專利名稱：熱休克蛋白65－多表位乙型肝炎病毒核心抗原重組融合蛋白(HSP65－HBcAg)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組融合蛋白，特別是涉及一種預(yù)防和/或治療人乙型病毒肝炎的重組融合蛋白。本發(fā)明還涉及編碼該重組融合蛋白的基因。
背景技術(shù)：
乙型病毒肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一種世界性疾病，在發(fā)展中國家的發(fā)病率較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無癥狀攜帶者(HBsAg攜帶者)超過2.8億，我國占1億以上。在無癥狀感染者中，約有1/3的人出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。其特點(diǎn)為起病較緩慢，以亞臨床型及慢性型較為常見。無黃疸型HBsAg持續(xù)陽性者易慢性化。本病主要通過血液及日常生活密切接觸進(jìn)行傳播，另一傳播方式為母嬰垂直傳播。乙型病毒肝炎疫苗是控制和預(yù)防乙型病毒肝炎的根本措施。而常規(guī)應(yīng)用的乙型病毒肝炎疫苗主要側(cè)重的是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，而這些抗體不能徹底清除掉潛伏在感染細(xì)胞中的乙型肝炎病毒，往往導(dǎo)致體內(nèi)乙型肝炎病毒的藏匿，因此，研制出能有效地清除掉細(xì)胞中乙型肝炎病毒的疫苗尤為重要。
乙型肝炎病毒(HBV)的基因組是一個(gè)帶有部分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈DNA分子，長度為3.2kb。以不同毒株的HBV基因組DNA為模板轉(zhuǎn)錄的RNA均有4個(gè)開放閱讀框(open readingframe，ORF)。已經(jīng)確定的HBV基因組4個(gè)ORF分別為S、C、P、X。
S區(qū)段編碼病毒的外膜蛋白，由S基因、前S1區(qū)段(Pre-S1)、前S2區(qū)段(Pre-S2)三部分構(gòu)成。病毒顆粒的外膜含有3種蛋白，即主要蛋白、中蛋白和大蛋白。主要蛋白即S蛋白(HBsAg)由226個(gè)氨基酸組成，由S基因編碼；外膜中蛋白由281個(gè)氨基酸組成，由Pre-S2和S基因編碼，其中Pre-S2編碼55個(gè)氨基酸；外膜大蛋白由Pre-S1、Pre-S2和S基因編碼，由于Pre-S1在不同的亞型有差異，編碼長度在108~119個(gè)氨基酸之間，故不同亞型的外膜大蛋白的肽鏈長度不等。
HBsAg能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，同時(shí)HBsAg蛋白的28~39位氨基酸(S 28~39)還能誘生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)。近年來隨著對HBV表面抗原的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究發(fā)現(xiàn)，Pre-S區(qū)蛋白特異性決定簇比S區(qū)更豐富。前S1蛋白的21~47位氨基酸(Pre-S1 21~47)是前S1的優(yōu)勢表位，它不僅是B-細(xì)胞表位(Perit MAet al.Mol Immunol 1991 28517-521)，同時(shí)還可與人肝細(xì)胞受體結(jié)合，使HBV與肝細(xì)胞粘附(Petit MA et al.Virology，1992；187211~222)。Hui等用編碼HBsAg和Pre-S121~47的質(zhì)粒DNA注入小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生了強(qiáng)烈的CTL反應(yīng)和抗-HBsAg、前S1抗體，并導(dǎo)致循環(huán)中HBsAg的清除(Hui JY，et al.Vaccine 1999，171711-18)。前S2蛋白的120~146位氨基酸(Pre-S2 120~146)是Pre-S2區(qū)的優(yōu)勢表位，PreS2 120~132是T細(xì)胞表位，PreS2132~145是B細(xì)胞表位(Lo-Man R et al.J Immunol 1994 1525660-5669)。
C區(qū)段編碼HBV核心抗原(HBcAg)。不同亞型HBV的HBcAg長度為183~214個(gè)氨基酸，當(dāng)羧基端精氨酸豐富區(qū)水解則轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛詄抗原(HBeAg)。
Bertoletti等1993年證實(shí)，HLA-A2陽性者HBcAg特異性CTL最適識(shí)別點(diǎn)在HBcAg的第18~27位氨基酸(C 18~27)，并提出用此多肽作為疫苗進(jìn)行免疫治療以終止病毒感染的設(shè)想(Bertoletti A et al.J Virol.1993；672376~2380)。HBcAg的第141~151位氨基酸(C141~151)是CTL表位(Missal G et al.J Exp Med 1993 177751~762)。
從以上的論述中，我們可以看出HBcAg中存在CTL的表位，為其成為以HBcAg為攻擊靶點(diǎn)的CTL疫苗奠定了基礎(chǔ)。
熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多種生物體內(nèi)的一個(gè)分子伴侶蛋白質(zhì)家族。在免疫應(yīng)答的過程中，熱休克蛋白可表現(xiàn)如下三種基本的功能1、協(xié)助抗原性物質(zhì)進(jìn)入包括樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞；2、協(xié)助抗原性物質(zhì)進(jìn)入MHC I類抗原提呈途徑，進(jìn)而激活抗原特異性CTL；3、刺激樹突狀細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子(如B7等)和分泌細(xì)胞因子。
近年的研究表明，HSP可使非共鍵結(jié)合的抗原在抗原提呈細(xì)胞內(nèi)加工后和MHC I類分子結(jié)合并提呈在其表面，有效地激活CTL去高效殺傷表達(dá)特異性抗原的靶細(xì)胞。
CTL是人體免疫系統(tǒng)中最高效地清除病毒感染細(xì)胞的免疫細(xì)胞。若能有效地激活針對某一病毒感染細(xì)胞的CTL，則被激活的CTL去殺傷感染病毒的細(xì)胞進(jìn)而達(dá)到清除病毒的目的。然而外源性的蛋白類抗原在免疫人體后，通常被抗原提呈細(xì)胞攝取、加工，進(jìn)入MHC II類提呈途徑，激發(fā)體液免疫反應(yīng)(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generationof heat shock protein-based vaccines by intracellular loading of gp96 withantigenicpeptides.Immunol Lett 1997 Jun 1；57(1-3)69-74)，而不能有效地激活CTL。因此，如何能夠讓外源性的多表位乙型肝炎病毒核心抗原進(jìn)入MHC I類途徑，賦予其激活CTL的性質(zhì)，是成功構(gòu)建乙型病毒肝炎CTL疫苗的關(guān)鍵。
熱休克蛋白65能夠攜帶外源抗原進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞，在抗原提呈細(xì)胞中協(xié)助外源抗原進(jìn)入MHC I類抗原提呈途徑，進(jìn)而激活抗原特異性CTL；同時(shí)熱休克蛋白65還能刺激樹突狀細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子(如B7等)和分泌細(xì)胞因子。
本發(fā)明創(chuàng)造性地將熱休克蛋白65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合而構(gòu)建了一種重組融合蛋白，即熱休克蛋白65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原重組融合蛋白(HSP65-HBcAg)，該重組融合蛋白將有效地激活針對乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的CTL，CTL會(huì)殺傷感染乙型肝炎病毒的細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到治療和/或預(yù)防乙型病毒肝炎的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組融合蛋白，它是將熱休克蛋白65(HSP65)和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合在一起而形成的、對人乙型病毒肝炎有預(yù)防和/或治療作用的基因工程重組融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼本發(fā)明重組融合蛋白的基因。
本發(fā)明提供了一種重組融合蛋白，它是由熱休克蛋白65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的重組融合蛋白(HSP65-HBcAg)，其中，所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原是由選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的序列以數(shù)學(xué)上的組合方式相互連接而形成的。本發(fā)明所提供的多表位乙型肝炎病毒核心抗原是SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5按順序相連接所形成的。本發(fā)明的重組融合蛋白中，熱休克蛋白65位于該重組融合蛋白的氨基端，多表位乙型肝炎病毒核心抗原位于該重組融合蛋白的羧基端。本發(fā)明的重組融合蛋白中，所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列或其活性衍生物，其中活性衍生物包括下列多肽(1)其氨基酸序列與SEQ ID NO15所示序列的同源性大于80％；或者(2)其核苷酸編碼序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID NO15所示序列的核苷酸編碼序列雜交；或者(3)對SEQ ID NO15所示序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列；上述多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg活性衍生物仍具有多表位乙型肝炎病毒核心抗原活性。
