專(zhuān)利名稱(chēng)：重組抗原HSV－ⅡgD包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法及ELISA檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物試劑盒，具體是一種將HSV-II gD重組蛋白用于檢測(cè)HSV-II IgM的ELISA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒II型(Herpes simplex virus II，HSV-II)在人群中感染十分廣泛，是引起生殖器皰疹的主要病原體，也是導(dǎo)致TORCH綜合征的主要病原體之一。新生兒通過(guò)多種途徑感染，如宮內(nèi)、產(chǎn)道等。孕婦早孕時(shí)感染可引起流產(chǎn)、胎兒先天性畸形；妊娠中、晚期感染者，早產(chǎn)、極低體重兒發(fā)生率增高；經(jīng)產(chǎn)道感染新生兒，會(huì)引起腦炎及腦膜炎等。正常人首次感染生殖器時(shí)，病毒容易潛伏在脊神經(jīng)內(nèi)，形成潛伏感染，而后在一定條件下，如妊娠或免疫力低下等，病毒可被誘發(fā)激活、增殖、蔓延擴(kuò)散，引起反復(fù)發(fā)作，致病。尤其是在孕婦早期感染或復(fù)發(fā)HSV-II，病毒可通過(guò)胎盤(pán)引起胎兒病毒血癥、自發(fā)性流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形和宮內(nèi)發(fā)育遲緩等；如在分娩期經(jīng)產(chǎn)道傳染給新生兒，可引起新生兒皰疹。因此，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷有無(wú)HSV-II感染，不僅有助于生殖器炎癥的治療，并且對(duì)婦幼保健、圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和優(yōu)生優(yōu)育工作均有重要的指導(dǎo)意義。
鑒于HSV-II對(duì)人類(lèi)的危害性較大，發(fā)現(xiàn)患者及時(shí)采取措施是保障人口素質(zhì)及提高人類(lèi)健康水平的關(guān)鍵。我國(guó)每年需要對(duì)大量的患者或孕婦進(jìn)行HSV-II檢測(cè)。目前市場(chǎng)上HSV-II的各種免疫診斷試劑盒質(zhì)量參差不齊，既無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，又在無(wú)序生產(chǎn)與應(yīng)用，給HSV-II的預(yù)防和診治造成嚴(yán)重障礙。目前國(guó)外有研究者利用同類(lèi)診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，但是此種試劑盒價(jià)格十分昂貴，限制了臨床的廣泛使用。而國(guó)產(chǎn)試劑盒多采用細(xì)胞培養(yǎng)的全病毒粗制抗原檢測(cè)血清中特異性IgM，病毒產(chǎn)量低，所得病毒抗原純度較低，且其抗原性可能與其它皰疹病毒有交叉，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；這些試劑盒存在穩(wěn)定性和重復(fù)性較差、靈敏度和特異性不高等缺點(diǎn)。
現(xiàn)已知，HSV-II至少包含10種包膜糖蛋白，而糖蛋白D(glycoprotein D，gD)是HSV-II的一個(gè)極為保守的高度免疫原性蛋白。作為HSV-II重要的特異性糖蛋白，gD能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有中和作用。鑒于gD具有這些重要的功能及良好的抗原性，本發(fā)明利用基因工程的方法，自行設(shè)計(jì)并克隆表達(dá)了HSV-II gD特異性抗原片段，經(jīng)親和層析法對(duì)重組抗原進(jìn)行純化后，獲得一種新的gD重組蛋白。經(jīng)過(guò)改造過(guò)的gD重組蛋白既保留了其抗原性，又提高了gD重組蛋白的原核表達(dá)量。采用該重組蛋白，本發(fā)明成功地用間接ELISA法，方便快速地檢出特異性HSV-II-IgM，并將該結(jié)果與美國(guó)BioCheck試劑盒相比較，一致性為97.0％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種新的HSV-II gD-IgM型ELISA檢測(cè)試劑盒及重組抗原HSV-II gD包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法，為臨床診斷HSV-II提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)工具。
本發(fā)明技術(shù)方案如下特異性重組抗原HSV-II gD包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，通過(guò)下列步驟制備而成(1)HSV-II gD重組蛋白的載體構(gòu)建①HSV-II gD的原核表達(dá)以HSV-II Sav標(biāo)準(zhǔn)病毒株DNA作為模板，通過(guò)特異性引物PCR擴(kuò)增gD特異性基因片段，長(zhǎng)約447bp。將目的基因連接于pGEM-4T原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌中。根據(jù)卡那霉素抗性挑取克隆，并提取質(zhì)粒，通過(guò)PCR、雙酶切、測(cè)序進(jìn)行鑒定，得到與目的基因一致的基因片段。證明gD特異性基因片斷已正確連入pGEM-4T中。
②gD重組蛋白的表達(dá)與鑒定將上述含有重組質(zhì)粒pGEM-4T/gD的陽(yáng)性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)的蛋白通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，與空菌相比，在30KD左右有一條濃染的新增蛋白質(zhì)條帶。經(jīng)Westernblotting鑒定，能與gD單克隆抗體特異性結(jié)合，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的免疫原性。
③HSV-II gD重組蛋白的大量表達(dá)、純化對(duì)pGEM-4T/gD工程菌進(jìn)行發(fā)酵，超聲破菌，親和層析純化后得到大量的gD重組蛋白。
(2)HSV-II gD重組蛋白作為抗原，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成適宜濃度后按100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，置濕盒中，4℃12～24h，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到酶標(biāo)反應(yīng)板。
