新趨化因子受體cxcr8的鑒別的制作方法
【專利說明】
[0001] 有關(guān)聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
[0002] 本發(fā)明是依據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院(化tional Institutes of Health)的授權(quán)號 R01-AI093548在政府的支持下提出。美國政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
[0003] 有關(guān)序列表的參考
[0004] 序列表是W名為"1279588SE化1ST"的ASCII文本文件與本發(fā)明一起提交，該序列 表于2014年9月30日創(chuàng)建，并且大小是51千字節(jié)。序列表全文通過引用并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明設(shè)及趨化因子巧化17及其受體巧CR8/GPR35。
【背景技術(shù)】
[0006] 人趨化因子超家族包括某些48種配體和19種已知的受體。大部分配體的受體已得 到鑒別，但有一些仍是"孤兒(0巧han)"(l)。趨化因子(C-X-C基序)配體17(CX化17)是描述 的最新趨化因子配體(2)。發(fā)明人先前報道，CXCL17是在特發(fā)性肺纖維化（IPF)患者的支氣 管肺泡灌洗液中顯著上調(diào)的粘膜相關(guān)趨化因子(3)。重要的是，它還是受體尚未得到鑒別的 少數(shù)"孤兒"趨化因子配體之一(另一個是CX化14) (1)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 趨化因子是引導(dǎo)白細胞和其它細胞在體內(nèi)運輸?shù)内吇约毎蜃蛹易?。趨化因?結(jié)合到在祀細胞表面上表達的G蛋白偶合受體(GPCR)，由此起始細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)級聯(lián)并誘 導(dǎo)趨化作用。盡管大多數(shù)趨化因子的同源受體已經(jīng)得到表征(4)，但最近報道的趨化因子配 體CX化17的受體仍不明確。如本文所描述，已顯示GPR35是CX化17的受體。已知CX化17可對 巨隧細胞和樹突狀細胞發(fā)揮趨化作用（2KGPR35是由CXCL17反應(yīng)性人單核細胞、樹突狀細 胞(DC)表達或在其上表達，并且在THP-1單核細胞樣細胞系中有表達。另外，如通過巧調(diào)動 檢驗所測量，將GPR35轉(zhuǎn)染到Ba/F3細胞中使運些細胞對CX化17起反應(yīng)。CX化17是在粘膜組 織中表達的趨化因子(3) ;GPR35表達反映了運一粘膜表達模式。GPR35還展現(xiàn)出趨化因子受 體的若干結(jié)構(gòu)特征，包括DRY盒及ΤχΡ基序。由此得出結(jié)論，GPR35是一種新的趨化因子受體， 并因此提出應(yīng)當(dāng)將其命名為趨化因子(C-X-C基序)受體8(CXCR8)dGPR35與人類疾病有關(guān)； GWAS研究已將其與炎性腸病（I抓)聯(lián)系在一起巧）。總的說來，運些觀察結(jié)果有力地表明，運 一新的粘膜趨化因子CX化17/CXCR8軸是呼吸系統(tǒng)或消化系統(tǒng)病理生理學(xué)或發(fā)炎過程中治 療干預(yù)的重要祀標(biāo)。該配對在人體中得到證實，而且在不同物種中對應(yīng)物將W類似方式配 對。不同物種的對應(yīng)物可能配對，并且可能顯示正常的交叉反應(yīng)性，或可能具有與天然配對 不同的親和力或信號傳導(dǎo)能力。
[0008] 在一方面，提供了一種治療受試者的與CXCR8信號傳導(dǎo)增加相關(guān)的病癥的方法。該 方法包括破壞受試者體內(nèi)由配體CX化17引起的受體CXCR8的活化。在所述方法中：a)所述破 壞可W包括向受試者施用干擾CX化17與CXCR8的結(jié)合的物質(zhì);b)所述病癥可W是胃腸病癥、 呼吸系統(tǒng)病癥、代謝病癥、感染性病癥或腫瘤病癥，在具體實施方案中，該病癥可w是肺、消 化系統(tǒng)或生殖系統(tǒng)炎性疾?。籆)此類炎性疾病的實例包括但不限于，克羅恩氏病(Crohn's disease, CD)、原發(fā)性硬化性膽管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脂瀉病或腸易激綜合癥（IBS)、潰瘍、缺 血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎、乳糜瀉、支氣管肺發(fā)育異常、特發(fā)性肺纖維化、過敏性肺炎、非 特異性間質(zhì)性肺炎、慢性阻塞性肺病、肺炎、哮喘、支氣管炎、肺氣腫、亞臨床間質(zhì)性肺病(亞 臨床ILD)、囊性纖維化、肉樣瘤病、子宮內(nèi)膜異位、平滑肌瘤、子宮腺肌病、細菌性陰道炎，或 者尿道感染或炎癥;d)或a)-c)的任何組合。