在本發(fā)明中所指的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括以5×SSC，20mmol/L磷酸緩沖液，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸匍聚糖及100μg/ml變性鮭精DNA片段，在65℃雜交8-16小時(shí)，并在2×SSC和0.5％SDS溶液中室溫下清洗5分鐘，接著于2×SSC和0.1％SDS溶液中室溫下清洗15分鐘，然后于0.1×SSC和0.1％SDS溶液中65℃下清洗30-60分鐘，最后于0.1×SSC室溫下稍稍漂洗濾膜。
本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明的重組融合蛋白的基因。該基因可以具有SEQ ID NO16所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的多表位乙型肝炎病毒核心抗原是由乙型肝炎病毒核心抗原分子中5個(gè)不同的抗原表位相連接而形成的多肽，序列可以如SEQ ID NO15所示，這種將5個(gè)不連續(xù)的抗原表位采用相互連續(xù)的形式進(jìn)行重組所獲得的多表位乙型肝炎病毒核心抗原目前尚無人設(shè)計(jì)和采用。將多表位乙型肝炎病毒核心抗原和熱休克蛋白65融合形成的重組融合蛋白(序列可以如SEQ ID NO17所示)在進(jìn)入人體后可激活針對乙型肝炎病毒的CTL，發(fā)動(dòng)對乙型肝炎病毒感染細(xì)胞的攻擊和殺傷，因而對乙型病毒肝炎有預(yù)防和/或治療的作用。一個(gè)CTL表位可由8-9個(gè)氨基酸殘基組成，因而SEQ ID NO14所示的多表位乙型肝炎病毒核心抗原可含有多個(gè)CTL表位。多表位乙型肝炎病毒核心抗原由乙型肝炎病毒核心抗原的五個(gè)肽段組成，它們的序列分別如SEQ ID NO1至SEQ ID NO5所示。
上述五個(gè)肽段以數(shù)學(xué)上的組合方式連接在一起構(gòu)成的任何一個(gè)多表位乙型肝炎病毒核心抗原被稱為一個(gè)拷貝的多表位乙型肝炎病毒核心抗原。我們將這五個(gè)肽段的編碼基因以數(shù)學(xué)上的組合方式相連在一起所生成的任何一種新的基因，稱為多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因，該基因編碼的多肽即為多表位乙型肝炎病毒核心抗原。將多表位乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和熱休克蛋白65(HSP65)融合形成的重組融合蛋白簡稱為HSP65-HBcAg。將HSP65和SEQ ID NO1融合所形成的重組融合蛋白簡稱為HSP65-FR；將HSP65和SEQ ID NO2融合所形成的重組融合蛋白簡稱為HSP65-SE；將HSP65和SEQ ID NO3融合所形成的重組融合蛋白簡稱為HSP65-TH；將HSP65和SEQ ID NO4融合所形成的重組融合蛋白簡稱為HSP65-FO；將HSP65和SEQ ID NO5融合所形成的重組融合蛋白簡稱為HSP65-FI。HSP65-HBcAg在進(jìn)入人體后可刺激人體產(chǎn)生針對乙型肝炎病毒的CTL，攻擊和消滅感染乙型肝炎病毒的細(xì)胞，因而對乙型病毒肝炎有預(yù)防和或治療的作用。
熱休克蛋白65是一種來源于卡介苗的蛋白質(zhì)，它在與多表位乙型肝炎病毒核心抗原形成重組融合蛋白后，可以協(xié)助多表位乙型肝炎病毒核心抗原進(jìn)入包括樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞，并進(jìn)入MHC I類加工提呈途徑，進(jìn)而激活針對表達(dá)乙型肝炎病毒細(xì)胞的CTL。此外，熱休克蛋白65還可刺激包括樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子(如B7等)和分泌細(xì)胞因子，這些協(xié)同刺激分子(如B7等)和細(xì)胞因子可協(xié)助激活CTL。
本發(fā)明的重組融合蛋白具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明的重組融合蛋白的基因。該基因具有SEQ ID NO16所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種以本發(fā)明重組融合蛋白作為有效成分的藥物組合物，將本發(fā)明的重組融合蛋白選擇性地與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑等結(jié)合，通過適當(dāng)?shù)慕o藥途徑施加于被施用者，從而達(dá)到治療和/或預(yù)防乙型病毒肝炎的目的。
本發(fā)明的“藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予被施用者時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本發(fā)明所指的“藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的重組融合蛋白相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果。可作為藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的一些物質(zhì)的具體例子有糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；片壓劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)被施用者的種類、年齡、體重和給藥方式等因素確定對被施用者有益的劑量進(jìn)行施用。給藥方式例如可以采用注射和其它治療方式。
本發(fā)明的重組融合蛋白可通過已知的方法進(jìn)行生產(chǎn)。
鑒于目前尚無培養(yǎng)乙型肝炎病毒(HBV)的細(xì)胞模型，也無感染HBV的動(dòng)物模型，因此本發(fā)明創(chuàng)造性地采用了轉(zhuǎn)染HBV核心抗原基因的B16細(xì)胞(一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞)模擬由HBV感染的、表達(dá)HBV特異性多肽的細(xì)胞。對表達(dá)HBV核心抗原基因的B16細(xì)胞的CTL反映了HBV特異性的CTL對感染HBV細(xì)胞的殺傷。本發(fā)明的重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染HBV核心抗原基因的B16細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長反映了由本發(fā)明提供的重組融合蛋白誘生了HBV特異性的CTL，CTL殺傷了表達(dá)HBV特異性抗原的B16細(xì)胞，導(dǎo)致B16細(xì)胞數(shù)量減少。由B16細(xì)胞生長所形成的腫瘤較小，說明本發(fā)明中的重組融合蛋白HSP65-HBcAg在小鼠中能夠誘生HBV特異性的CTL，這種CTL具有較強(qiáng)的殺傷乙型肝炎病毒感染細(xì)胞的能力。本發(fā)明的重組融合蛋白延長荷轉(zhuǎn)染HBV核心抗原基因的B16細(xì)胞腫瘤小鼠的生存時(shí)間反映了由本發(fā)明提供的重組融合蛋白誘生了HBV特異性的CTL，這種CTL可殺傷表達(dá)HBV特異性抗原的乙型肝炎病毒感染細(xì)胞。


附圖1熱休克蛋白65(HSP65)編碼基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖
1marker(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；2通過PCR獲得的熱休克蛋白65(HSP65)編碼基因(1638bp)。
附圖2多表位乙型肝炎病毒核心抗原PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖1marker(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；2獲得的多表位乙型肝炎病毒核心抗原PCR產(chǎn)物(276bp)。
附圖3表達(dá)的HSP65-HBcAg重組融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖1marker(Takara)97KD；66KD；45KD；30KD；21KD；14KD；2表達(dá)的HSP65-HBcAg重組融合蛋白(67KD)。
附圖4純化后得到的HSP65-HBcAg重組融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖1純化得到的HSP65-HBcAg重組融合蛋白(67KD)；2marker(Takara)97KD；66KD；45KD；30 KD；21KD；14KD。
附圖5HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-FR重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較AHSP65-FR重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況；BHSP65-HBcAg重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況。