(3)用含10％小牛血清的PBS加滿孔(約200μl/孔)，37℃孵育，封閉1h，洗板3次，拍干并密封，即可得到HSV-II gD抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
這種新的HSV-II gD IgM型ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由上述特異性重組抗原HSV-II gD包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、酶標(biāo)二抗、底物液、終止液構(gòu)成。具體分為(1)、標(biāo)本稀釋液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；(2)、洗滌液含有0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBST)；(3)、酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗；(4)、底物液TMB-H2O2尿素溶液；(5)、終止液2mol/L H2SO4溶液。
本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)產(chǎn)的全病毒--ELISA法及美國(guó)BioCheck試劑盒的檢測(cè)特異性分別是本法為98.9％；全病毒--ELISA法82.4％。敏感性分別是本法為80％；全病毒-ELISA法60％。且本法與美國(guó)BioCheck法有較高一致性，為97.0％。
本發(fā)明試劑盒選取HSV-II抗原性較強(qiáng)的gD蛋白的部分序列，通過(guò)分析，選擇其中的抗原表位和親水性區(qū)域，采用基因重組技術(shù)，原核表達(dá)，親和層析后獲得一種新的gD重組蛋白，該抗原不僅具有高特異性，且具有高純度和高穩(wěn)定性，在提取純化后，包板作為試劑盒中的重要組分。與全病毒抗原相比，該重組抗原可規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，更安全、經(jīng)濟(jì)。
具體實(shí)施例方式
1、試劑(1)包被液(0.05mol/l，pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH9.6。
(2)標(biāo)本稀釋液(含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.4)，PBSNaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH7.4，即得。
(3)封閉液(10％小牛血清的PBS溶液)小牛血清100ml/PBS(pH7.4)900ml。
(4)洗滌液(PBST，pH7.4)NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl0.2g、Tween 200.5ml、硫柳汞0.1g、加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH7.4。
(5)酶標(biāo)二抗(HRP*鼠抗人IgM單抗)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗。
(6)底物液(TMB-H2O2尿素溶液)①底物液A(3、3‘、5、5‘-四甲基聯(lián)苯胺，TMB)TMB200mg，無(wú)水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml。
②底物液B緩沖液(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0～5.4)Na2HPO414.60g，檸檬酸9.33g，0.75％過(guò)氧化氫尿素6.4ml，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH5.0～5.4。
③將底物液A和B按1∶1混合，即成TMB-H2O2尿素溶液。
(7)終止液(2mol/L H2SO4溶液)雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。
2、主要儀器(1)酶標(biāo)儀BIO-RAD Model 550(2)ELISA反應(yīng)板Corning Incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate3、方法酶標(biāo)二抗最適滴度的選擇(1)用100ng/ml人IgM進(jìn)行包被，洗滌。
(2)將酶標(biāo)抗人IgM單抗用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。
(3)加底物液顯色。加終止液終止反應(yīng)后，讀取吸光度(A)，取A值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)二抗的最適滴度為1∶1000。
棋盤(pán)滴定法選擇包被抗原最適滴度(1)用包被液將HSV-II gD抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。
(2)將強(qiáng)陽(yáng)性參考血清、弱陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清用稀釋液按10倍遞增系列稀釋?zhuān)訕?，保溫，洗滌?br> (3)加按最適滴度稀釋的酶標(biāo)抗人IgM單抗，保溫，洗滌。
(4)加底物液顯色，加終止液終止反應(yīng)后讀取A值。
(5)選擇強(qiáng)陽(yáng)性參考血清的A值為0.8～1.0間、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀釋度作為最適滴度為20～40μg/孔。
特異性重組抗原HSV-II gD包被反應(yīng)板的制備方法(1)HSV-II gD重組蛋白作為抗原，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成適宜濃度后按100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，置濕盒中，4℃ 12～24h，用洗滌液洗板3次，每次3min，然后拍干；得到酶標(biāo)反應(yīng)板。
(3)用含10％小牛血清的PBS加滿孔，37℃孵育，封閉1h，用洗滌液洗板3次后密封。該板即可得到抗原gD包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
洗滌液為含有0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBST)；HSV-II gD IgM型ELISA檢測(cè)試劑盒，由上述特異性重組抗原HSV-II gD包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、酶標(biāo)二抗、底物液、終止液構(gòu)成。