[0009]在另一方面，提供了一種篩選破壞受體CXCR8與配體CX化17之間的締合的物質(zhì)的 方法。該方法包括將CX化17添加到表達CXCR8的細胞中，及測量在所述物質(zhì)存在下細胞中 CXCR8信號傳導(dǎo)的減少。舉例來說，可W使用實施例中描述的Ba/F3細胞系的CXCR8轉(zhuǎn)染子來 篩選CXCR8/CX化17相互作用的激動劑和括抗劑。
[0010]在又一方面，提供了一種篩選破壞受體CXCR8與配體CX化17之間的締合的物質(zhì)的 方法。該方法包括將CX化17添加至化XCR8中，及測量在所述物質(zhì)存在下CX化17與CXCR8結(jié)合 的減少。
[0011]在本文所描述的運些或其它方法中，所述物質(zhì)可W是:a)結(jié)合到CX化17或CXCR8的 抗體或其片段;b)展現(xiàn)CXCL17的天然或變體序列的多膚;c)CXCL17的非膚偶聯(lián)變體;d)結(jié)合 到CX化17或CXCR8的小分子;e)結(jié)合到CX化17或CXCR8的適體;或a) - e)的任何組合。
[0012]在其它方面，提供W下內(nèi)容：
[0013] a)提供了 CXCR8的配體，其中所述配體選擇性結(jié)合到CXCR8受體。該配體可W是通 過所述受體進行信號傳導(dǎo)的配體，如激動劑；對少于85%、90%、95%或更高百分比的人 CX化17進行信號傳導(dǎo)的配體，如括抗劑;反向激動劑(抑制CXCR8的基礎(chǔ)活性的激動劑）；別 構(gòu)調(diào)節(jié)物（改變CXCR8的信號傳導(dǎo)活性，但不干擾該配體(CXCL17)的結(jié)合的調(diào)節(jié)物）；與人 CX化17具有至少約85%、90%、95%或更高序列同一性的配體，如突變蛋白；包含了與人 CX化17展現(xiàn)至少94%同一性的具有至少17、19、23、27、31或更多個氨基酸的區(qū)段的配體； 和/或結(jié)合到靈長類動物的CXCR8受體的配體。所述配體可呈無菌組合物形式;被配制用 于全身或局部施用；呈治療性組合物形式;處于單劑量容器中；和/或與人CX化17具有至少 90%序列同一性。在與人CX化17包括約85%、90%、95%或更高序列同一性的一些實施方案 中，運些實施方案不包括與天然存在的人CX化17序列同一的序列。
[0014] b)提供了選擇性結(jié)合到CXCR8的配體的抗體。該抗體可W阻斷與CXCR8受體的結(jié) 合;和/或阻斷由CXCR8受體進行的信號傳導(dǎo)。
[0015] C)提供了人CXCL17的受體或結(jié)合蛋白。該受體或結(jié)合蛋白可在結(jié)合所述人 CX化17后進行進一步信號傳導(dǎo)；與人CXCR8相比較，在結(jié)合CX化17后對至少約80%的信號進 行信號傳導(dǎo)；與人CXCR8具有至少約95%同一性；和/或結(jié)合到靈長類動物CX化17。在與人 CXCR8包括至少約95 %或更高序列同一性的一些實施方案中，運些實施方案不包括與天然 存在的人CXCR8序列同一的序列。
[0016] d)還提供了一種抑制CX化17通過CXCR8進行的信號傳導(dǎo)的方法。該方法包括:曰)使 CXCR8 (受體)與CX化17 (配體)括抗劑接觸;b)使CX化17 (配體)與阻斷劑接觸;和/或C)使表 達CXCR8的細胞與細胞信號傳導(dǎo)阻斷劑接觸。CX化17 (配體）括抗劑可W選自：a)結(jié)合到 CXCR8(受體)的抗體(或其片段)或物種變體;b)CXCL17(趨化因子)變體(例如結(jié)合但不進行 信號傳導(dǎo);包括物種變體及對應(yīng)物）；或C)小分子化合物。阻斷劑可W選自：a)結(jié)合到CX化17 的抗體(或其片段）（例如趨化因子并阻斷結(jié)合;包括物種變體）；b)所述受體的片段，該片段 可W是該受體的可溶性部分;和/或C)小分子化合物。細胞信號傳導(dǎo)的阻斷劑可W是:a)信 號傳導(dǎo)路徑成員的例如RNAi、CRISPR、TALEN化合物;b)阻斷信號傳導(dǎo)路徑的抗體;或C)小分 子化合物。
