專(zhuān)利名稱(chēng)：表達(dá)可溶性fgf-21的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別是涉及表達(dá)可溶性人成纖維生長(zhǎng)因子21，即FGF-21的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的三大疾病之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。預(yù)計(jì)到 2025年，全球糖尿病的發(fā)病率將接近成年人的7%。糖尿病不僅僅是心血管疾病的危險(xiǎn)因素，還導(dǎo)致全球每30秒就有1人需要截肢，它也是引起腎衰竭和失明的首要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)， 每年約有350萬(wàn)人死于糖尿病。美國(guó)每年治療2型糖尿病總共需花費(fèi)1320億美元，因此開(kāi)發(fā)高效低價(jià)的糖尿病新藥具有廣闊的市場(chǎng)前景。根據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)估算，美國(guó)糖尿病患者中，90%以上是2型糖尿病患者。2型糖尿病是一種包括胰島素分泌減少、外周組織胰島素抵抗、進(jìn)行性β細(xì)胞功能不全、血糖控制進(jìn)行性惡化以及大血管和微血管并發(fā)癥危險(xiǎn)性增加等在內(nèi)的多因子疾病，它的發(fā)病是以餐后高血糖和空腹高血糖為特征的。對(duì)大部分人而言，高血糖的產(chǎn)生是由于胰腺β細(xì)胞分泌的胰島素不足以補(bǔ)償外周組織中的胰島素抵抗。目前，胰島素是被廣泛使用的降糖藥，但用胰島素治療2型糖尿病可能會(huì)產(chǎn)生低血糖、體重增加、過(guò)敏、浮腫等副作用，因此在臨床上存在一定的用藥風(fēng)險(xiǎn)。FGF-21是最近發(fā)現(xiàn)的FGF基因家族中的一位新成員。相關(guān)研究表明FGF-21是一非常有意義的保護(hù)糖代謝穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞因子，具有胰島素類(lèi)似的作用，能抑制胰高血糖素的分泌，促進(jìn)脂肪組織對(duì)葡萄糖的吸收，增加胰島素的敏感性，因此FGF-21可以作為今后一種新的降糖藥物。FGF-21的生物學(xué)功能主要有幾方面(1)降低血糖和類(lèi)胰島素作用，能調(diào)節(jié)糖代謝。主要可能是通過(guò)上調(diào)GLUT-I的表達(dá)促進(jìn)脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取、抑制胰高血糖素的分泌、增加胰島素敏感性、保護(hù)胰腺β 細(xì)胞、促進(jìn)胰島素合成、調(diào)節(jié)血液循環(huán)中脂肪細(xì)胞因子等功能來(lái)降低血糖。但與胰島素不同的是，其降血糖作用起效慢、作用強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，它不會(huì)引起胰島素受體酪氨酸磷酸化。任何劑量的FGF-21均未引起低血糖的發(fā)生以及體重的增加。這些說(shuō)明FGF-21是非胰島素依賴性的，它與胰島素共同作用具有疊加效應(yīng)。(2)調(diào)節(jié)脂代謝，降低甘油三酯的水平，改善脂代謝的紊亂。血漿甘油三酯(TG)降低幅度呈劑量依賴性，而且能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。(3)抵抗飲食誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生，能通過(guò)減輕體重來(lái)改善胰島素抵抗，是代謝綜合征的獨(dú)立相關(guān)因素。(4)FGF-21是FGF基因家族中的一員，但相關(guān)研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤的發(fā)生以及其他任何組織的增生，說(shuō)明FGF-21不會(huì)促進(jìn)有絲分裂，從而為今后FGF-21用于糖尿病治療的安全性提供了依據(jù)。綜上所述，F(xiàn)GF-21有明顯的優(yōu)勢(shì)，可開(kāi)發(fā)為新型治療2型糖尿病新型的降糖藥物。
但是，根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究情況，由于大腸桿菌自身在表達(dá)外源目的蛋白的限制， FGF-21在大腸桿菌中主要是以包涵體形式表達(dá)，難以獲得高效穩(wěn)定的可溶性表達(dá)。國(guó)外對(duì)FGF-21的研究還不多，Kharitonenkov等人最早以pET30a為載體，在大腸桿菌中表達(dá) FGF-21，但是 FGF-21 僅以包涵體形式存在。(A. Kharitonenkov, Τ. L. Shiyanova, A. Koester, et al. FGF-21 as anovel metabolic regulator. The Journal of clinical investigation, 2005,115 :1627-1635.)。在其他FGF-21相關(guān)研究中，研究人員也多采用 Kharitonenkov等人的方法來(lái)表達(dá)純化FGF-21。雖然分子伴侶作為一種能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊的蛋白質(zhì)，它能使蛋白質(zhì)獲得正確的構(gòu)型，增強(qiáng)其可溶性。