具體分為(1)、標(biāo)本稀釋液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；(2)、洗滌液含有0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBST)；(3)、酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗；(4)、底物液TMB-H2O2尿素溶液；(5)、終止液2mol/L H2SO4溶液。
利用上述試劑盒采用ELISA法檢測(cè)血清中HSV-II gD IgM(1)待檢血清，加入1∶100稀釋的待檢血清到包被好的酶標(biāo)反應(yīng)板，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板3次；(2)加酶標(biāo)物，加入HRP(辣根過(guò)氧化酶)標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗，100μl/孔，37℃孵育40min，(3)顯色，用洗滌液洗板后每孔加入底物液TMB-H2O2尿素液100μl，37℃或室溫避光顯色15分鐘；(4)每孔加入2mol/L H2SO450μl，終止反應(yīng)；(5)結(jié)果判斷，空白孔調(diào)零，讀取450nm波長(zhǎng)處吸光度，即OD450值。
(6)計(jì)算結(jié)果，將待檢標(biāo)本血清平均OD值(P)除以陰性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N≥2.1為陽(yáng)性，P/N＜2.1為陰性。
權(quán)利要求
1.重組抗原HSV-IIgD包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法，其特征在于通過(guò)下列步驟制備而成(1)、以HSV-IISav標(biāo)準(zhǔn)病毒株DNA作為模板，擴(kuò)增長(zhǎng)約446bp的特異性目的基因，與克隆表達(dá)載體pGEM-4T連接，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，表達(dá)大量純化gD蛋白；(2)、將HSV-II gD蛋白抗原用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，10μl/孔，置濕盒中，4℃12～24小時(shí)，洗滌液洗板3次，每次3min，然后拍干；(3)、用含10％小牛血清的PBS加滿孔，37℃孵育，封閉1h，洗板3次后密封；該板即為重組抗原HSV-II gD包被酶標(biāo)反應(yīng)板，用于HSV-II gD-IgM的特異性檢測(cè)。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的制法，其特征在于所述的pH9.6的碳酸鹽緩沖液為Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH9.6，得到。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的制法，其特征在于PBS為NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH7.4，得到。
4.應(yīng)用重組抗原HSV-IIgD包被酶標(biāo)反應(yīng)板的ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由重組抗原HSV-IIgD包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、底物液、終止液構(gòu)成，具體組份為(1)、標(biāo)本稀釋液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；(2)、洗滌液含有0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBST)；(3)、酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗；(4)、底物液TMB-H2O2尿素溶液；(5)、終止液2mol/L H2SO4溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的PBS為NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH7.4，得到；PBST為NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g、Tween 200.5ml、硫柳汞0.1g、加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH7.4，得到；底物液為(TMB-H2O2尿素溶液)①底物液A(3、3‘、5、5‘-四甲基聯(lián)苯胺，TMB)TMB200mg，無(wú)水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml，得到；②底物液B緩沖液(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0～5.4)Na2HPO414.60g，檸檬酸9.33g，0.75％過(guò)氧化氫尿素6.4ml，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH5.0～5.4，得到；③將底物液A和B按體積比1∶1混合，即成TMB-H2O2尿素溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組抗原HSV－IIgD包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法及ELISA檢測(cè)試劑盒，其關(guān)鍵技術(shù)之處主要在于用基因工程方法制備特異性重組抗原——HSV－IIgD。該抗原在提取純化后，再制成gD包被酶標(biāo)反應(yīng)板；試劑盒由重組抗原HSV－IIgD包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、底物液、終止液構(gòu)成。建立敏感快速的ELISA抗體捕獲血清中HSV－II特異性IgM抗體的方法，具有高特異性，高穩(wěn)定性。試劑盒主要供實(shí)驗(yàn)室研究和臨床診斷使用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1804630SQ20051012292
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者王明麗 申請(qǐng)人:王明麗