專(zhuān)利名稱(chēng)：由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物產(chǎn)品制造技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白在動(dòng)物皮膚、軟骨、骨骼、肌腱等組織中廣泛存在，是一組蛋白，已發(fā)現(xiàn)有近20種。真皮中80～85％為膠原蛋白，主要是I、III型膠原蛋白，骨骼三分之一的有機(jī)物中，絕大部分是I型膠原蛋白。天然膠原蛋白分子由三股螺旋多肽鏈纏繞組成，螺旋間以氫鍵結(jié)合，分子量大。膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸含量異常豐富。將膠原蛋白進(jìn)行水解，可得到較小分子量的膠原活性多肽，其水溶性增大，并保持了膠原蛋白的諸多優(yōu)良性質(zhì)，在醫(yī)學(xué)美容、化妝品、組織修復(fù)、手術(shù)止血、醫(yī)用膠囊、微膠囊、藥用、食品工業(yè)等眾多工業(yè)領(lǐng)域有重要應(yīng)用。
通常，膠原蛋白由牛、豬等家畜的皮膚、肌腱和骨骼中提取。近幾年，受世界范圍內(nèi)瘋牛病、口蹄疫等家畜流行病的影響，畜源性膠原蛋白的安全性引起了普遍擔(dān)憂。由禽源性動(dòng)物皮膚、骨骼、肌腱等組織中提取膠原蛋白，成為獲取天然膠原蛋白及其水解活性多肽的一條新途徑。目前對(duì)禽源性膠原蛋白的提取研究很少，對(duì)其水解多肽制品的研究未見(jiàn)報(bào)道。美國(guó)專(zhuān)利US 5138030(1992)提出了用酶法和有機(jī)酸溶解方法從禽類(lèi)組織中提取膠原蛋白的方法；美國(guó)專(zhuān)利US 0142368A1(2002)公開(kāi)了以雞、鵝等家禽皮、骨等組織為原料，在水介質(zhì)中進(jìn)行加熱處理來(lái)直接提取膠原蛋白的方法；中國(guó)臺(tái)灣D.C.Liu等在Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，14(11)1638-1644，2001中報(bào)道了用酸溶液浸取從雞腳中提取酸溶性膠原蛋白的方法?，F(xiàn)有的禽源性膠原蛋白提取技術(shù)得到的是膠原明膠，分子量大，常溫下水溶性差，而且明膠的純度低，收率不高。
對(duì)禽源性膠原明膠進(jìn)一步水解，可得到膠原多肽。目前針對(duì)禽源性膠原活性多肽的制備技術(shù)未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)畜源性膠原蛋白的水解已是公知技術(shù)，主要有堿法、酶水解法(例如中國(guó)專(zhuān)利CN1403585A，2003)和酸法(例如美國(guó)專(zhuān)利US4130555，1978)。這些方法各有利弊堿法易使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)破壞和變性而失去活性，尤其是大部分胱氨酸和半胱氨酸會(huì)被破壞，降低了膠原蛋白水解多肽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；酶法操作條件溫和，得到的產(chǎn)品屬分子量較集中的單一產(chǎn)品，但需要的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，條件控制嚴(yán)格，使用的酶是一次性的，成本往往較高，且易因所用的生物酶難于純化而使水解產(chǎn)物的分離困難；酸法水解迅速，可避免外消旋作用，減少水解多肽的損失，但得到的多肽分子量范圍較大，控制條件要求嚴(yán)格。禽源性天然膠原蛋白與畜源性膠原蛋白的不同主要體現(xiàn)在其膠原間交聯(lián)的緊密程度不同，禽源性膠原蛋白交聯(lián)較弱(美國(guó)專(zhuān)利US 0142368A1)。因此，禽源性膠原蛋白水解為活性多肽時(shí)，需要的水解技術(shù)和條件與公知的畜源性膠原蛋白水解技術(shù)不同，有特殊性的一面，需要進(jìn)行研究探索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法。
