專利名稱：用于抗炭疽毒素的g免疫球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)細(xì)菌炭疸芽孢桿菌(Bacillus anthraCis)PA亞基(保護(hù)性抗原) 的靈長源化G免疫球蛋白。
現(xiàn)有技術(shù)炭疽是由革蘭氏陽性細(xì)菌炭疽芽孢桿菌引起的傳染病。該細(xì)菌是非運(yùn)動(dòng)性的，其 形成具有高度抗性的孢子，在例如人或動(dòng)物血液或組織的環(huán)境中存在時(shí)萌發(fā)形成營養(yǎng)體 型。盡管非常具有抗性，所述孢子不復(fù)制，但是另一方面它們可在土壤中存活數(shù)十年。炭疽毒素介導(dǎo)的感染可以下列三種形式發(fā)生皮膚、肺或消化道。肺感染是最常 致命的。一旦吸入，炭疽芽孢桿菌孢子穿過肺泡，特別地，在那里它們被巨噬細(xì)胞和樹突狀 細(xì)胞所吞噬。在這些細(xì)胞中所述孢子萌發(fā)，營養(yǎng)體型在淋巴結(jié)中擴(kuò)增。然后，細(xì)菌進(jìn)入血液 循環(huán)，連續(xù)復(fù)制并產(chǎn)生毒素，部分地對(duì)該疾病的致命特性負(fù)責(zé)。炭疽毒素由三種不同的蛋白 質(zhì)組成保護(hù)性抗原(PA，在細(xì)胞內(nèi)酶切割之前為83kDa，切割后為63kDa)，致死因子(LF， 90kDa)和水腫因子(EF,89kDa)。致死毒素由PA和LF形成；水腫毒素由PA和EF形成，在 疾病病理中的作用較不顯著。這些蛋白質(zhì)通過細(xì)菌作為無毒單體分泌，聚集在靶細(xì)胞表面上形成有毒復(fù)合物。到目前為止，已經(jīng)使用多種抗生素比如青霉素、多西環(huán)素和氟喹啉酮類(例如環(huán) 丙沙星)治療炭疽感染。但是，這些抗生素中的一些可能對(duì)一些對(duì)抗生素有抗性的菌株無效。特別地，這些 治療中的一些可能不可用于對(duì)抗恐怖主義或者細(xì)菌戰(zhàn)爭，在這些情況下可故意傳播抗生素 抗性株。另外，因?yàn)榭股夭荒芤种铺烤叶舅刈饔?，有必要將這些抗生素在感染的早期階 段施用，但是由于最初癥狀是非特異性的，所以很難建立早期診斷。已經(jīng)開發(fā)出主要成分是保護(hù)性抗原PA的疫苗，但是僅用于強(qiáng)烈懷疑接觸過炭疽 芽孢桿菌的人。另外，由于獲得足夠的免疫性需要幾個(gè)月的時(shí)間，所以這些疫苗不能用于緊 急情況。目前在法國，這些疫苗中沒有一種被批準(zhǔn)用于人體。因此，需要開發(fā)不同于抗生素 的新的治療和預(yù)防方法。通過抗體的被動(dòng)免疫是中和所述毒素的有效策略。已經(jīng)進(jìn)行了一些努力來使用針 對(duì)保護(hù)性抗原(PA)和致死因子(LF)的單克隆抗體中和炭疽致死毒素。通過使用抗體中和 炭疽致死毒素，例如可通過抑制PA與其細(xì)胞受體的結(jié)合、通過抑制PA切割、通過抑制PA與 LF的結(jié)合或者通過抑制LF作用來實(shí)現(xiàn)。因此，開發(fā)能夠中和炭疽毒素的新型抗體以預(yù)防和有效治療炭疽受到普遍關(guān)注。在最近的工作中，已經(jīng)用保護(hù)性抗原PA83免疫短尾猴，獲得用于治療炭疽毒素介 導(dǎo)的人感染的抗體。本發(fā)明人從骨髓擴(kuò)增了編碼PA83-特異抗體片段的基因，并對(duì)其克隆 以構(gòu)建文庫。已經(jīng)分離出稱為35PA83的高親和性(Kd = 3. 4nM)和強(qiáng)中和的片段(50%抑制濃5. 6+/~0. 13nM) (Laffly ^Α antimicrobial agents andchemotherapy, 2005,49 (8) 3414-3420)。免疫球蛋白片段35PA83通過抑制PA與其細(xì)胞受體的任何相互作用來中和炭疽毒但是，在準(zhǔn)備用于將此免疫球蛋白片段用于醫(yī)學(xué)(預(yù)防或治療)用途時(shí)，改善其親 和性可有利地降低施用給患者的量以及治療費(fèi)用。另一方面，因?yàn)樵撁庖咔虻鞍灼蔚脑?來源，其可帶來免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)以及人生物利用率的變化。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供獲得自所述免疫球蛋白片段35PA83的針對(duì)抗原 PA的IgGl或IgG2同種型的完全免疫球蛋白，其經(jīng)過預(yù)先修飾使得對(duì)抗原的親和性提高，并 具有與人抗體更大的相似性。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供針對(duì)炭疽毒素的保護(hù)性抗原(PA)的G類免疫球蛋 白(IgG)，其包含抗體35PA83的可變區(qū)，其已突變了少數(shù)殘基，以及一些人來源的恒定區(qū)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明IgG的核酸，以及包含這些核酸的載體和 含有該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含本發(fā)明IgG的組合物以及包含所述IgG的藥物組 合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的IgG在制備用于治療或預(yù)防炭疽芽孢桿菌 感染的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及炭疸毒素檢測試劑盒，體外檢測炭疽毒素的方法，以及含有本發(fā)明 IgG的免疫綴合物。發(fā)明詳述因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供針對(duì)炭疽毒素的保護(hù)性抗原(PA)的G類免疫球蛋 白(IgG)，其包含-輕鏈可變區(qū)，其包含與序列SEQID NO=I有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序 列，和-重鏈可變區(qū)，其包含與SEQID NO :2有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列，并 且包含分別對(duì)應(yīng)于25位絲氨酸殘基、54位賴氨酸殘基和60位精氨酸殘基的氨基酸殘基，其 特征在于由IgGl或IgG2組成。根據(jù)本發(fā)明，具有與參考的第二核酸至少90%同一性的第一核酸將具有與所述參 考的第二核酸至少 90%、優(yōu)選至少 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,97. 5%,98%, 98. 3%,98. 6%,99%,99. 6%的核苷酸同一性。根據(jù)本發(fā)明，具有與參考的第二多肽至少90%同一性的第一多肽將具有與所述參 考的第二多肽至少 90%、優(yōu)選至少 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,97. 5%,98%, 98. 3%,98. 6%,99%,99. 6%的氨基酸同一性。由通過比較窗口比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列來確定如本文使用的兩個(gè)核酸序列或兩 個(gè)多肽序列之間的“同一性百分比”。因此，所述比較窗口中核苷酸或氨基酸序列的部分可包含相比于參考序列(其不