[0017] e) -種誘導(dǎo)CXCR8(受體)信號傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述受體與其同源配 體接觸，該配體可W是CXCL17或其激動劑。該激動劑可W是CXCL17的多膚序列變體或 CX化17的非膚偶聯(lián)變體，或其片段。
[0018] f) 一種篩選所述CX化17括抗劑的方法，其中所述篩選使用了利用巧光成像板讀取 器(fluorescent imaging plate reader JLIPR)或相關(guān)檢測系統(tǒng)的基于細胞的檢驗，包括 選自W下各項的檢驗:FLIPR、基于細胞的檢驗、生物化學(xué)檢驗等等。在所述方法中，所述篩 選可W針對一種或多種化合物，運些化合物包括：i)結(jié)合到CX化17的抗體，包括物種變體或 對應(yīng)物；ii)CX化17的多膚序列變體，包括物種變體；iii)CX化17的非膚偶聯(lián)變體，例如糖基 化或其它修飾;iv)小分子括抗劑候選物;或V)適體文庫。
[0019] g) -種篩選（f)中所述的阻斷劑的方法，其中所述篩選使用了如F LIPR(參見 World Wide Web的mo 1 eculardevices.com/Products/Instrum ents/FLIPR- Systems . html)、基于細胞的檢驗或生物化學(xué)檢驗等檢驗；i)結(jié)合到CXCR8的抗體或物種變 體；i i) CX化17的多膚序列變體，例如可溶性受體片段或物種變體；i i i)CX化17的非膚偶聯(lián) 變體，如糖基化或其它修飾;iv)小分子括抗劑候選物;和/或V)適體文庫。
[0020] h)-種篩選所述CX化17括抗劑或阻斷劑的方法，其中使用了 Ba/F3細胞系的CXCR8 轉(zhuǎn)染子來篩選CXCR8/CX化17相互作用的激動劑和括抗劑。在某些實施方案中，所述篩選使 用了利用FLira或相關(guān)檢測系統(tǒng)的基于細胞的檢驗，該檢驗可W是基于細胞的檢驗、生物化 學(xué)檢驗等等。在其它實施方案中，所述篩選是針對一種或多種化合物，運些化合物包括:a) 結(jié)合到CX化17的抗體或物種變體;b)CX化17的多膚序列變體或物種變體;c)CX化17的非膚 偶聯(lián)變體，包括糖基化或其它修飾;d)小分子括抗劑候選物;或e)適體文庫。類似地提供了 一種方法，其中所述篩選使用了化IPR、基于細胞的檢驗或生物化學(xué)檢驗。另外的實施方案 包括了所述篩選針對一種或多種化合物的情形，運些化合物包括:a)結(jié)合到CXCR8的抗體或 物種對應(yīng)物或變體;b)CX化17的多膚序列變體，包括可溶性受體片段和物種對應(yīng)物或變體； c)CX化17的非膚偶聯(lián)變體，包括糖基化或其它修飾;d)小分子括抗劑候選物;或適體文庫。 在一個具體實施方案中，使用了 Ba/F3細胞系的CXCR8轉(zhuǎn)染子來篩選CXCR8/CX化17相互作用 的激動劑或括抗劑。
[0021] i)與CXCR8信號傳導(dǎo)增加相關(guān)并能夠通過所述方法治療的各種胃腸病癥包括:a) 克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎化C)、脂瀉病或腸易激綜合癥(IBS)、缺血性結(jié)腸炎、放射性 結(jié)腸炎、脂瀉病;b)胃癌、膜腺癌、結(jié)腸直腸癌或肝細胞癌、食道癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胃 腸間質(zhì)瘤;C)自體免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、其它(非自體免疫性)肝硬化、原發(fā)性 硬化性膽管炎或肝纖維化;或d)丙型肝炎病毒化CV)介導(dǎo)的肝硬化、由幽口螺桿菌引起的消 化性潰瘍。參見例如，化user,S.C.Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review,第四版,Mayo Clinic Scientific Press,2013;Hawkey等人,Clinical and Gastroenterology and Hepatology,第二版，Wiley-Blackwell,2012;及Yamada T.等人， Yamada's 化η化ook of Gastroenterology,第3版，Wil巧-Blackwell,2013。
