonx-100制備的豬角膜脫細(xì)胞支架；

圖4.豬角膜脫細(xì)胞支架的掃描電鏡圖；

其中：a：天然豬角膜基質(zhì)；b：豬角膜脫細(xì)胞支架。

圖5.豬角膜脫細(xì)胞支架及天然豬角膜的透明度檢測(cè)曲線圖；

其中：npc：天然豬角膜；apcs：豬角膜脫細(xì)胞支架；

圖6.豬角膜脫細(xì)胞支架及天然豬角膜的穩(wěn)定性檢測(cè)曲線圖；

其中：n：天然豬角膜，m：豬角膜脫細(xì)胞支架，0：ⅰ型膠原酶緩沖液，c：ⅰ型膠原酶；

圖7.豬角膜脫細(xì)胞支架的細(xì)胞相容性熒光觀察照片；

圖8.新西蘭兔角膜板層缺損模型的建立照片；

其中：a：使用負(fù)壓環(huán)鉆在新西蘭兔角膜正中央做200μm深度的環(huán)形切口；b：隧道刀沿切口切除中央?yún)^(qū)域角膜板層，制成新西蘭兔角膜板層缺損模型；

圖9.新西蘭兔角膜板層移植的術(shù)后恢復(fù)照片；

其中：a：板層移植手術(shù)后一周；b：板層移植手術(shù)后一個(gè)月；c：板層移植手術(shù)后兩個(gè)月。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

生物材料來(lái)源：

實(shí)施例中所述深海適冷菌(myroidesprofundi)d25，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)cctccm2012534。

實(shí)施例1：myroilysin的提取和純化

1.彈性蛋白酶myroilysin的制備方法，具體包括如下步驟：

myroilysin粗酶液的制備

按照實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法，將深海適冷菌myroidesprofundid25接種于液體種子培養(yǎng)基中，在15℃條件下震蕩培養(yǎng)2天，活化菌種。

將上述步驟活化的菌種按1％(v/v)的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在15℃，180rpm的條件下，震蕩培養(yǎng)72小時(shí)，制得發(fā)酵液。

按照實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法，將上述制得的發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨沉淀、重懸、透析、deae陰離子交換，制得myroilysin粗酶液。

2.myroilysin濃縮酶溶液的制備

將上述步驟獲得的myroilysin粗酶液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮后g75分子篩層析分離，獲得去除大部分色素的myroilysin溶液。再將myroilysin溶液超濾濃縮，補(bǔ)加甘油至總體積的15％，分裝保存于-80℃。

實(shí)施例2：角膜脫細(xì)胞支架制備方法

豬角膜脫細(xì)胞支架的制備方法，具體包括如下步驟：

取新鮮豬眼球，并將豬眼球固定在案板上，豬角膜朝向正上方。使用負(fù)壓環(huán)鉆在豬角膜正中央做深度約200μm的環(huán)形切口，隧道刀及刀片將角膜板層剝離下來(lái)，放置于生理鹽水中；

將濃縮的myroilysin溶液用50mmtris-hcl(ph9.0)稀釋至200μg/ml，其中甘油含量為總體積的20％。將角膜板層放置于myroilysin溶液中，在37℃下處理16h，轉(zhuǎn)速為80rpm，制得豬角膜脫細(xì)胞支架；

蒸餾水將豬角膜脫細(xì)胞支架淋洗干凈，再用生理鹽水振蕩洗滌3次，每次30min；蒸餾水振蕩洗滌3次，每次30min。

將豬角膜脫細(xì)胞支架在20k輻照下滅菌后，放置于4℃條件下，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

結(jié)果分析

天然豬角膜經(jīng)過(guò)myroilysin處理16h后，厚度增加，透明度降低(見(jiàn)圖1a,c)；經(jīng)甘油脫水24h后，透明度基本恢復(fù)(見(jiàn)圖1b,d)；he染色觀察表明天然豬角膜中上皮細(xì)胞層及基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞(見(jiàn)圖2a)經(jīng)脫細(xì)胞過(guò)程后，基本被去除干凈(見(jiàn)圖2b～h)。通過(guò)sem觀察，發(fā)現(xiàn)天然豬角膜支架中膠原纖維排列整齊呈束狀(見(jiàn)圖4a)；豬角膜脫細(xì)胞支架的膠原纖維并沒(méi)有嚴(yán)重?cái)嗔?，并且與天然豬角膜基質(zhì)相比，豬角膜脫細(xì)胞支架的膠原纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松(見(jiàn)圖4b)。

實(shí)施例3：脫細(xì)胞角膜支架物化和生理特性檢測(cè)

1.豬角膜脫細(xì)胞支架的透明度檢測(cè)

將豬角膜脫細(xì)胞支架及天然豬角膜放置在96孔板上，以10nm為間隔，檢測(cè)在300～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，豬角膜脫細(xì)胞支架的透明度變化；

2.豬角膜脫細(xì)胞支架的穩(wěn)定性檢測(cè)

ⅰ型膠原酶的緩沖液為含有5mmca²⁺的pbs緩沖液，將500μg/mlⅰ型膠原酶溶于ⅰ型膠原酶溶液中，得到ⅰ型膠原酶溶液。

將豬角膜脫細(xì)胞支架及天然豬角膜分別浸泡在ⅰ型膠原酶溶液及ⅰ型膠原酶緩沖液中，每2h微量天平檢測(cè)豬角膜脫細(xì)胞支架及天然豬角膜的殘余質(zhì)量，計(jì)算降解速率。