但是，本發(fā)明所采用的方法，即在同一菌體內(nèi)，使用含有分子伴侶基因的質(zhì)粒，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)分子伴侶蛋白，進(jìn)而促進(jìn)FGF-21的可溶性表達(dá)，在目前國(guó)內(nèi)外FGF-21研究中尚未見(jiàn)有報(bào)道。另外，在基因工程表達(dá)外源目的蛋白時(shí)，人們常選用pET系統(tǒng)的質(zhì)粒，這是因?yàn)樵摫磉_(dá)系統(tǒng)有如下優(yōu)點(diǎn)含有強(qiáng)啟動(dòng)子T71ac，T7RNA聚合酶特異性識(shí)別T7啟動(dòng)子，從而開(kāi)啟下游基因的大量轉(zhuǎn)錄；T7mRNA比較穩(wěn)定；T7mRNA帶有較強(qiáng)的翻譯信號(hào)。但是T7表達(dá)系統(tǒng)也有其不足之處，蛋白的表達(dá)需要用IPTG誘導(dǎo)，步驟比較繁瑣。而且，一定濃度的IPTG會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性，直接影響蛋白的表達(dá)效率。另外，由于lac mRNA本底水平的組成型合成， 可導(dǎo)致目的蛋白的少量表達(dá)。研究表明，非目的性表達(dá)出的目的蛋白可能會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的不穩(wěn)定、甚至喪失表達(dá)的會(huì)邑力。(F. W. Studier. Protein production by auto-induction inhigh一density shaking cultures. Protein Expression and Purification,2005,41 207-234.) (J. Meerman, G.Georgiou. Construction and characterization of a set of E.coli strains deficent in allknown loci affecting the proteolytic stability of secreted recombinant proteins. Biotechnology, 1994，12 :1107-1110.)此夕卜，目前培養(yǎng)大腸桿菌一般使用LB培養(yǎng)基，其組分之一是胰蛋白胨，由于胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白后的產(chǎn)物，而酪蛋白一般是從牛奶或大豆中提取的，因此，胰蛋白胨中存在的微量乳糖成分會(huì)促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生非目的性表達(dá)，從而影響表達(dá)量。本發(fā)明采用的利用自誘導(dǎo)表達(dá)外源目的蛋白的方法解決了以上現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，既抑制非目的性目的蛋白表達(dá)，又表達(dá)效率高、操作簡(jiǎn)潔。自誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基中同時(shí)加入葡萄糖和乳糖，大腸桿菌會(huì)優(yōu)先利用葡萄糖，在葡萄糖耗盡前，不會(huì)誘發(fā)Iac操縱子。當(dāng)葡萄糖耗盡，乳糖開(kāi)始發(fā)揮作用，開(kāi)啟T7表達(dá)系統(tǒng)，而乳糖的代謝產(chǎn)物也同時(shí)作為細(xì)菌生長(zhǎng)的碳源。另外，自誘導(dǎo)的方法省去了監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的菌密度和添加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的步驟，一方面使得實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)潔，另一方面避免了 IPTG對(duì)細(xì)菌的毒害作用。通過(guò)自誘導(dǎo)方法，得到的生物量和FGF-21蛋白的產(chǎn)量均高于IPTG方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種可溶性表達(dá)重組人成纖維生長(zhǎng)因子21，即FGF-21的基因工程菌，用于生產(chǎn)可溶性、產(chǎn)量高、且成本低的FGF-21。本發(fā)明的一個(gè)目的是提出一種可溶性表達(dá)FGF-21的基因工程菌。該基因工程菌包括攜帶重組質(zhì)粒PETShW-Pmae-1TrxAIXHis-FGFjl的大腸桿菌DH5 α，以及同時(shí)攜帶重組質(zhì)粒 pET3h W-Pmae-1TrxAIXHis-FGFH 和質(zhì)粒 pTf 16_PaMB_tig 的大腸