附圖6HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-SE重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較AHSP65-SE重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況；BHSP65-HBcAg重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況。
附圖7HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-TH重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較AHSP65-TH重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況；BHSP65-HBcAg重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況。
附圖8HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-FO重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較
AHSP65-FO重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況；BHSP65-HBcAg重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況。
附圖9HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-FI重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較AHSP65-FI重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況；BHSP65-HBcAg重組融合蛋白抑制轉(zhuǎn)染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16細(xì)胞生長情況。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 獲取65KD熱休克蛋白(HSP65)的編碼基因1、卡介苗來源于長春生物制品研究所。采用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)卡介苗，培養(yǎng)溫度為37-39℃，生長出的卡介苗呈現(xiàn)干皺淺黃色的菌膜。收集菌膜，從中提取卡介苗基因組DNA。
2、提取卡介苗基因組DNA方法參照Molecular Cloning一書(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
3、分離HSP65結(jié)構(gòu)基因采用PCR方法自卡介苗分離HSP65結(jié)構(gòu)基因。采用的5’端引物和3’端引物分別如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示。
PCR操作程序在一500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA(mmol/L) 5μl10× PCR緩沖液(含氯化鎂) 5μldNTPs(10mmol/L)1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L) 各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl) 0.25μl去離子水 加至終體積50μl混合后加入礦物油 3滴反應(yīng)條件94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30個(gè)循環(huán)周期后，72℃延伸10min。
4、克隆PCR產(chǎn)物采用TA克隆方法，方法見文獻(xiàn)(于永利，麻彤輝，楊貴貞.TA克隆及雙鏈DNA測序介紹一種快速克隆及分析PCR產(chǎn)物的方法.中國免疫學(xué)雜志，1994，10(1)5)。按常規(guī)方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進(jìn)行序列測定。
獲得的HSP65結(jié)構(gòu)基因如SEQ ID NO8所示，PCR圖譜如說明書附圖1所示。
實(shí)施例2 多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因的獲得采用二輪PCR合成多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因。
1、第一輪PCR采用的引物1和引物1’分別如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示。第一輪PCR獲得的產(chǎn)物如SEQ ID NO11所示。
2、第二輪PCR采用的引物2和引物2’分別如SEQ ID NO12和SEQ ID NO13所示。第二輪PCR獲得的產(chǎn)物如SEQ ID NO14所示，此序列代表乙型肝炎病毒核心抗原多表位基因。
PCR反應(yīng)條件為94℃，30″；55℃，1’；72℃，4’，30個(gè)循環(huán)周期后，72℃延伸10分鐘。
PCR圖譜如說明書附圖2所示。
實(shí)施例3 HSP65-HBcAg融合基因的構(gòu)建1、將熱休克蛋白65(HSP65)的編碼基因用NcoI和EcoRI消化，多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因用EcoRI和HindIII消化，37℃，2小時(shí)。采用瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物。電泳條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1小時(shí)。
20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸調(diào)pH至8.3。
2、在紫外燈下觀察并將含DNA區(qū)帶的瓊脂糖凝膠切下，置-70℃冷凍15分鐘，然后在65℃水浴中使膠融化；加入等倍體積TE-飽合酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍15分鐘；室溫融化后，12,000rpm離心5分鐘，將上層液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀，洗滌并干燥DNA。
3、將經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的熱休克蛋白65KD(HSP65)的編碼基因和多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因用連接酶連接。
連接反應(yīng)熱休克蛋白65(HSP65)基因DNA(0.5μg/μl)2μl多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因DNA(50ng/μl)2μl10×連接緩沖液(見Protocols and Applications Guide，p57，PromegaCorporation，Second Edition，1991)1μlT4DNA連接酶1μl用雙蒸水調(diào)節(jié)體積至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小時(shí)。
實(shí)施例4 HSP65-HBcAg融合基因的克隆1、用NcoI和HindIII在37℃消化實(shí)施例3中得到的連接產(chǎn)物，時(shí)間為2小時(shí)。消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1小時(shí)。20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base，0.4mol/L NaOAc，0.04mol/LNa2EDTA，用冰醋酸調(diào)pH至8.3。
2、在紫外燈下觀察并將含DNA區(qū)帶的瓊脂糖凝膠切下，置-70℃冷凍15分鐘，然后在65℃水浴中使膠融化；加入等倍體積TE-飽合酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍15分鐘；室溫融化后，12,000rpm離心5分鐘，將上層液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀，洗滌并干燥DNA。
3、將回收的DNA片段克隆入經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII消化的原核細(xì)胞表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒(美國Novagen公司)的6聚組氨酸(histidine)密碼子的上游。
質(zhì)粒DNA的消化反應(yīng)1μg質(zhì)粒DNA1μl 10×緩沖液(見Promega Corporation產(chǎn)品說明書)。
1μl限制性內(nèi)切酶NcoI(10單位/μl)1μl限制性內(nèi)切酶HindIII(10單位/μl)用雙蒸水調(diào)節(jié)體積至10μl混合后37℃溫育30-120分鐘。
連接反應(yīng)質(zhì)粒DNA(0.5μg/μl)2μlDNA插入片段(300ng/μl)5μl10×連接緩沖液(見Protocols and Applications Guide，p57，PromegaCorporation，Second Edition，1991)1μlT4DNA連接酶1μl用雙蒸水調(diào)節(jié)體積至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小時(shí)。