[0022] j)與CXCR8信號傳導(dǎo)增加有關(guān)并能夠通過所述方法治療的代謝病癥包括1型糖尿 病或2型糖尿病。參見例如，F(xiàn)onseca, V.A. Clinical Diabetes .Elsevier ,2012。
[0023] k)與CXCR8信號傳導(dǎo)增加有關(guān)并能夠通過所述方法治療的致癌性代謝病癥包括白 血病、淋己瘤或成膠質(zhì)細胞瘤，或相關(guān)腦腫瘤。參見例如，Mughal，Τ. I .Understanding Leukemias , Lymphomas and Myelomas ,第2片反，Informa 2012;及Kaye , A .H.和Laws E.R.Jr.Brain Tumors,第3版,Elsevier 2012。
[0024] 1)與CXCR8信號傳導(dǎo)增加有關(guān)并能夠通過所述方法治療的呼吸系統(tǒng)病癥可W選 自：a)肺癌(6)，包括小細胞(7)或非小細胞肺癌(8)或間皮瘤(9)(惡性）;b)特發(fā)性肺纖維化 (10)、過敏性肺炎（11)或非特異性間質(zhì)性肺炎;C)與間質(zhì)性肺病有關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病，包括 自體免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或硬皮病;d)慢性阻塞性肺病(C0PDK12)、支氣管肺發(fā) 育異常(BPD) (13)，或哮喘（14);和/或e)其它呼吸系統(tǒng)癌癥，包括氣管癌、喉癌、食道癌、支 氣管癌或鼻/竇癌。參見例如，Judd, S,J,Respiratory Disorders Sourcebook,第2版， Health Reference Series ,2012;及Lechner,A.Respiratory,An integrated approach to disease;McGrawHi11 LANGE,2012。
[0025] m)所述施用可W是a)局部、局部性或全身性的;b)W氣霧劑或薄霧形式吸入;或c) 與另一治療劑組合。
[0026] η)提供了一種疫苗，該疫苗包含CX化17激動劑例如作為佐劑和/或激動劑，或包含 正別構(gòu)調(diào)節(jié)物，也就是說，提供了無改變受體(CXCR8)的信號傳導(dǎo)能力的激動劑或括抗劑活 性(對于CX化17)的分子。該疫苗可W包括保護性抗原，如針對乙型肝炎、人乳頭瘤病毒、DPT 和/或麻疹病毒的疫苗中的那些。在一些情形中，祀抗原是腫瘤相關(guān)抗原(包括選自W下癌 癥的腫瘤:肺癌、膜腺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、軟組織肉瘤和/或成膠質(zhì) 細胞瘤），或在彌散性白血病和淋己瘤中。所述疫苗可W用于選自肺癌、膜腺癌、結(jié)腸直腸 癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、軟組織肉瘤或成膠質(zhì)細胞瘤的癌癥。所述疫苗可W施用給受 試者。參見例如，Pl〇tnA，S.A.等人，化ccines,第6版，Elsevier 2012。在其它實施方案中， 所述疫苗可W包括能夠抑制耐受性細胞募集的適合濃度的CX化17括抗劑。
[0027] 0) -種調(diào)節(jié)受試者升高的血壓的方法，所述方法包括施用適量的CXCR8激動劑W 調(diào)節(jié)所述血壓。在一些實施方案中，升高的血壓可W是高血壓。所述激動劑可W選自：a)重 組人CX化17;b)人CX化17的多膚變體(包括物種變體）；c)CX化17的非膚偶聯(lián)變體(例如糖基 化或其它修飾）。
[00%] P)-種募集巨隧細胞或樹突狀細胞的方法，所述方法包括施用CXCR8括抗劑(例如 并收集所述細胞）；所述方法可W另外包括施用CCR2激動劑，如CCL2，定義為在表達CCR2的 細胞中引起巧流動的分子。
[0029] q) -種使用CXCR8作為人類疾病發(fā)病機理中所設(shè)及的細胞標(biāo)記物的方法，所述疾 病包括胃腸疾病、代謝疾病及呼吸系統(tǒng)疾病和癌癥，所述CXCR8是白血病、淋己瘤、胃癌、結(jié) 腸直腸癌或膜腺癌的轉(zhuǎn)移性細胞的生物標(biāo)記物、包括小細胞或非小細胞肺癌在內(nèi)的肺癌或 惡性間皮瘤的轉(zhuǎn)移性細胞的生物標(biāo)記物，或浸潤性胃腸道或呼吸系統(tǒng)癌癥的細胞的預(yù)后生 物標(biāo)記物。