5桿菌 BL21 (DE3)，其中，所述的重組質(zhì)粒 pET3h (+) -PT71a。-TrxA_6 X His-FGF-21 中的 Pmac 是質(zhì)粒pET3h(+)的啟動(dòng)子，TrxA是硫氧還蛋白，6XHis是組氨酸純化標(biāo)簽，所述質(zhì)粒 pTfl6-ParaB-tig中的ParaB是質(zhì)粒pTfl6的啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一目的是提供一種可溶性表達(dá)FGF-21的基因工程菌的構(gòu)建方法。根據(jù)FGF-21的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得FGF-21雙鏈DNA，經(jīng)酶切，插入質(zhì)粒 pET32a(+)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pET3h(+)-Pma。-TrxA-6XHis-FGF-21，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α， 制得含TOF-21DNA序列的基因工程菌，再將質(zhì)粒pTf 16-PaMB-tig和重組質(zhì)粒pET3h(+) -Pt 71ac-TrxA-6XHis-FGF-21分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案第一步FGF-21DNA序列的擴(kuò)增以含有FGF-21DNA相關(guān)序列的質(zhì)粒pD0NR223-FGF_21作為模板，發(fā)明人通過(guò)委托專(zhuān)業(yè)的生物技術(shù)公司提供所述質(zhì)粒PD0NR223-FGF-21。根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得FGF-21DNA序列，同時(shí)在該序列兩端引入酶切位點(diǎn)Bgl II和EcoR I。PCR產(chǎn)物用DNA GelExtraction Kit 回收，獲得 FGF-21DNA 片段，即 SEQ ID NO. 1 序列。FGF-2IDNA 序列5’ CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACA CAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGC CCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCT GTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTC TTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACAC CGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACCCCCGGAGCCACCCGG AATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCC CCAGCTACGCTTCCTGA3，(546bp)，即 SEQ ID NO. 1 序列。所用引物為Fl :5，GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3’，即 SEQ ID NO. 2 序列。BglIIF2 :5，ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3’，即 SEQ ID NO. 3 序列。EcoR I第二步構(gòu)建含F(xiàn)GF-21基因序列的基因工程菌用限制性內(nèi)切酶Bgl II和EcoR I分別雙酶切所述第一步獲得的FGF-21DNA片段和質(zhì)粒pET3h (+)，分別純化回收大片段，并將其連接，得到含F(xiàn)GF-21DNA片段的重組質(zhì)粒 pET32a (+) -PT71ac-TrxA-6 X Hi s-FGF-21，將重組質(zhì)粒 pET32a (+) -PT71ac-TrxA-6 X Hi s-FGF-21 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，獲得含F(xiàn)GF-21DNA序列的基因工程菌。委托專(zhuān)業(yè)的生物技術(shù)公司對(duì)該基因工程菌測(cè)序，證實(shí)該基因工程菌含正確如SEQ ID NO. 1所示的FGF-21基因片段。第三步構(gòu)建可溶性表達(dá)FGF-21的基因工程菌將質(zhì)粒pTf 16-ParaB_tig 和重組質(zhì)粒 pET3h (+) -PT71a。-TrxA_6 X Hi s-FGF-21 分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌。上述構(gòu)建涉及到的質(zhì)粒pET3h(+)，大腸桿菌DH5 α、BL21 (DE3)，限制性內(nèi)切酶BglII和EcoR I, Ex Taq DNA聚合酶，以及能夠表達(dá)分子伴侶蛋白的質(zhì)粒pTf 16-ParaB_tig 均可從市場(chǎng)購(gòu)得。委托合成所述引物序列的生物技術(shù)公司是上海英駿生物技術(shù)有限公司， 委托測(cè)序的生物技術(shù)公司是上海博尚生物技術(shù)有限公司。本發(fā)明另一目的在于提供采用本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)可溶性FGF-21的生產(chǎn)方法，操作步驟如下第一步液體培養(yǎng)將上述構(gòu)建好的表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)條件是37°C，210rpm。再將培養(yǎng)12小時(shí)的菌液按1 %的比例轉(zhuǎn)接入乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。