4、將含HSP65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合基因的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HSP65-HBcAg轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
感受態(tài)細(xì)胞的制備a、將大腸桿菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)；b、次日從瓊脂平板上取一單菌落于2ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm速度震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)；c、取1ml上述培養(yǎng)物接種于100ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(大約3小時(shí))；d、將菌液冰浴2小時(shí)，然后2,500×g，4℃離心20分鐘收集菌體；e、加入100ml冰冷的Trituration緩沖液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸鈉，pH5.5)，混勻，置冰上45分鐘；f、1,800×g，4℃離心10分鐘，棄上清，加入10ml冰冷的Trituration緩沖液懸浮細(xì)胞；g、按每份200ul分裝，4℃可保存1-2周。若需長期保存，可加終濃度為15％的甘油，置-70℃?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化方法a、將200μl感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，然后加入3μl DMSO或β-巰基乙醇，混合后，加入3-5μl連接反應(yīng)液(含重組質(zhì)粒)，溫和混勻，置冰上30分鐘；b、42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分鐘；c、加入2ml LB培養(yǎng)液，37℃以225rpm的速度搖蕩培養(yǎng)1小時(shí)；d、4,000×g離心10秒鐘，棄上清，用200μl LB培養(yǎng)液重懸菌體；e、將菌液鋪于含有適當(dāng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，涂勻，室溫放置20-30分鐘，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。用限制性內(nèi)切酶消化的方法鑒定重組克隆。
f、質(zhì)粒和菌株的保存質(zhì)粒冰凍保存于-20℃。菌株在含20-50％甘油培養(yǎng)液中保存于-20℃或-70℃。
5、HSP65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合基因的測序(采用雙脫氧末端終止法，具體方法見文獻(xiàn)于永利，麻彤輝，楊貴貞。TA克隆及雙鏈DNA測序介紹一種快速克隆及分析PCR產(chǎn)物的方法。中國免疫學(xué)雜志，1994，10(1)5)。
結(jié)果表明所得到的HSP65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合基因和設(shè)計(jì)的完全一致。
實(shí)施例5 HSP65-HBcAg重組融合蛋白的表達(dá)將單菌落接種于50ml LB培養(yǎng)基中，于250ml三角瓶中，37℃水浴震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6。加入IPTG使其終濃度為0.4mM，37℃水浴震蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。置三角瓶于冰上5分鐘，4℃離心5分鐘(5000×g)。吸棄上清，收集菌體，立即使用或凍存。
HSP65-HBcAg重組融合蛋白表達(dá)圖譜如說明書附圖3所示。
實(shí)施例6 HSP65-HBcAg重組融合蛋白的純化1、將大腸桿菌細(xì)胞(3g濕重)于室溫下解凍，重懸于20ml結(jié)合液中，冰浴2小時(shí)后，離心20分鐘(10000×g)，收集上清備用。
結(jié)合液的配制20mmol/L Tris·HCL(pH7.9)0.5mol/L NaCL5mmol/L咪唑6mol/L尿素2、將上清液加入鎳親和層析柱(1×10cm)上，洗滌后洗脫目的蛋白。
SDS-PAGE鑒定純化蛋白圖譜如說明書附圖4所示。
實(shí)施例7 轉(zhuǎn)染乙型肝炎病毒核心抗原基因的B16細(xì)胞模型的建立一、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的準(zhǔn)備1、乙型肝炎病毒核心抗原基因片段克隆入轉(zhuǎn)染載體pcDNA3-GFP(Invitrogen)，形成pcDNA3-GFP-乙型肝炎病毒核心抗原基因重組質(zhì)粒，并經(jīng)過序列測定確定乙型肝炎病毒核心抗原基因片段已克隆入轉(zhuǎn)染載體中。GFP為綠色熒光蛋白，且GFP和乙型肝炎病毒核心抗原基因同在一個(gè)閱讀框架中，若重組質(zhì)粒pcDNA3-GFP-乙型肝炎病毒核心抗原基因成功轉(zhuǎn)染入B16細(xì)胞中，則在熒光顯微鏡下可見綠色熒光。
2、準(zhǔn)備非線性化質(zhì)粒和酶切線性化質(zhì)粒。
3、超凈工作臺(tái)中用無菌Eppendorf管，以無水乙醇沉淀質(zhì)粒。
4、將質(zhì)粒用無菌雙蒸水或TE緩沖液(pH7-8)溶解成適當(dāng)濃度，一般最低濃度為1μg/μl。
5、測定質(zhì)粒濃度(紫外測定)。
二、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的準(zhǔn)備1、轉(zhuǎn)染前一天將生長良好的B16細(xì)胞用3％胰酶和4mM EDTA消化1-2min(采用最短時(shí)間為好)，吸出胰酶，用完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新6孔培養(yǎng)板孔中，每孔4×105細(xì)胞，每孔2ml完全培養(yǎng)液。
2、37℃，5％CO2培養(yǎng)18-24小時(shí)。
三、轉(zhuǎn)染操作規(guī)程用Lipofeetamine試劑(Invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染1、準(zhǔn)備下列試劑溶液A用100μl無血清培養(yǎng)液稀釋1-2μg質(zhì)粒DNA。
溶液B用100μl無血清培養(yǎng)液稀釋10-20μl Lipofectamine試劑。
2、將溶液A慢慢加到溶液B中，輕輕混合，室溫(一般為20-25℃左右)孵育45min，此時(shí)混合液中可能出現(xiàn)絮狀物為正常現(xiàn)象。
3、在混合液孵育期間，用2ml無血清培養(yǎng)液將細(xì)胞洗一次。
4、將0.8ml無血清培養(yǎng)液加到A/B混合液中，輕輕混合。
5、將A/B混合液輕輕加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，蓋到細(xì)胞上。
6、37℃，5％CO2培養(yǎng)5小時(shí)。
7、直接向培養(yǎng)孔中加入1ml完全培養(yǎng)液/20％血清(注意不要將轉(zhuǎn)染試劑移除)，繼續(xù)培養(yǎng)18-24小時(shí)。
8、棄培養(yǎng)液，加入2ml含適當(dāng)濃度抗生素(如G418)的新鮮培養(yǎng)液/10％血清，繼續(xù)培養(yǎng)，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的多克隆和單克隆建立。
四、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的單克隆篩選1、收集在含抗生素G418培養(yǎng)液中生長良好的多克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1×106)，采用有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞株，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇綠色熒光單克隆細(xì)胞株，并采用WesternBlot鑒定乙型肝炎病毒核心抗原基因的表達(dá)情況。
2、Western Blot鑒定后的單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞需經(jīng)過流式細(xì)胞儀測定，鑒定其陽性細(xì)胞率后方可用于下述的功能試驗(yàn)。
實(shí)施例8 HSP65-HBcAg重組融合蛋白可誘生小鼠多表位乙型肝炎病毒核心抗原特異性的CTL1、方法設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只C57BL/6小鼠。于第0天、14天和28天給實(shí)驗(yàn)組小鼠四肢向心端注射HSP65-HBcAg重組融合蛋白，每只小鼠給予10μg HSP65-HBcAg重組融合蛋白/200μl PBS，同時(shí)設(shè)立PBS對照組，每只小鼠給予PBS200μl，注射部位同實(shí)驗(yàn)組。最后一次免疫后3-7d處死小鼠，取脾和淋巴結(jié)，分離淋巴細(xì)胞，體外培養(yǎng)7d，其間用HSP65-HBcAg重組融合蛋白刺激淋巴細(xì)胞2-3次。靶細(xì)胞采用的是轉(zhuǎn)染了HBV核心抗原肽基因(序列見SEQ ID NO14；SEQ ID NO15)的B-16細(xì)胞(來源于C57/BL6小鼠的黑色素瘤細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)Western Blot和RT-PCR鑒定，證明HBV核心抗原肽基因已成功轉(zhuǎn)染入B16細(xì)胞。用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞。采用常規(guī)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共孵育4h后離心收集上清。使用放射性測定儀測定上清中的放射性含量(cpm)。