5包含這些添加或缺失)的添加或缺失(例如“缺口”)，從而獲得兩個(gè)序列之間的最佳比對(duì)。通過下述步驟來計(jì)算同一性百分比確定相同的核酸堿基或相同氨基酸殘基位置 的數(shù)目，其可標(biāo)注于兩個(gè)比較的序列，然后將觀察到兩者的核酸堿基或兩者的氨基酸殘基 之間相同的位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)，之后將結(jié)果乘以100，獲得兩個(gè)序列之 間核苷酸同一性的百分比或者兩個(gè)序列之間氨基酸同一性的百分比?？赏ㄟ^計(jì)算機(jī)使用已知算法來進(jìn)行所述序列最佳比對(duì)的比較。最優(yōu)選地，使用CLUSTALW軟件(1. 82版)確定序列同一性百分比，其參數(shù)設(shè) 置如下(I)CPU MODE = Clustalff mp ； (2)ALIGNMENT = “ full “ ； (3)OUTPUT FORMAT =〃 aln w/numbers“ ； (4)OUTPUT ORDER = " aligned" ； (5)COLOR ALIGNMENT = " no"； (6)KTUP(word size) = “ default “ ； (7)WINDOW LENGTH = “ default “ ； (8)SCORE TYPE = “ percent “ ； (9)T0PDIAG = “ default “ ； (lO)PAIRGAP = “ default “ ； (11) PHYL0GENETIC TREE/TREE TYPE=" none" ； (12) MATRIX = 〃 default" ； (13) GAP OPEN ="default" ； (14) END GAPS = " default" ； (15) GAP EXTENSION = " default"； (16) GAP DISTANCES=" default" ； (17) TREE TYPE=" cladogram 〃禾口(18)TREE GRAP DISTANCES=" hide"。關(guān)于本發(fā)明抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)上突變的注釋，以及更一般性地補(bǔ)充 本發(fā)明抗體一些實(shí)施方案的說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可查閱2007年9月26日提交的法國專 利申請(qǐng)No. FR 07/06744 “用于抗炭疽毒素的抗體”的說明書，其內(nèi)容附在本說明書的最后， 從48頁至75頁。序列SEQ ID NO 2的25位絲氨酸殘基的存在對(duì)應(yīng)于圖11的“35H”部分上標(biāo)記為 “31A”的突變，在那里此突變也可稱為“G/S(31A) ”。序列SEQ ID NO 2的54位賴氨酸殘基的存在對(duì)應(yīng)于圖11的“35H”部分上突變 “66”，在那里此突變也可稱為“R/K(66) ”。序列SEQ ID NO 2的60位精氨酸殘基的存在對(duì)應(yīng)于可稱為“K/R(73) ”的突變，并 對(duì)應(yīng)于圖11的“35H”部分上73位精氨酸殘基。根據(jù)本發(fā)明，“對(duì)應(yīng)于”25位絲氨酸殘基、54位賴氨酸殘基和60位精氨酸殘基的殘 基組成上文所述的殘基，以及(i)其位于與序列SEQ ID NO 2具有至少90%同一性的序列中的相同位置，或(ii)其位于不同的位置，例如由于相比于作為參考的序列SEQ IDNO :2，與序列 SEQ ID NO :2具有90%同一性的序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或添加。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上文定義的G類免疫球蛋白(IgG)，其特征在于含 有-具有序列SEQID NO 1所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，和
-具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。已經(jīng)通過用炭疽的保護(hù)性抗原PA83免疫短尾猴獲得由Fd片段的輕鏈構(gòu)成的免疫 球蛋白片段35PA83，如Laffly等人(2005)所述?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法測定抗體的親和性“K/。親本非修飾抗體(即非突變的)35PA83具有3. 4 10_9M的親和KD。已經(jīng)從通過表 面等離振子共振實(shí)時(shí)測量的結(jié)合和解離常數(shù)計(jì)算得到此親和常數(shù)，如實(shí)施例中所述。
本發(fā)明IgG的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 1)來自于免疫球蛋白片段35PA83的輕鏈 可變區(qū)，其序列可獲得自計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫，如Genbank，登錄號(hào)為CAH17921和AJ810487。有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本發(fā)明IgG的輕鏈可變區(qū)另外 包含至少一個(gè)選自下列的突變-無/A(I)-無/I (2)-無/Q(3)-無/L(4)-Y/S(14)-K/R(18)-H/R(24)-L/V(124)。突變無/A(I)表示氨基酸“Α”添加在圖11 “35L”部分的序列1位處，以及序列 SEQ ID NO :1的-4位處，即如果存在的話殘基N°-3緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°1緊接著的上游。突變無/I⑵表示氨基酸“I”添加在圖11 “35L”部分的序列的2位處，以及序列 SEQ ID NO :1的-3位處，即如果存在的話殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基 N0-I緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°1緊接著的上游。突變無/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在圖11 “35L”部分的序列3位處，以及序列 SEQ ID NO :1的-2位處，S卩如果存在的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°1緊接著的上游。突變無/L(4)表示氨基酸“L”添加在圖11 “35L”部分的序列4位處，以及序列 SEQ ID NO 1的-1位處，即殘基N°1緊接著的上游。突變Y/S(14)表示位于圖11 “35L”部分的序列14位以及序列SEQ IDNO :1的10