以鴨腳為原料，用1.0～5.0％稀酸液對(duì)原料進(jìn)行浸泡預(yù)處理，水洗后用60～85℃熱水抽提4～10小時(shí)得到膠原明膠提取液，將提取液濃縮至膠原蛋白濃度為5～25％(w/w)，加酸調(diào)節(jié)pH值為0.5～4.0，65～90℃水解3～8小時(shí)，加堿液中和至pH為7.0～8.0，離心得到膠原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)，充分?jǐn)嚢韬箪o置5～8小時(shí)，離心得多肽沉淀，經(jīng)減壓干燥，制得膠原活性多肽產(chǎn)品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)采用酸法水解，工藝簡(jiǎn)單迅速，成本低，且減少了水解多肽的損失，產(chǎn)品質(zhì)量好；(2)采用有機(jī)溶劑沉淀法，既分離得到水解多肽產(chǎn)品，又同時(shí)實(shí)現(xiàn)去雜、去色和去味，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量；(3)產(chǎn)品的氨基酸含量高；(4)通過(guò)控制適宜的水解條件，使膠原蛋白大分子斷裂為活性多肽，增加了膠原蛋白的水溶性，便于在化妝品、醫(yī)藥、食品等工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用具體的實(shí)施方式由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法，它的生產(chǎn)步驟如下(1)原料預(yù)處理與膠原明膠液的提取取鴨腳即鴨掌、鴨蹼、鴨腳梗為原料，清洗干凈，用稀酸液浸泡，水洗，然后用去離子水浸泡，所用酸為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸中的一種或多種配成的混合物，濃度1.0～5.0％，浸泡時(shí)間為400～480小時(shí)，水洗后pH值為4.0～6.0，去離子水浸泡時(shí)間為12～24小時(shí)，將預(yù)處理好的原料加入去離子水，在溫度60～85℃下進(jìn)行抽提，得到膠原明膠液，抽提時(shí)間為4～10小時(shí)；(2)膠原明膠液濃縮和酸法水解將所得的膠原明膠液過(guò)濾，然后于50～70℃、0.095～0.099MPa下減壓濃縮，使?jié)饪s液中膠原蛋白的濃度為5～25％(w/w)，直接用酸法進(jìn)行水解，所用的酸液為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸、草酸中的一種或多種配成的混合物，調(diào)節(jié)pH值為0.5～4.0，水解溫度為65～90℃，水解時(shí)間為3～8小時(shí)；(3)水解液中和與有機(jī)溶劑沉淀將水解液用堿液進(jìn)行中和至pH為7.0～8.0，靜置2～8小時(shí)，6000～8000rpm下離心15～20min，棄去沉淀，得到膠原多肽的水溶液，所用堿液為碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種；向所得的膠原多肽水溶液中加入有機(jī)溶劑將膠原多肽沉淀析出，在6000～8000rpm下離心15～20min，收集沉淀，所用的有機(jī)溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或多種配成的混合物，有機(jī)溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)；(4)干燥將所得沉淀于50～70℃下進(jìn)行干燥24～36小時(shí)，粉碎，或者配為溶液進(jìn)行噴霧干燥，得到粉末即為膠原多肽產(chǎn)品。
根據(jù)以上方法制得的膠原活性多肽收率為3.5～5.5％(干品/原料濕重)。
產(chǎn)品的指標(biāo)如下外觀白色略帶淡黃色粉末分子量2kDa～35kDa含氮量＞16％氨基酸總量＞90％重金屬含量＜10ppm水溶性＞15g/100mL水(25℃)1％水溶液pH值為6.5～7.0水分含量2.0～4.5％。
以上制備過(guò)程中，酸法水解適宜條件的控制和膠原水解多肽的分離純化是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)。
鴨是我國(guó)廣泛飼養(yǎng)的家禽。新鮮鴨腳原料來(lái)源廣，尤其在我國(guó)南方地區(qū)鴨腳資源豐富，很容易得到，價(jià)格便宜。鴨掌和鴨蹼中80％以上為天然膠原蛋白、其次為少量的脂肪、其它蛋白和水分等成分，鴨腳梗1/3有機(jī)物中絕大部分也是膠原蛋白，品質(zhì)優(yōu)良。本發(fā)明所用的鴨腳原料購(gòu)自浙江杭州。
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述實(shí)例1取鴨腳(鴨趾、鴨蹼和鴨腳梗)10000g，清洗干凈，于5.0％乙酸液中浸泡400小時(shí)，水洗pH值6.0，去離子水浸泡24小時(shí)。然后，在72℃熱水中抽提8小時(shí)，過(guò)濾，所得濾液于50℃、0.099MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為5％(w/w)，向濃縮液中加入檸檬酸調(diào)pH為3.5。于90℃下水解3小時(shí)，用碳酸鈉調(diào)pH值為7.0，靜置2小時(shí)，然后在8000rpm下離心20min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入有機(jī)溶劑混合物(丙酮和甲醇1∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為4∶1(v/v)，8000rpm下離心20min，棄上清液得沉淀，將沉淀于65℃干燥30小時(shí)，得膠原多肽粉末440g，膠原多肽收率為4.4％(干品/原料濕重)。