2、結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠脾和淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞殺傷效率顯著高于PBS對照組。
3、結(jié)論HSP65-HBcAg重組融合蛋白在小鼠中可誘生多表位乙型肝炎病毒核心抗原特異性CTL。
實(shí)施例9 接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白免疫的小鼠可激活體內(nèi)HBV特異性的CTL1、方法對照組于第0天、14天和28天，用PBS免疫C57BL/6小鼠三次，最后一次免疫后3-7d給小鼠右側(cè)背部后肢注射用pcDNA3-GFP-HBcAg質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組于第0天、14天和28天，用10μgHSP65-HBcAg重組融合蛋白免疫C57BL/6小鼠三次，最后一次免疫后3-7d給小鼠右側(cè)背部后肢注射用pcDNA3-GFP-HBcAg質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞。觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存情況。
2、結(jié)果用HSP65-HBcAg重組融合蛋白免疫的小鼠接受轉(zhuǎn)染HBcAg抗原表位的腫瘤細(xì)胞后，其存活時(shí)間顯著延長。在接種B16細(xì)胞后的第29天，對照組小鼠全部死亡，而在第29天時(shí)免疫HSP65-HBcAg重組融合蛋白組小鼠的死亡率為35％。這一結(jié)果說明接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白免疫的小鼠激活了其體內(nèi)較強(qiáng)的HBV特異性的CTL。
3、結(jié)論接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白免疫的小鼠激活了其體內(nèi)較強(qiáng)的HBV特異性的CTL。
實(shí)施例10注射轉(zhuǎn)染HBcAg抗原表位B16細(xì)胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白治療后，在小鼠體內(nèi)激活了HBV特異性的CTL1、方法對照組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射PBS，200μlPBS/只小鼠，注射部位是小鼠四只皮下向心端。實(shí)驗(yàn)組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μg HSP65-HBcAg重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。觀察兩組小鼠存活情況。
2、結(jié)果注射轉(zhuǎn)染HBcAg抗原表位B16腫瘤細(xì)胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白治療后，其生存時(shí)間明顯長于對照組。在接種B16細(xì)胞后的第31天，對照組小鼠全部死亡，接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白治療組小鼠的死亡率為41％。這一結(jié)果說明先注射轉(zhuǎn)染HBcAg抗原表位B16腫瘤細(xì)胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白治療后，激發(fā)了其體內(nèi)較強(qiáng)的HBV特異性的CTL。
3、結(jié)論注射轉(zhuǎn)染HBcAg抗原表位B16腫瘤細(xì)胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重組融合蛋白后，激發(fā)了其體內(nèi)較強(qiáng)的HBV特異性的CTL。
實(shí)施例11 HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-FR重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較1、方法設(shè)立對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只小鼠。對照組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-FR重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。實(shí)驗(yàn)組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。觀察兩組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長情況。
2、結(jié)果HSP65-HBcAg注射的實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長顯著慢于注射HSP65-FR重組融合蛋白小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長。這一結(jié)果說明HSP65-HBcAg能夠比HSP65-FR在小鼠體內(nèi)激活較強(qiáng)的HBV特異性的CTL，結(jié)果比較如說明書附圖5所示。
3、結(jié)論HSP65-HBcAg比HSP65-FR在小鼠體內(nèi)所誘生的HBV特異性CTL高效而強(qiáng)烈。
實(shí)施例12 HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-SE重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較1、方法設(shè)立對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只小鼠。對照組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-SE重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。實(shí)驗(yàn)組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。觀察兩組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長情況。
2、結(jié)果HSP65-HBcAg注射的實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長顯著慢于注射HSP65-SE重組融合蛋白小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長。這一結(jié)果說明HSP65-HBcAg能夠比HSP65-SE在小鼠體內(nèi)激活較強(qiáng)的HBV特異性的CTL，結(jié)果比較如說明書附圖6所示。
3、結(jié)論HSP65-HBcAg比HSP65-SE在小鼠體內(nèi)所誘生的HBV特異性CTL高效而強(qiáng)烈。
實(shí)施例13 HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-TH重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較1、方法設(shè)立對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只小鼠。對照組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-TH重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。實(shí)驗(yàn)組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。觀察兩組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長情況。
2、結(jié)果HSP65-HBcAg注射的實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長顯著慢于注射HSP65-TH重組融合蛋白小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長。這一結(jié)果說明HSP65-HBcAg能夠比HSP65-TH在小鼠體內(nèi)激活較強(qiáng)的HBV特異性的CTL，結(jié)果比較如說明書附圖7所示。
3、結(jié)論HSP65-HBcAg比HSP65-TH在小鼠體內(nèi)所誘生的HBV特異性CTL高效而強(qiáng)烈。
實(shí)施例14 HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-FO重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較1、方法設(shè)立對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只小鼠。對照組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-FO重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。實(shí)驗(yàn)組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。觀察兩組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長情況。