位的氨基酸"Y"替換為氨基酸“S”。突變K/R(18)表示位于圖11 “35L”部分的序列18位以及序列SEQ IDNO :1的14 位的氨基酸"K"替換為氨基酸“R”。突變H/R(24)表示位于圖11 “35L”部分的序列24位以及序列SEQ IDNO :1的20 位的氨基酸"H"替換為氨基酸“R”。突變L/V(124)表示位于圖11 “35L”部分的序列124位以及序列SEQ IDNO 1的 100位的氨基酸"L"替換為氨基酸“V”。優(yōu)選地，添加這些突變中至少一個(gè)能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低 本發(fā)明IgG輕鏈可變區(qū)的免疫原性。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本發(fā)明IgG的輕鏈可變區(qū) 包含下列的突變-無/A(I)-無/I (2)-無/Q(3)
7
-無/L (4)。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本發(fā)明IgG的輕鏈可變區(qū) 包含下列的突變-無/A(I)-無/I(2)-無/Q(3)-無/L(4)-Y/S(14)-K/R(18)-H/R(24)-L/V(124)。優(yōu)選地，添加這些殘基能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低本發(fā)明IgG輕 鏈可變區(qū)的免疫原性。本發(fā)明IgG的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)來自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd 片段的可變區(qū)，其序列已在計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫中登記，如Genbank，可通過登錄號(hào)CAH17920和 AJ810486 獲取。有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)另外包含至少一個(gè) 選自下列的突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)-無/L(4)-無/Q(5)-無/E (6)-L/V(12)-Α/Τ (24)-Α/Τ (122)-V/L(123) ο突變無/Q⑴表示氨基酸“Q”添加在圖11上“35H”部分的序列1位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-6位處，S卩如果存在的話殘基N°-5緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°-4緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°-3緊接著的上游，或者如果不存在的話 殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話 殘基N°1緊接著的上游。突變無/V⑵表示氨基酸“V”添加在圖11上“35H”部分的序列2位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-5位處，S卩如果存在的話殘基N°-4緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°-3緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基 N0-I緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°1緊接著的上游。突變無/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在圖11上“35H”部分的序列3位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-4位處，S卩如果存在的話殘基N°-3緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°_2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°_l緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°1緊接著的上游。突變無/L(4)表示氨基酸“L”添加在圖11上“35H”部分的序列4位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-3位處，S卩如果存在的話殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基 N0-I緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°1緊接著的上游。突變無/Q (5)表示氨基酸“Q”添加在圖11上“35H”部分的序列的5位處，以及序 列SEQ ID NO :2的-2位處，S卩如果存在的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話 殘基N°1緊接著的上游。突變無/E(6)表示氨基酸“Ε”添加在圖11上“35Η”部分的序列的6位處，以及序 列SEQ ID NO 2的-1位處，即殘基N0I緊接著的上游。突變L/V(12)表示位于圖11上“35H”部分的序列的12位處以及序列SEQ ID NO 2的5位處的氨基酸"L"替換為氨基酸V。突變A/T(24)表示位于圖11上“35H”部分的序列的14位處以及序列SEQ ID NO 2的17位處的氨基酸"A"替換為氨基酸T。突變A/T(122)表示位于圖11上“35H”部分的序列的122位處以及序列SEQ ID NO :2的113位處的氨基酸〃 A"替換為氨基酸T。突變V/L的(123)表示位于圖11上“35H”部分的序列的123位處以及序列SEQ ID NO 2的114位處的氨基酸〃 V"替換為氨基酸L。優(yōu)選地，添加這些突變中至少一個(gè)能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低 本發(fā)明IgG重鏈可變區(qū)的免疫原性。本發(fā)明IgG的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)來自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd 片段的可變區(qū)，其序列已經(jīng)在計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫中登記，如Genbank，可通過登錄號(hào)CAH17920和 AJ810486獲取。與免疫球蛋白片段35PA83的可變區(qū)相比，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)經(jīng)過修飾，因?yàn)槠浒齻€(gè)下列突變:G/S(31A)、R/K(66)和K/R(73)。有利地，相比 于免疫球蛋白片段35PA83可變區(qū)，這三個(gè)突變使得能夠改善根據(jù)本發(fā)明IgG重鏈可變區(qū)的 親和性。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)另外包含下列 的突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)-無/L(4)-無/Q(5)-無/E(6)。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)另外包含下列 的突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)