3.豬角膜脫細(xì)胞支架的細(xì)胞相容性檢測(cè)

人角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液為含15％胎牛血清及50μg/mlbfgf的dmem/f12培養(yǎng)液；

將豬角膜脫細(xì)胞支架浸泡在人角膜支架細(xì)胞培養(yǎng)液中，浸泡3天后，按照每孔2.5×10⁴個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種人角膜支架細(xì)胞。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)3天后，福爾馬林固定豬角膜脫細(xì)胞支架，取豬中央部位制備冰凍切片，300μg/mldapi避光染色10min后，pbs清洗兩次，每次5min。將切片放置在熒光顯微鏡下，觀察人角膜基質(zhì)細(xì)胞在豬角膜脫細(xì)胞支架中的生長(zhǎng)狀況。

結(jié)果分析

甘油脫水后，豬角膜脫細(xì)胞支架保持較高的透明度(見(jiàn)圖5)。在ⅰ型膠原酶溶液中，豬角膜脫細(xì)胞支架的降解速率略快于天然豬角膜，穩(wěn)定性略差于天然豬角膜(見(jiàn)圖6)。培養(yǎng)3天后，人角膜基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入豬角膜脫細(xì)胞內(nèi)部(見(jiàn)圖7)，說(shuō)明豬角膜脫細(xì)胞支架可以支撐人角膜基質(zhì)細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)，有良好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例4：豬角膜脫細(xì)胞支架的交聯(lián)及新西蘭兔角膜缺損模型建立和板層移植效果檢測(cè)

1.豬角膜脫細(xì)胞支架的核黃素交聯(lián)處理

將豬角膜脫細(xì)胞支架放置在鉆臺(tái)上，每3min滴加核黃素溶液，共計(jì)30min；再將豬角膜脫細(xì)胞支架及鉆臺(tái)放置在波長(zhǎng)為365nm的紫外燈下，紫外強(qiáng)度為3000μw/cm²。每5min滴加核黃素溶液，共計(jì)50min。蒸餾水將交聯(lián)支架淋洗干凈，放置在生理鹽水中振蕩洗滌3次，每次30min；蒸餾水振蕩洗滌3次，每次30min，制成核黃素交聯(lián)的豬角膜脫細(xì)胞支架。

蒸餾水將交聯(lián)支架淋洗干凈，放置在生理鹽水中振蕩洗滌4次，每次20min；蒸餾水振蕩洗滌4次，每次20min；

將制得的交聯(lián)的豬角膜脫細(xì)胞支架脫水、滅菌，4℃保存待用。

2.3％戊巴比妥鈉溶液按照1.5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉新西蘭兔。常規(guī)消毒鋪巾，剪除第三眼瞼。用直徑7.0mm的負(fù)壓環(huán)鉆在新西蘭兔角膜正中央制備深度約200nm的環(huán)形切口(見(jiàn)圖8a)，隧道刀沿切口切除中央?yún)^(qū)域角膜，制成新西蘭兔角膜板層缺損模型(見(jiàn)圖8b)。

3.將交聯(lián)的豬角膜脫細(xì)胞支架植片放置在無(wú)菌生理鹽水中復(fù)水3min，環(huán)鉆固定植片直徑為7.0mm。將植片覆蓋在板層缺損的新西蘭兔角膜植床上，10-0手術(shù)線縫合12針。術(shù)畢涂氧氟沙星眼膏。

術(shù)后每天滴地新滴眼液。觀察新西蘭兔的恢復(fù)情況。

結(jié)果分析

豬角膜脫細(xì)胞支架板層移植一周后，新西蘭兔角膜未發(fā)現(xiàn)明顯紅腫、溶解、新生血管等癥狀(見(jiàn)圖9a)；移植一個(gè)月后，豬角膜脫細(xì)胞支架植片從邊緣開(kāi)始透明化，呈現(xiàn)了良好的恢復(fù)趨勢(shì)(見(jiàn)圖9b)；移植三個(gè)月后，豬角膜脫細(xì)胞支架植片大體恢復(fù)透明(見(jiàn)圖9c)。

實(shí)施例5

使用實(shí)施例1制備的myroilysin濃縮酶溶液按照實(shí)施例2的步驟制備豬角膜脫細(xì)胞支架，不同之處在于，分別按照如下條件進(jìn)行反應(yīng)：

a.用100μg/mlmyroilysin在37℃下處理18h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(如圖2-b所示)；

b.用300μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(如圖2-d所示)；

c.用500μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(如圖2-e所示)；

d.用800μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(如圖2-f所示)；

e.用1000μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(如圖2-g所示)；

f.用1500μg/mlmyroilysin在37℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(如圖2-h所示)。

以上制備方法脫細(xì)胞效果較好，與最終選取方案效果相似。因使用的酶濃度較低，時(shí)間較短，因此選取了200μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h為最終處理方案。

對(duì)比例1

使用實(shí)施例1制備的myroilysin濃縮酶溶液按照實(shí)施例2的步驟制備豬角膜脫細(xì)胞支架，不同之處在于，分別按照如下條件進(jìn)行反應(yīng)：

a.用100μg/mlmyroilysin在25℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(見(jiàn)圖2-i)；

b.用100μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(見(jiàn)圖2-j)；

c.用200μg/mlmyroilysin在25℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(見(jiàn)圖2-l)；

d.用200μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h制備的豬角膜脫細(xì)胞支架(見(jiàn)圖2-k)；

以上制備方法去除基質(zhì)中細(xì)胞成分不徹底。