2、結(jié)果HSP65-HBcAg注射的實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長顯著慢于注射HSP65-FO重組融合蛋白小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長。這一結(jié)果說明HSP65-HBcAg能夠比HSP65-FO在小鼠體內(nèi)激活較強(qiáng)的HBV特異性的CTL，結(jié)果比較如說明書附圖8所示。
3、結(jié)論HSP65-HBcAg比HSP65-FO在小鼠體內(nèi)所誘生的HBV特異性CTL高效而強(qiáng)烈。
實(shí)施例15 HSP65-HBcAg重組融合蛋白和HSP65-FI重組融合蛋白激發(fā)HBV特異性CTL效力比較1、方法設(shè)立對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只小鼠。對照組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-FI重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。實(shí)驗(yàn)組在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B-16細(xì)胞給小鼠注射，每只小鼠1.5×105個(gè)細(xì)胞，注射部位為小鼠背部右腿皮下。分別在第2、16天給小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重組融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。觀察兩組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長情況。
2、結(jié)果HSP65-HBcAg注射的實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長顯著慢于注射HSP65-FI重組融合蛋白小鼠體內(nèi)B16細(xì)胞的生長。這一結(jié)果說明HSP65-HBcAg能夠比HSP65-FI在小鼠體內(nèi)激活較強(qiáng)的HBV特異性的CTL，結(jié)果比較如說明書附圖9所示。
3、結(jié)論HSP65-HBcAg比HSP65-FI在小鼠體內(nèi)所誘生的HBV特異性CTL高效而強(qiáng)烈。
序列表<110>北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司<120>熱休克蛋白65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原重組融合蛋白<160>17<210>SEQ ID NO1<211>18<212>氨基酸<221>多肽<400>1Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu18<210>SEQ ID NO2<211>17<212>氨基酸<221>分子類型多肽<400>2Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu17<210>SEQ ID NO3<211>19<212>氨基酸<221>多肽<400>3Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser 19<210>SEQ ID NO4<211>17<212>氨基酸<221>多肽<400>4Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser 17<210>SEQ ID NO5<211>17<212>氨基酸<221>多肽<400>5Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln 17<210>SEQ ID NO6<211>20bp
<212>核酸<221>寡核苷酸<400>6CCATGGCCAA GACAATTGCG20<210>SEQ ID NO7<211>39bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>7ACCGAATTCG CTAGCCATAT GGAAATCCAT GCCACCCAT 39<210>SEQ ID NO8<211>1638bp<212>核酸<221>HSP65結(jié)構(gòu)基因序列<400>8ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG 50GGGCTTGAAC GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG 100GCCGCAACGT CGTCCTGGAA AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC 150GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG CTGGAGGATC CGTACGAGAA 200GATCGGCGCC GAGCTGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC GATGACGTCG 250CCGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC 300GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG 350CGGCATCGAA AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG 400CCAAGGAGGT CGAGACCAAG GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG 450GCGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC GCCGAGGCGA TGGACAAGGT 500GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC TTTGGGCTGC 550AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGCGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG 600TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA 650CATCCTGCTG GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC 700TGCTCGAGAA GGTCATCGGA GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG 750GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG GTCGTCAACA AGATCCGCGG 800CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC GACCGCCGCA 850AGGCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC 900GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA 950GGCCCGCAAG GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG 1000CCGGTGACAC CGACGCCATC GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG 1050ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT 1100GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT GCCGCCACCG 1150ACGTCGAACT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT 1200GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT 1250GTTGCAAGCG GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG 1300CGACCGGCGC CAACATCGTG AAGGTGGCGC TGGAGGCCCC GCTGAAGCAG 1350ATCGCCTTCA ACTCCGGGCT GGAGCCGGGC GTGGTGGCCG AGAAGGTGCG 1400CAACCTGCCG GCTGGCCACG GACTGAACGC TCAGACCGGT GTCTACGAGG 1450