27°C，210rpm培養(yǎng)19小時(shí)。取少量菌液進(jìn)行菌密度檢測(cè)和FGF-21產(chǎn)量分析，剩下菌液離心收集菌體。乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方組成包括胰蛋白胨0. 25-4 %，酵母提取物0. 125-2 %， NaClO. 125-2 %, Na2HP04 12. 5_200mM，KH2PO4 12. 5_200mM，(NH4)2SO4 6. 25-100mM, MgSO4 0. 5-8mM，甘油 0. 125-2%，葡萄糖 0. 0125-0. 2%，乳糖 0. 05-0. 8% 優(yōu)選的乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方如下胰蛋白胨1 %，酵母提取物 0. 5 %，NaCl 0.5%, Na2HPO4 50mM, KH2PO4 50mM, (NH4)2S0425mM, MgSO4 2mM,甘油 0. 5%,葡萄糖 0. 05%,乳糖 0.2%。第二步純化制備FGF-21融合蛋白將第一步中收集的菌體用IDA-O緩沖液重懸，超聲破碎后，離心收集上清，進(jìn)行鎳離子親和層析，收集FGF-21融合蛋白組分，用截留分子量為30KD的Millipore Amicon Ultra-15超濾管將蛋白脫鹽和濃縮。IDA-O緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5M NaCl。第三步制備FGF-21用腸激酶酶解FGF-21融合蛋白，30°C裂解10_16小時(shí)，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行鎳離子親和層析，收集含F(xiàn)GF-21的組分，用截留分子量為IOKD的Millipore Amicon Ultra-15超濾管將蛋白脫鹽和濃縮，得到FGF-21。本發(fā)明另一目的在于提供采用本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)的FGF-21在降血糖和脂代謝方面的應(yīng)用。采用本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌表達(dá)的FGF-21具有降血糖和降甘油三酯活性，在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性成分的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)方法構(gòu)建含有FGF-21的基因工程菌，用該基因工程菌生產(chǎn)的FGF-21是以可溶形式表達(dá)，從而大大提高了 FGF-21的產(chǎn)量。本發(fā)明通過(guò)乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)FGF-21，省去了監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的菌密度和添加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的步驟，使得實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)潔；其次，因避免了 IPTG對(duì)細(xì)菌的毒害作用，自誘導(dǎo)方法得到的生物量高，F(xiàn)GF-21產(chǎn)量也高。因而，用本發(fā)明提供的基因工程菌生產(chǎn)FGF-21，產(chǎn)量高，為可溶性形式，有生物學(xué)活性，純化工藝簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本較低。以下通過(guò)具體


和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1 :FGF-21在C57BL/6小鼠中的口服糖耐量(OGTT)檢測(cè)圖與對(duì)照組相比，*P< 0. 05，**P < 0. 01。圖2 :FGF-21在C57BL/6小鼠中的甘油三酯檢測(cè)圖與對(duì)照組相比，< 0. 01。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。說(shuō)明書(shū)及實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，可按常規(guī)條件進(jìn)行。實(shí)施例1構(gòu)建可溶性表達(dá)FGF-21的基因工程菌。第一步FGF-21DNA序列的擴(kuò)增委托專(zhuān)業(yè)的生物技術(shù)公司提供含有FGF-21DNA相關(guān)序列的質(zhì)粒 PD0NR223-FGF-21，根據(jù)FGF-21DNA序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR獲得FGF-21DNA序列，同時(shí)在該序列兩端引入酶切位點(diǎn)Bgl II和EcoR I。PCR產(chǎn)物用DNA Gel Extraction Kit回收，獲得 FGF-21DNA 片段。PCR反應(yīng)體系中包含2 μ 1質(zhì)粒模板，10 μ 1 Ex Taq DNA聚合酶，引物Fl和F2各 0. 5μ 1，6μ 1 無(wú)菌水。PCR 條件為:94°c,45s ；58°C，lmin，72°C，90s，經(jīng)過(guò) 30 個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸lOmin。FGF-2IDNA 序列5’ CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACA CAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGC CCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCT GTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTC TTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACAC CGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACCCCCGGAGCCACCCGG AATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCC CCAGCTACGCTTCCTGA3， (546bp)所用引物為Fl :5’ GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3>Bgl IIF2 :5’ ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3’EcoR I第二步構(gòu)建含F(xiàn)GF-21基因序列的基因工程菌用限制性內(nèi)切酶Bgl II和EcoR I分別雙酶切所述第一步獲得的FGF-21DNA片段和質(zhì)粒pET3h (+)，分別純化回收大片段，并將其連接，得到含F(xiàn)GF-21DNA片段的重組質(zhì)粒 pET32a (+) -PT71ac-TrxA-6 X Hi s-FGF-21。將重組質(zhì)粒 pET32a (+) -PT71ac-TrxA-6 X Hi s-FGF-2 1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，獲得含F(xiàn)GF-21DNA序列的基因工程菌，將該基因工程菌委托專(zhuān)業(yè)的生物技術(shù)公司測(cè)序，驗(yàn)證該基因工程菌含正確的FGF-21基因片段。第三步構(gòu)建可溶性表達(dá)FGF-21的基因工程菌
將質(zhì)粒pTfl6-ParaB-tig 和重組質(zhì)粒 pET3h(+)-Pma。-TrxA-6XHis-reF-21 分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌。實(shí)施例2制備FGF-21第一步液體培養(yǎng)將實(shí)施例1所構(gòu)建的表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 小時(shí)，培養(yǎng)條件是37°C，210rpm。再將培養(yǎng)12小時(shí)的菌液按1 %的比例轉(zhuǎn)接入乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。在27°C，2IOrpm的條件下培養(yǎng)19小時(shí)。取少量菌液進(jìn)行菌密度檢測(cè)和FGF-21產(chǎn)量分析，剩下的菌液離心收集菌體。經(jīng)分析，在分子伴侶tig的協(xié)助下，自誘導(dǎo)方法獲得的 FGF-21融合蛋白占總蛋白的百分比約為25. 6%，誘導(dǎo)后的菌密度為0D600nm = 10. 7，而不加入分子伴侶tig，采用IPTG誘導(dǎo)則得到的FGF-21融合蛋白占總蛋白百分比約為15.9%， 誘導(dǎo)后的菌密度0D600nm = 3. 9，說(shuō)明采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法生產(chǎn)FGF-21的產(chǎn)量大大提高。乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方如下胰蛋白胨1 %，酵母提取物 0. 5 %，NaCl 0.5%, Na2HPO4 50mM, KH2PO4 50mM, (NH4)2S0425mM, MgSO4 2mM,甘油 0. 5%,葡萄糖 0. 05%,乳糖 0.2%。第二步純化制備FGF-21融合蛋白將第一步中收集的菌體用IDA-O緩沖液重懸，超聲破碎后，離心收集上清。取鎳離子親和層析柱，用IDA-O緩沖液進(jìn)行柱平衡。將樣品加入鎳離子親和層析柱中，分別用5倍體積的 IDA-O, IDA-20, IDA-40，IDA-60，IDA-80，IDA-100，IDA-200，IDA-1000 溶液洗脫，分別收集穿透部分和各個(gè)組分的洗脫液，用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)洗脫情況。經(jīng)SDS-PAGE 分析含有FGF-21融合蛋白的洗脫液用截留分子量為30KD的Millipore Amicon Ultra-15 超濾管將蛋白脫鹽和濃縮。