9
-無/L(4)-無/Q(5)-無/E(6)-L/V(12)-Α/Τ (24)-Α/Τ (122)-V/L(123) ο優(yōu)選地，添加這些突變中至少一個(gè)能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低 本發(fā)明IgG輕鏈可變區(qū)的免疫原性。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述抗體的輕鏈可變區(qū)(SEQ IDNO=I)包含下 列突變-無/A(I)-無/I(2)-無/Q(3)-無/L(4)，以及，所述抗體的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)包含下列突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)-無/L(4)-無/Q(5)-無/E(6)。有利地，本發(fā)明IgG的輕鏈恒定區(qū)包含包含序列SEQ ID NO 3的氨基酸序列，重鏈 恒定區(qū)包含包含序列SEQ ID NO 4的氨基酸序列。出于說明本發(fā)明的目的，術(shù)語“免疫球蛋白”旨在表示具有特異性結(jié)合特定抗原能 力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子片段。公知的免疫球蛋白片段為例如F(ab' )2、 Fab、Fv、scFv 禾口 Fd 片段。G型免疫球蛋白(IgG)是由通過二硫鍵彼此結(jié)合的2條重鏈和2條輕鏈組成的異 二聚體。每個(gè)鏈由N端位置的所述免疫球蛋白針對(duì)的抗原特異性的可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域(輕鏈 由重排的基因V-J編碼，重鏈由V-D-J編碼)以及C端位置的恒定區(qū)構(gòu)成，所述恒定區(qū)對(duì)輕 鏈來說由單個(gè)結(jié)構(gòu)域CL或者對(duì)重鏈來說由三個(gè)結(jié)構(gòu)域(CHpCH2和CH3)組成。重鏈和輕鏈 的可變結(jié)構(gòu)域以及CH1和CL結(jié)構(gòu)域的相互作用形成Fab部分，其通過非常柔性的鉸鏈區(qū)與 Fc區(qū)域連接，使得每個(gè)Fab結(jié)合其抗原靶標(biāo)，同時(shí)介導(dǎo)所述抗體效應(yīng)子性質(zhì)的Fc區(qū)域保持 可接近免疫效應(yīng)子、吞噬細(xì)胞或殺傷細(xì)胞以及補(bǔ)體；這些恒定區(qū)不參與抗原的結(jié)合。由2個(gè) 球形結(jié)構(gòu)域CH2和CH3構(gòu)成的Fc區(qū)域在CH2結(jié)構(gòu)域上糖基化，在兩條鏈的每一條上存在結(jié) 合于Asn 297的乳糖胺類型的雙天線N-聚糖。關(guān)于可變區(qū)，其涉及所述抗體與其表位的結(jié)合。恒定區(qū)(Fe)已經(jīng)過酶促切割使得從其中保留絞鏈區(qū)的抗體稱為F(ab' )2片段， 其保留兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
類似地，其恒定區(qū)的絞鏈區(qū)已經(jīng)過酶促切割或者產(chǎn)生沒有該區(qū)域的恒定區(qū)的抗體 稱為Fab片段，其保留兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)。Fd片段由VH和CH1區(qū)域形成。決定互補(bǔ)性的區(qū)域(⑶R，互補(bǔ)決定區(qū))位于可變區(qū)中，也稱為高變區(qū)，其直接與抗 原相互作用。對(duì)CDR進(jìn)行修飾使得有可能修飾抗體的親和性。位于可變區(qū)中的第二種類 型區(qū)域稱為構(gòu)架區(qū)(FR)，其保留CDR的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這些構(gòu)架區(qū)對(duì)抗體來源的物種來說是相 對(duì)特異性的。有四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FRl至FR4)位于在重鏈和輕鏈的Fd片段中，其分別由三個(gè) CDR(CDR1 至 CDR3)所隔開。根據(jù)上文對(duì)本發(fā)明抗PA IgG的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸的描述，本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠合成或使得合成編碼這些氨基酸序列的核酸。有利地，本發(fā)明IgG的每個(gè)輕鏈和重鏈的恒定區(qū)是人恒定區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明IgG每個(gè)輕鏈的恒定區(qū)是κ類型。任何同種異型可適用于實(shí)施本 發(fā)明，例如Km(1)、Km(1，2)、Km(1，2，3)或Km(3)，盡管優(yōu)選的同種異型是Km(3)。每個(gè)抗體重鏈的恒定區(qū)可以是Yl型、Y 2型或Y 3型，這三種類型的恒定區(qū)具有 附著人補(bǔ)體的特征，或者Y 4型。優(yōu)選地，每個(gè)抗體重鏈的恒定區(qū)是Yl型，因?yàn)榇祟惪贵w能夠在最大量的個(gè)體 (人)中誘導(dǎo)ADCC活性。在這方面，任何同種異型可適用于實(shí)施本發(fā)明，例如Glm(3)、 Glm(l，2，17)、Glm(l，17)或 Glm(l，3)。優(yōu)選地，同種異型是 Glm(l，17)。有利地，本發(fā)明IgG的每個(gè)重鏈恒定區(qū)是Y 1型，包含SEQ ID NO 4的氨基酸序 列，本發(fā)明IgG的每個(gè)輕鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列。有利地，本發(fā)明的IgG的每個(gè)輕鏈包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列，本發(fā)明IgG的 每個(gè)重鏈包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明IgG的核酸。本發(fā)明IgG的每個(gè)輕鏈可變區(qū)由核酸序列SEQ ID NO 7編碼，根據(jù)本發(fā)明的每個(gè) 抗體重鏈的可變區(qū)由小鼠核酸序列SEQ ID NO 8編碼。在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，本發(fā)明IgG的每個(gè)重鏈恒定區(qū)由人核酸序列SEQ ID NO :9編碼，其每個(gè)輕鏈恒定區(qū)由人核酸序列SEQ ID N0:10編碼。更特定地，根據(jù)本發(fā)明的每個(gè)抗體輕鏈由核酸序列SEQ ID NO 11編碼，每個(gè)重鏈 由核酸序列SEQ ID NO 12編碼。