ATCTGCTCGC TGCCGGCGTT GCTGACCCGG TCAAGGTGAC CCGTTCGGCG 1500CTGCAGAATG CGGCGTCCAT CGCGGGGCTG TTCCTGACCA CCGAGGCCGT 1550CGTTGCCGAC AAGCCGGAAA AGGAGAAGGC TTCCGTTCCC GGTGGCGGCG 1600ACATGGGTGG CATGGATTTC CATATGGCTA GCGAATTC 1638<210>SEQ ID NO9<211>86bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>9GGTTGTTTCT TACGTTAACG TAAACATGGG TCTGAAAATC CGTCAGCTGG 50CTCCGATCCT GTCCACTCTG CCAGAAACTA CTGTTG86<210>SEQ ID NO10<211>85bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>10TAGAGGACAG ACGAGCAACG TAACGAGACA GACCGGAAGA ACCGATGCTA 50CGACCACGAC GACGAACAAC AGTAGTTTCT GGCAG85<210>SEQ ID NO11<211>152bp<212>核酸<221>第一輪PCR產(chǎn)物<400>11GGTTGTTTCT TACGTTAACG TAAACATGGG TCTGAAAATC CGTCAGCTGG 50CTCCGATCCT GTCCACTCTG CCAGAAACTA CTGTTGTTCG TCGTCGTGGT 100CGTAGCATCG GTTCTTCCGG TCTGTCTCGT TACGTTGCTC GTCTGTCCTC 150TA 152<210>SEQ IDNO12<211>82bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>12GAATTCGAAC TGCTGTCTTT CCTGCCGAGC GACTTCTTCC CGTCCGTTCG 50TGACCTGCTG CTGGTTGTTT CTTACGTTAA CG82<210>SEQ ID NO13<211>86bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>13
ACGCGTCGAC CTGTTTAGCC TGGATGCAAG CGTACAGCGG CATCAGAGCC 50GGGTAACCGC AAGAGTTAGA GGACAGACGA GCAACG 86<210>SEQ ID NO14<211>276bp<212>核酸<221>第二輪PCR產(chǎn)物/乙型肝炎病毒核心抗原多表位基因序列<400>14 GAAC TGCTGTCTTT CCTGCCGAGC GACTTCTTCC CGTCCGTTCG 50TGACCTGCTG CTGGTTGTTT CTTACGTTAA CGTAAACATG GGTCTGAAAA100TCCGTCAGCT GGCTCCGATC CTGTCCACTC TGCCAGAAAC TACTGTTGTT150CGTCGTCGTG GTCGTAGCAT CGGTTCTTCC GGTCTGTCTC GTTACGTTGC200TCGTCTGTCC TCTAACTCTT GCGGTTACCC GGCTCTGATG CCGCTGTACG250CTTGCATCCA GGCTAAACAG276<210>SEQ ID NO15<211>92<212>氨基酸<221>多表位乙型肝炎病毒核心抗原<400>15Glu Phe Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu 20Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Ala Pro Ile 40Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Ile Gly Ser Ser 60GIy Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met 80Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Lys Leu 92<210>SEQ ID NO16<21l>1944bp<212>核酸<221>HSP65-HbcAg重組融合蛋白基岡<400>16ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG50GGGCTTGAAC GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG100GCCGCAACGT CGTCCTGGAA AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC150GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG CTGGAGGATC CGTACGAGAA200GATCGGCGCC GAGUrGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC GATGACGTCG250CCGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC300GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG350CGGCATCGAA AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG400CCAAGGAGGT CGAGACCAAG GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG450GCGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC GCCGAGGCGA TGGACAAGGT500GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC TTTGGGCTGC550
AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGCGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG600TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA650CATCCTGCTG GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC700TGCTCGAGAA GGTCATCGGA GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG750GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG GTCGTCAACA AGATCCGCGG800CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC GACCGCCGCA850AGCCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC900GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA950GGCCCGCAAG GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG1000CCGGTGACAC CGACGCCATC GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG1050ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT1100GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT GCCGCCACCG1150ACGTCGAaCT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT1200GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT1250GTTGCAAGCG GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG1300CGACCGGCGC CAACATCGTG AAGGTGGCGC TGGAGGCCCC GCTGAAGCAG1350ATCGCCTTCA ACTCCGGGCT GGAGCCGGGC GTGGTGGCCG AGAAGGTGCG1400CAACCTGCCG GCTGGCCACG GACTGAACGC TCAGACCGGT GTCTACGAGG1450ATCTGCTCGC TGCCGGCGTT GCTGACCCGG TCAAGGTGAC CCGTTCGGCG1500CTGCAGAATG CGGCGTCCAT CGCGGGGCTG TTCCTGACCA CCGAGGCCGT1550CGTTGCCGAC AAGCCGGAAA AGGAGAAGGC TTCCGTTCCC GGTGGCGGCG1600ACATGGGTGG CATGGATTTC CATATGGCTA GC GA ACTGCTGTCT1650TTCCTGCCGA GCGACTTCTT CCCGTCCGTT CGTGACCTGC TGCTGGTTGT1700TTCTTACGTT AACGTAAACA TGGGTCTGAA AATCCGTCAG CTGGCTCCGA1750TCCTGTCCAC TCTGCCAGAA ACTACTGTTG TTCGTCGTCG TGGTCGTAGC1800ATCGGTTCTT CCGGTCTGTC TCGTTACGTT GCTCGTCTGT CCTCTAACTC1850TTGCGGTTAC CCGGCTCTGA TGCCGCTGTA CGCTTGCATC CAGGCTAAAC1900AG 1908<210>SEQ ID NO17<211>636<212>氨基酸<221>HSP65-HbcAg重組融合蛋白<400>17Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg Gly Leu Asn20Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu40Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu60Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr80Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg100Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu120Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys140Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile160Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu G1u Ser Asn Thr180Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly200Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu220Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu260Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly280
Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser 300Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys 320Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile 340Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg 360Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly 380Ala Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn 400Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala 420Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val 440Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly 460Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala 500Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp 520Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe 540His Met Ala Ser Glu Phe Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 560Arg Asp Leu Leu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln 580Leu Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser 600Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Cys Gly Tyr 620Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Lys Leu 63權(quán)利要求
1.一種重組融合蛋白，它是由熱休克蛋白HSP65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg融合而形成的融合蛋白；其中，所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg是由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5以數(shù)學(xué)上的組合方式相互連接而形成。
2.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg是由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5按順序連接而形成的。
3.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg包含SEQ ID NO15所示的氨基酸序列或其活性衍生物，所述活性衍生物包括下列多肽(1)其氨基酸序列與SEQ ID NO15所示序列的同源性大于80％；或者(2)其核苷酸編碼序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID NO15所示序列的核苷酸編碼序列雜交；或者(3)對SEQ ID NO15所示序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列；上述多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg活性衍生物仍具有多表位乙型肝炎病毒核心抗原活性。
4.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中熱休克蛋白HSP65位于該融合蛋白的氨基端，多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg位于該融合蛋白的羧基端。
5.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，它具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
6.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，它由SEQ ID NO16所示的核苷酸序列編碼。
7.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列。
8.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg由SEQ ID NO14所示的核苷酸序列編碼。
9.按照權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg可以是1至5個(gè)拷貝。
10.編碼權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的重組融合蛋白的核苷酸序列。
11.一種重組質(zhì)粒，其外源插入基因是由熱休克蛋白65基因融合多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因所組成的。
12.按照權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒，其外源插入基因的表達(dá)產(chǎn)物中熱休克蛋白65位于該表達(dá)產(chǎn)物的氨基端，多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg位于該表達(dá)產(chǎn)物的羧基端。
13.按照權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒，其外源插入基因中多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因的表達(dá)產(chǎn)物具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列。
14.按照權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒，其外源插入基因中編碼多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg的基因具有SEQ ID NO14所示的核苷酸序列。
15.按照權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒，其外源插入基因的表達(dá)產(chǎn)物具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
16.按照權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒，其外源插入基因具有SEQ ID NO16所示的核苷酸序列。
17.一種藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。
18.一種藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求3所述的重組融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。
19.一種藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求9所述的重組融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組融合蛋白HSP65－HBcAg，該重組融合蛋白由熱休克蛋白65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg融合而成。在上述重組融合蛋白中，多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg由5個(gè)不同的抗原表位以數(shù)學(xué)上的組合方式相互連接而成。該重組融合蛋白可以有效地激活針對乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CTL，從而導(dǎo)致CTL殺傷感染乙型肝炎病毒的細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到治療和/或預(yù)防乙型病毒肝炎的目的。同時(shí)本發(fā)明還提供了編碼該重組融合蛋白的核苷酸序列。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1737147SQ20041007008
公開日2006年2月22日 申請日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月18日
發(fā)明者王麗穎, 萬敏, 邵明玉, 于永利 申請人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司