IDA-O緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5MIDA-20緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5MIDA-40緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5MIDA-60緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5MIDA-80緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5MIDA-100緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5MIDA-200緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5MIDA-1000緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 4) 20mM, 0. 5M第三步制備FGF-21用腸激酶酶解FGF-21融合蛋白，30°C裂解10_16小時(shí)，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行鎳離子
NaCl。
NaCl, 20mM 咪唑。 NaCl,40mM 咪唑。 NaCl,60mM 咪唑。 NaCl,80mM 咪唑。 NaCl，IOOmM 咪唑。 NaCl,200mM 咪唑。 NaCl，IM 咪唑。親和層析，收集含F(xiàn)GF-21的組分，用截留分子量為IOKD的Millipore Amicon Ultra_15超濾管將蛋白脫鹽和濃縮，得到FGF-21。實(shí)施例3FGF-21的降血糖作用在中科院上海生命科學(xué)研究院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買(mǎi)清潔級(jí)雄性健康C57BL/6小鼠，配置50%葡萄糖溶液，0. 9% NaCl溶液，F(xiàn)GF-21溶于0. 9% NaCl溶液。測(cè)試的血糖測(cè)試儀在上海新立醫(yī)療器械有限公司購(gòu)買(mǎi)。雄性健康C57BL/6小鼠分為2組(n = 6)。1.對(duì)照組；2. FGF-21給藥組。每天以皮下注射的方式按0. 5mg/kg/d給藥，連續(xù)給藥7天，對(duì)照組則連續(xù)7天注射0. 9% NaCl溶液。在第7天進(jìn)行小鼠口服糖耐量(OGTT)實(shí)驗(yàn)。糖耐量實(shí)驗(yàn)是在第6天晚上對(duì)小鼠禁食16小時(shí)后，于第7天早上測(cè)基礎(chǔ)血糖，然后按0. 5mg/kg皮下注射FGF-21， 對(duì)照組注射0.9% NaCl溶液。1小時(shí)后，按4g/kg對(duì)小鼠進(jìn)行口服50%葡萄糖，記此時(shí)為 0時(shí)刻，再分別于第15、30、45、60、75、90、105分鐘進(jìn)行小鼠尾靜脈取血，用血糖測(cè)試儀測(cè)定血糖濃度，以檢測(cè)FGF-21的降血糖作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示，F(xiàn)GF-21給藥組在45、60、75分鐘，均能明顯降低小鼠血糖， 與對(duì)照組相比有顯著差異(P < 0. 05)或極顯著差異(P < 0. 01)，糖耐量得到改善。說(shuō)明按本發(fā)明方法制備的FGF-21具有降低血糖的生物學(xué)活性，可在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性成分的應(yīng)用。實(shí)施例4FGF-21對(duì)脂代謝的影響在中科院上海生命科學(xué)研究院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買(mǎi)清潔級(jí)雄性健康C57BL/6小鼠，配置0. 9% NaCl溶液，F(xiàn)GF-21溶于0. 9% NaCl溶液。雄性健康C57BL/6小鼠分為2組(n = 6)。1.對(duì)照組；2. FGF-21給藥組。每天以皮下注射的方式按0. 5mg/kg/d給藥，連續(xù)給藥28天，對(duì)照組則連續(xù)28天注射0. 9% NaCl溶液。于第四天對(duì)小鼠眼球采血，血樣4°C放置30-60min后，4000r/min 離心lOmin，取血清，委托德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司測(cè)定血清中甘油三酯水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示，F(xiàn)GF-21給藥組能明顯降低小鼠甘油三酯水平，與對(duì)照組相比有極顯著差異(P < 0. 01)。說(shuō)明按本發(fā)明方法制備的FGF-21能夠影響小鼠的脂代謝， 可在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性成分的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌包括攜帶重組質(zhì)粒pET3^i(+)-Pma。-TrxA-6XHis-FGF-21的大腸桿菌DH5 α，以及同時(shí)攜帶重組質(zhì)粒ρΕΤ3 2a (+) -PT71ac-TrxA-6 X His-FGF-21 和質(zhì)粒 pTf 16-PaMB_tig 的大腸桿菌 BL21 (DE3)；其中，所述重組質(zhì)粒 pET3h(+)-Pma。-TrxA-6XHis-FGF-21 中的 Pmae 是質(zhì)粒 pET3h(+)的啟動(dòng)子， TrxA是硫氧還蛋白，6 XHis是組氨酸純化標(biāo)簽；所述質(zhì)粒pTf 16-PaMB_tig中的ParaB是質(zhì)粒 pTfl6的啟動(dòng)子。