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含編碼本發(fā)明IgG的核酸的載體。本文使用的“載體”表示可通過限制性酶切然后連接插入目的序列的核酸，其用于 轉(zhuǎn)移到多種遺傳環(huán)境及其中或者用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)。載體例如是質(zhì)粒、粘粒、酵母人工 染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)和來源于噬菌體Pl的人工染色體(PAC)、病毒來源的 載體?？寺≥d體是能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的載體，其另外的特征在于存在一個(gè)或多個(gè)核酸 內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)。表達(dá)載體是其中通過限制性酶切或連接的方法插入了目的DNA序列使 得能夠復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄成RNA的載體。所述載體可另外含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物，用以選擇 或鑒定已經(jīng)被所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些核酸可引入到重組載體中，用以克隆或表達(dá)本發(fā)明的抗體。本發(fā)明包括所有用于真核或原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或基因治療的含編碼序列的重組載體。根據(jù)分子生物學(xué)的常規(guī)方法制備這些載體，其還包含合適的啟動(dòng)子，任選地用于輸出 或分泌的信號(hào)序列以及所述核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)序列。純化本發(fā)明抗體可能需要融合多肽。所述融合結(jié)構(gòu)域可包含例如多組氨酸尾，其 使得能夠在M2+柱上純化或者絲狀噬菌體膜錨，其特別可用于根據(jù)稱為“噬菌體展示”的技 術(shù)篩選文庫。適用于本發(fā)明背景的載體有適于接受和表達(dá)第一和第二 DNA序列的重組DNA分 子，使得能夠表達(dá)異二聚化抗體，例如根據(jù)本發(fā)明的全長抗體或F(ab' )2或Fab片段。這 些載體提供了在載體中所存在的兩個(gè)分開的盒中獨(dú)立克隆兩種DNA序列的系統(tǒng)，使得形成 表達(dá)所述異二聚體抗體的第一和第二多肽的兩個(gè)分離的順反子。這些表達(dá)載體稱為雙順反 子載體。本發(fā)明的經(jīng)修飾抗體可在真核細(xì)胞比如CHO細(xì)胞或者人或小鼠雜交瘤細(xì)胞例如 以及轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供原核或真核的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的載體。有利地，本發(fā)明表達(dá)載體使得能夠表達(dá)本發(fā)明IgG的輕鏈。在此特定實(shí)施方案中， 所述載體是核酸分子，其中插入了編碼每個(gè)IgG輕鏈的可變區(qū)的核酸序列SEQ ID N0:7以 及編碼每個(gè)抗體輕鏈的恒定區(qū)的核酸序列SEQ ID NO :10，從而將它們引入宿主細(xì)胞并保持 于其中。其使得能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)這些核酸外源片段，因?yàn)槠渚哂写吮磉_(dá)所需的序列 (啟動(dòng)子、多腺苷化序列、選擇基因)。這些載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以是腺病毒、 逆轉(zhuǎn)錄病毒、質(zhì)?；蚴删w，此列表是非限制性的。另外，任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞可用作宿主細(xì) 胞，也就是說表達(dá)本發(fā)明IgG輕鏈的表達(dá)載體所攜帶的核酸片段的細(xì)胞，例如YB2/0、CH0、 CHO dhfr-(例如 CHO DXBl 1、CHO DG44)、CHO Lecl3、SP2/0、NS0、293、BHK 或 COS。有利地，本發(fā)明的表達(dá)載體使得能夠表達(dá)本發(fā)明IgG的重鏈。在此特定實(shí)施方案 中，所述載體是使得能夠表達(dá)本發(fā)明IgG的分子，其重鏈由核酸序列SEQ ID N0:12所編 碼。此載體是核酸分子，其中已經(jīng)插入編碼每個(gè)IgG重鏈的可變區(qū)的核酸序列SEQ ID NO 8以及編碼每個(gè)抗體重鏈的恒定區(qū)的核酸序列SEQ ID NO :9，使得將它們引入宿主細(xì)胞并 將其保持在那里。其使得能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)這些核酸外源片段，因?yàn)槠渚哂写吮磉_(dá)所 需的序列(啟動(dòng)子、多腺苷化序列、選擇基因)。如上所述，所述載體可以是例如質(zhì)粒、腺 病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或噬菌體，并且宿主細(xì)胞可以是任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如YB2/0、CHO、CHO dhfr- (CHO DX Bll、CH0DG44)、CHO Lecl3、SP2/0、NS0、293、BHK 或 COS。本發(fā)明的載體可包含編碼本發(fā)明免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈的序列。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明IgG重鏈和輕鏈表達(dá)的載體實(shí)例在實(shí)施例2中給出。此載體是含有針 對(duì)本發(fā)明IgG的重鏈和輕鏈的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的獨(dú)特載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含例如如上所述定義的載體的宿主細(xì)胞。有利地，本發(fā)明宿主細(xì)胞選自SP2/0，YB2/0, IR983F，Namalwa人骨髓瘤， PERC6, CHO 細(xì)胞系，特別是 CH0-K-1，CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec 13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4，C0S-7，293-ΗΕΚ，BHK, Κ6Η6, NSO, SP2/0_Ag 14 和 P3X63Ag8. 653。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在YB2/0大鼠雜交瘤(YB2/3HL.P2.G11. 16Ag. 20細(xì)胞，其 以登錄號(hào)ATCC CRL-1662提交于美國典型培養(yǎng)物保藏中心)中產(chǎn)生所述抗體。