[0030] r)一種治療或預(yù)防動脈粥樣硬化（參見例如，George , S.J. Atherosclerosis : Molecular and Cellular Mechanisms,Wiley-Blackwell 2012)，或者治療或預(yù)防多發(fā)性 硬化（參見例如，Hoi land, N.等人,Multiple Sclerosis,第4 版,Demos Health, 2012)的方 法，所述方法包括向受試者施用有效量的：a)CXCR8括抗劑；或CXCR8表達的抑制劑；或b) CXCL17括抗劑；或CXCL17表達的抑制劑。CXCR8括抗劑可W選自：a)結(jié)合至化XCR8的抗體(或 物種變體;例如結(jié)合但不傳送信號）；b)CX化17的多膚序列變體(例如可溶性受體片段;物種 變體）；c)CX化17的非膚偶聯(lián)變體（例如糖基化或其它修飾）；d)小分子括抗劑；或e)適體。 CXCR8表達或下游信號傳導(dǎo)的抑制劑可W使用RNAi、CRISPR、TALEN化合物等。CX化17括抗劑 可W選自：a)結(jié)合到CX化17的抗體(或物種變體;結(jié)合但不傳送信號）；b)CX化17的多膚序列 變體(包括物種變體）；c)CX化17的非膚偶聯(lián)變體(例如糖基化或其它修飾）；d)小分子括抗 劑;或e)適體。CX化17表達或信號傳導(dǎo)的抑制劑可W使用RNAi、CRISPR、TALEN化合物等。
[0031] S) -種抑制CX化17通過CXCR8進行的信號傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使用抑制 CXCR8(受體)表達的RNAi、CRISPR或TALEN化合物來減少CXCR8受體。同樣，一種抑制CX化17 通過CXCR8進行的信號傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使用抑制CX化17[配體]表達的RNAi、 CRISPR或TALEN化合物來減少CX化17。
[0032] t) 一種分離表達CXCR8的細胞的方法，該方法包括將抗CXCR8抗體與外周血單核細 胞制劑混合，及分離所述抗體所結(jié)合的CXCR8陽性細胞。在所述方法中，抗CXCR8抗體可W是 單克隆抗體、中和抗體或人源化抗體，或其組合;該分離可W通過巧光活化細胞分選進行； 和/或該分離可W通過磁珠分離進行。
[0033] 在包括治療受試者的與CXCR8信號傳導(dǎo)增加相關(guān)的病癥的方法在內(nèi)的方法的一些 實施方案中，所述物質(zhì)、激動劑或括抗劑不包括W下各物:犬尿哇嘟酸、2-酷基溶血憐脂酸、 色甘酸、雙香豆素、毛地黃黃酬、尼氣滅酸、NPPB、雙徑糞酸鹽及帕莫酸(pamoic acid)、搬皮 酬、酪氨酸憐酸化抑制素（地7巧11〇31:;[]1)-51、扎普司特^日91'；[]1日31:)、]\1]^144、]\1]^145或〔10- 2765487ο
[0034] 在本申請通篇，分子GPR35又稱為巧CR8。
[0035] 受試者可W是人類或其它動物，并且典型地是靈長類動物或哺乳動物。
[0036] 來自各種物種的CX化17的序列具有W下登錄號（全部通過引用并入本文中）： HGNC: 19232(人CX化17KHUG0基因命名委員會數(shù)據(jù)庫；同源物:MGI :2387642(小鼠 Cxcll7) (MGI數(shù)據(jù)庫）；RGD: 1304717(大鼠 Cxcl 17) (RGD數(shù)據(jù)庫）；核巧酸序列：Ref Seq:匪 198477 (NCBI參考序列數(shù)據(jù)庫）；蛋白質(zhì)序列：UniProtKB:Q6UXB2化niProt Knowledgebase)。另參 見 GENBANK、NCBI、化 est、Swiss-p;rot、Unigene、Refseq、n;r-aa、PRF或PDBSTR。
[0037] 來自各種物種的CXCR8/GPR35的序列具有W下登錄號（全部通過引用并入本文 中）：HGNC:4492(人GPR35KHUG0基因命名委員會數(shù)據(jù)庫；同源物:MGI:1929509(小鼠 Gpr35) (MGI數(shù)據(jù)庫）；RGD:1309404(大鼠 Gpr35)(RGD數(shù)據(jù)庫）；核巧酸序列：RefSeq:醒 001195382 (NCBI參考序列數(shù)據(jù)庫）；蛋白質(zhì)序列：UniProtKB:Q9HC97化niProt Knowledgebase)。另參 見 GENBANK、NC