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下 第一步FGF-21 DNA序列的擴(kuò)增以含有FGF-21 DNA序列，即SEQ ID NO. 1序列的重組質(zhì)粒作為模板； 設(shè)計(jì)引物，引物為Fl :5，GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3，，艮口 SEQ ID NO. 2 序列； F2 :5，ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3，，艮口 SEQ ID NO. 3 序列； 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得FGF-21 DNA序列，同時(shí)在該序列兩端引入酶切位點(diǎn)Bgl II和EcoRI ；第二步構(gòu)建含F(xiàn)GF-21 DNA序列的基因工程菌用限制性內(nèi)切酶Bgl II和EcoR I分別雙酶切所述第一步獲得的FGF-21 DNA片段和質(zhì)粒pET3h (+)，分別純化回收大片段，并將其連接，得到含F(xiàn)GF-21 DNA片段的重組質(zhì)粒pE T32a (+) -PT71ac-TrxA-6 X Hi s-FGF-21 ；將所述重組質(zhì)粒pET3h(+)-Pma。-TrxA-6XHis-FGF-21轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，構(gòu)建含F(xiàn)GF-21 DNA序列的基因工程菌；第三步構(gòu)建可溶性表達(dá)FGF-21的基因工程菌將質(zhì)粒 pTfl6-PaMB-tig 和重組質(zhì)粒 pET3h(+)-Pmae-1TrxAIXHis-FGFjl 分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌。
3.一種用權(quán)利要求1所述的基因工程菌生產(chǎn)FGF-21的方法，其特征在于，步驟如下第一步液體培養(yǎng)將所述表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；然后，將培養(yǎng)所得菌液按比例轉(zhuǎn)接入乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；最后離心收集菌體； 第二步純化制備FGF-21融合蛋白將第一步中收集的菌體用IDA-O緩沖液重懸，超聲破碎后，離心收集上清，進(jìn)行鎳離子親和層析，收集FGF-21融合蛋白；其中，所述IDA-O緩沖液的組成包括 Tris-HCl(ρΗ7· 4)20mM,0. 5M NaCl ； 第三步制備FGF-21用腸激酶酶解以上所得的FGF-21融合蛋白，經(jīng)裂解后，再次進(jìn)行鎳離子親和層析，收集含F(xiàn)GF-21的組分，并用超濾管將其脫鹽和濃縮，得到產(chǎn)物FGF-21。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)FGF-21的方法，其特征在于，所述乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方包括胰蛋白胨0.25-4 %，酵母提取物0. 125-2%, NaCl 0. 125-2%, Na2HPO4 12. 5-200mM, KH2PO4 12. 5_200mM，(NH4)2SO4 6. 25-100mM, MgSO4 0. 5_8mM，甘油 0· 125-2%, 葡萄糖 0. 0125-0. 2%，乳糖 0. 05-0. 8% 0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌表達(dá)的FGF-21，在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物活性成分的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌，該菌包括攜帶質(zhì)粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21的大腸桿菌DH5α，以及同時(shí)攜帶質(zhì)粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21和質(zhì)粒pTf16-ParaB-tig的大腸桿菌BL21(DE3)。本發(fā)明還提供含有FGF-21序列的基因工程菌，表達(dá)可溶性FGF-21的基因工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明還提供用該菌生產(chǎn)FGF-21的方法，用表達(dá)分子伴侶tig和自誘導(dǎo)培養(yǎng)方法得到可溶性FGF-21。本發(fā)明還提供該菌生產(chǎn)的FGF-21在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明純化工藝簡(jiǎn)單，易于操作，生產(chǎn)成本低，且表達(dá)產(chǎn)物有降血糖和調(diào)節(jié)脂代謝的生物學(xué)活性。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102191207SQ20101011543
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者劉雯, 勞勛, 吳自榮, 李娟 , 肖磊, 黃靜 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)