選擇該細(xì)胞系是因?yàn)槠淠軌虍a(chǎn)生具有ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)活性的抗體，其相比于 在例如CHO細(xì)胞中獲得的類似一級(jí)結(jié)構(gòu)的抗體有改善。在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，表達(dá)本發(fā)明抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系，更特別地選自上述的 那些群體，整合了例如上述的重鏈和輕鏈的表達(dá)載體之一或之二。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含至少一種本發(fā)明IgG的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含至少一種本發(fā)明IgG的藥物組合物。所述藥物組合物優(yōu)選地包含可藥用載體。本文使用的這些載體旨在表示不干擾所 述組合物活性組分生物活性效力的無毒材料。表述“可藥用”指與生物學(xué)體系例如細(xì)胞、細(xì) 胞培養(yǎng)物、組織或有機(jī)體相容的無毒材料。所述載體的特征依賴于施用方法。本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明的IgG在制備用于治療或預(yù)防炭疽芽孢桿菌感染的 藥物組合物或藥物中的用途。本文使用的術(shù)語“預(yù)防”意為在個(gè)體特別是人中疾病尚未出現(xiàn)之前防止所述疾病 的發(fā)生。本文使用的術(shù)語“治療”對(duì)應(yīng)于對(duì)該疾病的抑制，即停止其發(fā)展、消退、或者疾病的 癥狀和后果消失、或者疾病的原因消失?？蓸?biāo)記本發(fā)明的IgG。合適標(biāo)志物的例子包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠體 金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。標(biāo)志物與抗體的結(jié)合方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。另一種標(biāo)記方法為將所述抗體與低分子量半抗原偶聯(lián)，所述半抗原可通過第二反 應(yīng)進(jìn)行具體修飾。合適半抗原的例子包括生物素，其與親和素反應(yīng)，或者二硝基酚、吡哆醛 或熒光素，其與抗半抗原特異性抗體反應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含PA炭疽毒素檢測試劑盒。該試劑盒包含-包含至少一種本發(fā)明抗PAIgG的容器，該抗體帶有標(biāo)記或未帶標(biāo)記，-任選地，包含緩沖溶液的容器，-和任選地包含帶標(biāo)記IgG檢測工具的容器，例如與報(bào)告分子如熒光或酶標(biāo)記物 相結(jié)合的生物素-結(jié)合蛋白，如親和素或鏈霉親和素。此容器還可包含非標(biāo)記的IgG檢測 工具，即基本上的抗體或抗體片段。本發(fā)明的IgG可用于體外，例如在免疫學(xué)測定中，其中它們在液相中或者固定于 固相載體上使用。公知載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖、尼龍、淀粉 酶、天然或改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖或磁鐵。使用本發(fā)明抗PA IgG的免疫學(xué)測定的 實(shí)例有放射性免疫測定、組織免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)、ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀測定、免疫擴(kuò) 散測定、補(bǔ)體固定測定、熒光激活細(xì)胞分選測定(Fluorescence-activatedCell Sorting, FACS)或者蛋白質(zhì)芯片分析。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于體外檢測生物樣品中含PA炭疽毒素的方法，其 包括下列步驟-將所述樣品與包含至少一種本發(fā)明抗PAIgG相接觸，和-檢測所述抗體的結(jié)合，作為所述炭疽毒素的存在的指示。生物樣品可以是液體例如唾液、尿、腦脊液、血清或血液，或者固體或半固體，例 如組織或糞便或?qū)嶓w組織例如常規(guī)用于組織學(xué)診斷的。
13
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于體內(nèi)檢測含PA炭疽毒素的方法，其中向個(gè)體施 用帶標(biāo)記的本發(fā)明IgG。帶標(biāo)記IgG的施用量應(yīng)足以使得所述抗體結(jié)合待檢測的毒素。帶 標(biāo)記IgG的施用量取決于一些因素，例如個(gè)體的年齡和性別，以及疾病的階段。所述施用量 可以為 0. 01mg/kg 至 50mg/kg 不等，優(yōu)選 0. lmg/kg 至 20mg/kg，更優(yōu)選 0. lmg/kg 至 2mg/kg。為了實(shí)施體內(nèi)診斷，本發(fā)明經(jīng)修飾的抗PA IgG應(yīng)直接或通過官能團(tuán)間接與放射性 同位素相連。通常使用的官能團(tuán)包括例如二亞乙基-三胺-五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙 酸(EDTA)。放射性同位素金屬離子的例子包括mIn，97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As,89&和2Q1T1。為了使用磁共振成像(MRI)或者通過電子自旋共振(ESR)進(jìn)行診斷，經(jīng)修飾的本 發(fā)明抗PA IgG也可用順磁同位素標(biāo)記。還可使用發(fā)射正電子的Y放射性同位素，例如 157Gd, 55Mn, 162Dy, 68Ga, 52Cr 和 56Fe0本發(fā)明的IgG也可用于體外或體內(nèi)監(jiān)測疾病治療的發(fā)展，例如通過確定炭疽毒素 靶向的細(xì)胞數(shù)增加或減少，或者生物樣品中PA毒素濃度的變化。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供治療可能被炭疽芽孢桿菌感染的個(gè)體、優(yōu)選人的方法， 其中向所述個(gè)體施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明修飾的抗PA抗體。本文使用的表述“治療有效量”旨在表示在施用給需要治療的個(gè)體時(shí)足以實(shí)施該 治療的量。治療有效量取決于個(gè)體、所治療疾病的階段以及施用方法，其由本領(lǐng)域技術(shù)人員 通過常規(guī)程序確定。本文使用的術(shù)語“炭疽，，旨在表示任何由炭疽芽孢桿菌感染直接地或間接地造成 的疾病。吸入感染的最初癥狀與鼻炎類似(發(fā)燒、肌肉痛)。數(shù)天后，這些癥狀發(fā)展為呼吸 困難和膿毒性休克的嚴(yán)重問題。