實(shí)例2取鴨腳梗2000g，清洗干凈，于3.0％檸檬酸液中浸泡480小時(shí)，水洗pH值5.0，去離子水浸泡16小時(shí)。然后，在85℃熱水中抽提4小時(shí)，過(guò)濾，所得濾液于55℃、0.099MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為15％(w/w)，向濃縮液中加入硫酸調(diào)pH為4.0。于68℃下水解7小時(shí)，用氫氧化鉀調(diào)pH值為7.5，靜置8小時(shí)，然后在8000rpm下離心15min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入有機(jī)溶劑混合物(丙酮和乙醇2∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為4.5∶1(v/v)，8000rpm下離心15min，棄上清液得沉淀，將沉淀于50℃干燥30小時(shí)，得膠原多肽粉末90g，膠原多肽收率為4.5％(干品/原料濕重)。
實(shí)例3取鴨腳750g，清洗干凈，于1.0％硫酸液中浸泡450小時(shí)，水洗pH值4.0，去離子水浸泡18小時(shí)。然后，在65℃熱水中抽提8小時(shí)，過(guò)濾，所得濾液于65℃、0.097MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為25％(w/w)，向濃縮液中加入乙酸和鹽酸混合液(乙酸和濃鹽酸6∶1，v/v)，調(diào)pH為0.5。于65℃下水解8小時(shí)，用碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.0，靜置8小時(shí)，然后在7000rpm下離心18min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入有機(jī)溶劑混合物(乙醇和異丙醇4∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為3∶1(v/v)，7000rpm下離心18min，棄上清液得沉淀，將沉淀于61℃干燥28小時(shí)，得膠原多肽粉末31g，膠原多肽收率為4.1％(干品/原料濕重)。
實(shí)例4取鴨蹼約40g，清洗干凈，4.0％鹽酸浸泡420小時(shí)，水洗，去離子水浸泡12小時(shí)，再水洗pH值5.0。60℃熱水抽提10小時(shí)，得提取液于50℃、0.095atm下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為10％(w/w)，向濃縮液中加入草酸與檸檬酸混合液(草酸和檸檬酸2∶1，v/v)，調(diào)pH約2.5。72℃下水解4小時(shí)，用氫氧化鈉調(diào)pH值為8.0。靜置5小時(shí)，然后在6000rpm下離心20min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入丙酮，與膠原多肽水溶液的比例為4∶1(v/v)，6000rpm下離心20min，棄上清液得沉淀，將沉淀于70℃干燥24小時(shí)，得膠原多肽粉末2.1g，膠原多肽收率為5.2％(干品/原料濕重)。
實(shí)例5取鴨腳4500g，清洗干凈，于3.5％鹽酸和乙酸液(重量比2∶1)中浸泡480小時(shí)，水洗pH值4.0，去離子水浸泡18小時(shí)。然后，在65℃熱水中抽提8小時(shí)，過(guò)濾，所得濾液于70℃、0.099MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為20％(w/w)。向濃縮液中加入乙酸和鹽酸混合液(乙酸和濃鹽酸6∶1，v/v)，調(diào)pH為1.5。于71℃下水解8小時(shí)，用碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.0，靜置8小時(shí)，然后在8000rpm下離心15min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入乙醇和異丙醇(2∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為5∶1(v/v)，7000rpm下離心20min，棄上清液得沉淀，將沉淀于55℃干燥36小時(shí)，得膠原多肽粉末220g，膠原多肽收率為4.8％(干品/原料濕重)。
權(quán)利要求