吸入炭疽細(xì)菌通常是致命的。在細(xì)菌通過之前存在的皮膚間隙穿透皮膚時(shí)，發(fā)生炭疽皮膚感染。此感染最初導(dǎo) 致形成丘疹，其在兩到三天內(nèi)發(fā)展成小泡，之后發(fā)展為1至3厘米直徑的潰瘍，中心有壞死 區(qū)域。炭疽腸胃傳染是由攝入受污染的肉引起的，其特征在于腸道急性炎癥。治療有效量對(duì)應(yīng)于足以減輕少疾病癥狀和感染發(fā)展的量。該量根據(jù)個(gè)體的年齡和 性別以及疾病階段而不同，由本領(lǐng)域技術(shù)人員所決定。治療有效量可以是每天一劑或多劑 中 0. 0lmg/kg 至 50mg/kg 不等，優(yōu)選 0. lmg/kg 至 20mg/kg,更優(yōu)選 0. lmg/kg 至 2mg/kg,持 續(xù)一天或更長。施用方法可以是注射或逐漸輸注。注射可以是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或者透 皮類型。用于胃腸外施用的制劑可包含無菌水溶液或非水溶液、混懸液或乳劑。非水溶劑 的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖或者可注射有機(jī)酯例如油酸乙酯。水載體包 括水、醇/水溶液、乳劑或混懸液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供免疫綴合物，其包含與治療劑直接或間接相結(jié)合的本 發(fā)明IgG。這些治療劑包括化學(xué)劑、放射性核素、免疫治療劑、細(xì)胞因子、趨化因子、毒素或酶 抑制劑。毒素的例子有白喉毒素A鏈、外毒素A鏈、篦麻毒蛋白A鏈、紅豆堿A鏈、蒴蓮根 毒蛋白A鏈、α-帚曲毒素、Aleurite fordii蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白、石堿草(sapaonaria officinalis)抑制劑、多花白樹毒蛋白、mitogelline、局限曲菌素(restrictocine)、酚霉
14素(phenomycine)、enomycine 禾口 tricothecenes。放射性核素的例子包括 212Bi, 1311，131In, 90Y 和 186Re。有利地，本發(fā)明IgG與基于四環(huán)素的預(yù)防性治療相結(jié)合。通過在基于四環(huán)素的快 速治療(“短期治療”)之后注射本發(fā)明IgG，本發(fā)明IgG通過在暴露風(fēng)險(xiǎn)之后以安全的方 式停止使得能夠縮短基于四環(huán)素的預(yù)防。有利地，本發(fā)明IgG與使用環(huán)丙沙星的治愈性治療相結(jié)合。使用下列有關(guān)抗PA IgG制劑例子的補(bǔ)充描述更容易理解本發(fā)明。


在下列實(shí)施例中，將提及下文以舉例形式給出的附圖圖1 區(qū)域VKV2(本發(fā)明IgG的輕鏈可變區(qū)，其包含表1所述的突變)的擴(kuò)增示意 圖。圖2 區(qū)域VHV2 (本發(fā)明IgG的重鏈可變區(qū)，其包含表2所述的突變)的擴(kuò)增示意 圖。圖 3 載體 CHK463-23 的圖。圖 4 載體 HK558-12 的圖。圖5 使用IgG 35PA83v2(包含表1和表2所述突變的本發(fā)明IgG)的預(yù)防性治療。 2mg/kg的IgG 35PA83v2使得能夠獲得60%的存活率，5mg/kg使得能獲得100%的存活。直 至第30天，未觀察到新事件。圖6 使用四環(huán)素的預(yù)防性治療。在第7天后停止四環(huán)素施用，該治療停止后第4 至第7天之間所有小鼠死亡。圖7:使用多西環(huán)素的預(yù)防性治療，補(bǔ)充或不補(bǔ)充IgG 35PA83。在A/J小鼠中起 始基于四環(huán)素的治療(5mg/kg的每日劑量)。12小時(shí)后，用10 OOOLD50的Sterne菌株孢子 感染動(dòng)物。在注射或不注射35PA83(1或2mg/kg)的情況下，在治療的第7天停止四環(huán)素注 射。超過圖上所示時(shí)間段未觀察到特殊事件(第500小時(shí))。在圖上用符號(hào)"指示 出高度顯著的作用。圖8:基于環(huán)丙沙星的治療，IgG 35PA83v2或其兩者。單獨(dú)使用環(huán)丙沙星或IgG 35PA83v2基本上沒有存活，而兩種分子的組合實(shí)現(xiàn)了 80%的存活率。直至第30天，未觀察 到新事件。圖9 使用補(bǔ)充或未補(bǔ)充IgG 35PA83的環(huán)丙沙星的治療。用IOOOLD5q的Steme孢 子感染A/J小鼠。感染后12小時(shí)，在兩個(gè)獨(dú)立的組中(每組10只動(dòng)物)，開始單獨(dú)的基于 環(huán)丙沙星的治療(每天兩次25mg/kg)，持續(xù)5天，或者注射單劑IgG 35PA83 (10mg/kg)。在 感染后的三個(gè)不同時(shí)間(12、24或48小時(shí))，每次由不同組的動(dòng)物參加，小鼠接受聯(lián)合的基 于環(huán)丙沙星的治療(每天兩次25mg/kg，共5天)加一次注射IgG 35PA83 (lOmg/kg)。超 過圖上所示時(shí)間段未觀察到特殊事件(第150小時(shí))。在圖上用符號(hào)"*" (ρ = 0.03) 或"(ρ = 0. 0007)指示出顯著作用。圖10 使用IgG 35PA83的被動(dòng)預(yù)防性治療。感染(IOOOOLD5q)之前12小時(shí)施用一 次35PA83注射(2mg/kg或5mg/kg)。在第30天，對(duì)30天后仍然存活的小鼠再次感染(10 OOOLD5tl)。超過圖上所示時(shí)間段未觀察到特殊事件(第40天)。在圖上用符號(hào)〃 ***〃指示出高度顯著的作用(P = 0. 0001)。圖11 非突變35PA83抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的珍珠串構(gòu)型。IMGT珍珠串構(gòu)型是與IMGT命名法一致的。點(diǎn)表示非常類似于35PA83的人基因與 35PA83的差異。陰影環(huán)對(duì)應(yīng)于根據(jù)IMGT命名法的缺失位置。
實(shí)施例實(shí)施例1 構(gòu)津Fab(35PA83)突變體文庫材料和方法大腸桿菌菌株使用下列大腸桿菌菌株-XLl (Stratagene, the jolla, CA) :recAl, endAl, gyrA96 thi-1 hsdR17sup E44 relAl lac[F' proAB lacIqZAM15 TnlO(Tetr)].-SURE(Stratagene) :el4(McrA) Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endAlsupE44 thi-1 gyrA96 relAl lac recB recj sbcC umuC::Tn5(Kanr)uvrC[F ' proAB IacIqZ Δ M15 TnlO(Tetr)]-HB2151 (Carte 等人，1985)，用于表達(dá)可溶性 Fab。毒素炭疽毒素(PA83，LF和EF)獲得自List實(shí)驗(yàn)室。構(gòu)建35PA83突變體文庫構(gòu)建免疫球蛋白片段35PA83的突變體以人源化。通過實(shí)施如表3和4中所述的 突變獲得該突變體表1 為了人源化35PA83輕鏈的突變
權(quán)利要求
針對(duì)炭疽毒素保護(hù)性抗原(PA)的G類免疫球蛋白(IgG)，其包含 輕鏈可變區(qū)，其包含與序列SEQ ID NO1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包含與SEQ ID NO2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，并且包含對(duì)應(yīng)于25位絲氨酸殘基、54位賴氨酸殘基和60位精氨酸殘基的氨基酸殘基，其特征在于它由IgG1或IgG2組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的G類免疫球蛋白，其特征在于它包含 -具有序列SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，和 -具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的IgG，其特征在于輕鏈可變區(qū)(SEQID No 1)包含選自下列的至 少一個(gè)突變-無/A⑴ -無/I⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -Y/S(14) -K/R(18) -H/R(24) -L/V(124)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的IgG，其特征在于輕鏈可變區(qū)(SEQID No 1)包含下列突變 -無/A⑴-無/I⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -Y/S(14) -K/R(18) -H/R(24) -L/V(124)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的IgG，其特征在于重鏈可變區(qū)(SEQIDNo 2)包含選自下 列突變的至少一個(gè)突變-無/Q⑴ -無/V⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -無/Q (5) -無/E (6) -L/V(12) -Α/Τ (24) -Α/Τ(122) -V/L(123)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的IgG，其特征在于具有序列SEQID NO :2所示氨基酸序列的重鏈 可變區(qū)包含下列突變-無/Q⑴ -無/V⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -無/Q (5) -無/E (6) -L/V(12) -Α/Τ (24) -Α/Τ(122) -V/L(123)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的IgG，其特征在于其輕鏈恒定區(qū)包含序列SEQID NO 3 所代表的氨基酸序列，并且重鏈恒定區(qū)包含由序列SEQID NO :4代表的氨基酸序列。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的IgG，其特征在于其每個(gè)重鏈的恒定區(qū)為Yl型。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的IgG，其特征在于其每個(gè)重鏈的恒定區(qū)為Yl型并且包 含氨基酸序列SEQ ID NO :7，并且其每個(gè)輕鏈的恒定區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No :8。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的IgG，其特征在于其每個(gè)輕鏈包含氨基酸序列SEQID NO :9，并且其每個(gè)重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。
11.編碼權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)抗體的核酸。
12.包含權(quán)利要求11的核酸的載體。
13.包含權(quán)利要求12的載體的宿主細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自SP2/0，YB2/0,IR983F， Namalwa 人骨髓瘤，PERC6, CHO 細(xì)胞系，特別是 CHO-K-l，CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec 13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4，C0S-7，293-ΗΕΚ，BHK, Κ6Η6, NS0, SP2/0-Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的細(xì)胞。
15.包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的人IgG的組合物。
16.包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的人IgG的藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的人IgG在制備用于治療或預(yù)防炭疽芽孢桿菌感染的 藥物中的用途。
18.用于檢測含PA炭疽毒素的試劑盒，所述試劑盒包含-包含至少一種標(biāo)記的根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的IgG的容器，和 -包含檢測此經(jīng)標(biāo)記的IgG之工具的容器。
19.體外檢測生物學(xué)樣品中含PA炭疽毒素的方法，其包括下列步驟 -將所述樣品與至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的IgG相接觸，和 -檢測所述IgG的結(jié)合，作為所述炭疽毒素存在的指示。
20.免疫綴合物，其包含與治療劑結(jié)合的根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的IgG。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)炭疽毒素保護(hù)性抗原(PA)的G類免疫球蛋白(IgG)，其包含輕鏈可變區(qū)，其包含與如說明書中所定義的序列SEQ ID NO1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包含與如說明書中所定義的SEQ ID NO2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，其特征在于它由IgG1或IgG2組成。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101952311SQ200880118635
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者C·貝朗, P·蒂利耶 申請(qǐng)人:Lfb生物技術(shù)公司;由軍事總代理代表的法國國家