1.一種由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法，其特征在于以鴨腳為原料，用1.0～5.0％稀酸液對(duì)原料進(jìn)行浸泡預(yù)處理，水洗后用60～85℃熱水抽提4～10小時(shí)得到膠原明膠提取液，將提取液濃縮至膠原蛋白濃度為5～25％(w/w)，加酸調(diào)節(jié)pH值為0.5～4.0，65～90℃水解3～8小時(shí)，加堿液中和至pH為7.0～8.0，離心得到膠原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)，充分?jǐn)嚢韬箪o置5～8小時(shí)，離心得多肽沉淀，經(jīng)減壓干燥，制得膠原活性多肽產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法，其特征在于它的生產(chǎn)步驟如下(1)原料預(yù)處理與膠原明膠液的提取取鴨腳即鴨掌、鴨蹼、鴨腳梗為原料，清洗干凈，用稀酸液浸泡，水洗，然后用去離子水浸泡，所用酸為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸中的一種或多種配成的混合物，濃度1.0～5.0％，浸泡時(shí)間為400～480小時(shí)，水洗后pH值為4.0～6.0，去離子水浸泡時(shí)間為12～24小時(shí)，將預(yù)處理好的原料加入去離子水，在溫度60～85℃下進(jìn)行抽提，得到膠原明膠液，抽提時(shí)間為4～10小時(shí)；(2)膠原明膠液濃縮和酸法水解將所得的膠原明膠液過(guò)濾，然后于50～70℃、0.095～0.099MPa下減壓濃縮，使?jié)饪s液中膠原蛋白的濃度為5～25％(w/w)，直接用酸法進(jìn)行水解，所用的酸液為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸、草酸中的一種或多種配成的混合物，調(diào)節(jié)pH值為0.5～4.0，水解溫度為65～90℃，水解時(shí)間為3～8小時(shí)；(3)水解液中和與有機(jī)溶劑沉淀將水解液用堿液進(jìn)行中和至pH為7.0～8.0，靜置2～8小時(shí)，6000～8000rpm下離心15～20min，棄去沉淀，得到膠原多肽的水溶液，所用堿液為碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種；向所得的膠原多肽水溶液中加入有機(jī)溶劑將膠原多肽沉淀析出，在6000～8000rpm下離心15～20min，收集沉淀，所用的有機(jī)溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或多種配成的混合物，有機(jī)溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)；(4)干燥將所得沉淀于50～70℃下進(jìn)行干燥24～36小時(shí)，粉碎，或者配為溶液進(jìn)行噴霧干燥，得到粉末即為膠原多肽產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法，其特征在于最佳制備條件為所說(shuō)膠原明膠濃縮液中膠原蛋白的濃度為20％(w/w)；酸法水解時(shí)濃縮明膠液的pH值調(diào)為4.0，水解溫度71℃，水解時(shí)間8小時(shí)；有機(jī)溶劑沉淀步驟中，有機(jī)溶劑與膠原多肽水溶液的比例為5∶1(v/v)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種由禽源性動(dòng)物組織中制備膠原活性多肽的方法。以鴨腳為原料，用1.0～5.0％稀酸液對(duì)原料進(jìn)行浸泡預(yù)處理，水洗后用60℃～85℃熱水抽提4～10小時(shí)得到膠原明膠提取液，將提取液濃縮至膠原蛋白濃度為5～25％(w/w)，加酸調(diào)節(jié)pH值為0.5～4.0，65℃～90℃水解3～8小時(shí)，加堿液中和至pH為7.0～8.0，離心得到膠原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)，充分?jǐn)嚢韬箪o置5～8小時(shí)，離心得多肽沉淀，經(jīng)減壓干燥，制得膠原活性多肽產(chǎn)品。本發(fā)明所用原料來(lái)源廣泛易得，成本低、操作方便，條件溫和、生產(chǎn)周期較短、產(chǎn)品收率高。
文檔編號(hào)C07K14/78GK1587277SQ200410052758
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日
發(fā)明者姚善涇, 林東強(qiáng), 贠軍賢, 關(guān)怡新 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)