專利名稱：一種表達icp47基因的腺病毒載體及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術基因治療領域，特別是一種表達ICP47基因的腺病毒載體及 其構建方法。
背景技術：
基因治療的基本原理在于通過目的基因的轉(zhuǎn)移，目的基因是否準確地定向?qū)税?細胞，并能有效地表達，將直接影響基因治療的安全性和治療效率。但目前，臨床基因治療 處于一種保守的階段，仍存在很多障礙，其中受者對載體及表達基因產(chǎn)物的排斥反應是最 為突出的問題，而傳統(tǒng)的免疫抑制劑幾乎都能抑制人體的免疫系統(tǒng)，增加病人催患感染和 腫瘤的危險性。因此，基因治療的研究越來越重視誘導特異性免疫耐受，而不再過分地關注 有效的免疫抑制劑。誘導特異性免疫耐受只涉及移植排斥的淋巴細胞，而不影響其它淋巴細胞的功 能，是解決排斥的最理想方法。迄今已發(fā)展出許多誘導耐受的方案，主要包括降低MHC I類 分子表達，抑制DC細胞成熟、阻斷共刺激因子通路等方法。
廣泛分布于機體組織細胞上主要組織相容性復合體(MHC)不僅與移植排斥有關，而且 廣泛參與免疫應答的誘導和調(diào)節(jié)，所以具有很重要的免疫學意義。MHC能與細胞加工處理的 抗原肽結(jié)合，特異性與TCR結(jié)合后成為使相應的T淋巴細胞活化的信號之一。MHC-類分子 則與細胞加工處理的內(nèi)源性抗原肽結(jié)合進行抗原的遞呈，引起CD8+T細胞的活化。MHC- II 類分子能與細胞加工處理的外源性抗原肽結(jié)合進行抗原的遞呈，引起CD4+T細胞的活化。過去曾一度認為MHC- I類分子僅能遞呈內(nèi)源性抗原肽，即引起⑶8+T細胞活化 ^ APCs (Antigen Presenting Cells)只是能產(chǎn)生內(nèi)源性抗原的靶細胞，然而，越來越多 的證據(jù)表明，MHC-I類分子也能夠遞呈外源性抗原誘導反應，具有吞噬功能的APC在激活 CTL的應答過程中發(fā)揮著關鍵性作用。研究發(fā)現(xiàn)許多病毒在其生活周期的不同階段可以 干擾MHC I類抗原呈遞，從而產(chǎn)生病毒逃逸，減少機體對病毒的清除。腺病毒E3-gpl9k蛋 白能與MHC-I結(jié)合，使其固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，而不是分泌到病毒感染細胞表面，大大降低病 毒入侵細胞的MHC-I表達，從而抑制了體內(nèi)特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)對病毒感染細 胞的殺傷作用，逃避機體的免疫清除，增加被感染細胞的在體內(nèi)存活時間，人為的將腺病 毒E3-gpl9k蛋白基因?qū)胍浦驳墓w細胞，可以延長供體細胞在受體中存活時間，以利 于目的基因的長期表達。而不需要免疫抑制劑。此外，艾倫·Ρ·埃舍爾等構建了可以編 碼E3-gpWk基因的質(zhì)粒，用于預防、延遲或治療包括I型糖尿病在內(nèi)的多種自身免疫性疾 病，其研究發(fā)現(xiàn)，給NOD小鼠預防接種含有E3-GP19k質(zhì)粒后，糖尿病的發(fā)病延遲，并降低糖 尿病的發(fā)病率，YinYL等研究發(fā)現(xiàn)EBV能翻譯一個它復制所需，但不能被MHCI抗原呈遞的 EBNA-I，從而有效避免針對病毒蛋白CTL的產(chǎn)生和病毒特異性效應CTL識別感染細胞。目前，臨床基因治療處于一種保守的階段，仍存在很多障礙，其中受者對載體及表 達基因產(chǎn)物的排斥反應是最為突出的問題，而傳統(tǒng)的免疫抑制劑幾乎都能抑制人體的免疫 系統(tǒng)，增加病人催患感染和腫瘤的危險性。因此，基因治療的研究越來越重視誘導特異性免疫耐受，而不再過分地關注有效的免疫抑制劑。HSV-I立即早期基因產(chǎn)物-ICP47( infected cell protein 47)，它所針對的是MHC-I抗原呈遞過程中決定抗原呈遞效率的重要蛋白之 一-TAP。ICP47通過與免疫性肽段競爭結(jié)合TAP肽結(jié)合位點，抑制病毒抗原肽被有效地轉(zhuǎn)運 到ER腔內(nèi)與新合成的MHC I分子結(jié)合，削弱了 TAP的肽轉(zhuǎn)運功能，導致不穩(wěn)定的空載MHCI 分子出現(xiàn)，在APC細胞表面MHCI的表達量顯著下降，直接干擾了 MHCI途徑對CTL的激活， 使感染的細胞逃脫了宿主的免疫清除。因此，ICP47是HSV 1逃避宿主免疫反應的重要手 段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術狀況而提供的一種表達ICP47基因的腺病 毒載體及其構建方法，本發(fā)明在腺病毒載體上連接ICP47基因片段，構建可介導免疫耐受 的腺病毒載體，期待其能降低機體對載體及表達基因產(chǎn)物的排斥反應，以利于基因的長期 表達，為基因治療、器官組織移植或細胞移植等提供一種新的探索方向。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的
一種表達ICP47基因的腺病毒載體，該載體包含編碼單純皰疹病毒1型ICP47基因的 表達區(qū)，能夠在真核細胞中表達單純皰疹病毒1型ICP47蛋白。本發(fā)明所述的重組腺病毒載體，在ICP47基因的5’端連有6XHis片段，可表達融 合基因6His-ICP47，能夠在真核細胞中表達OTis-ICP47融合蛋白，便于蛋白的純化，用于 抗體研制和生產(chǎn)。本發(fā)明的腺病毒載體的構建方法，如下
單純皰疹病毒1型ICP47基因雙酶切構建于腺病毒穿梭質(zhì)粒PAdTrack-CMV后，將 6XHis片段連接于ICP47基因的5，端，PmeI單酶切后與腺病毒包裝質(zhì)粒pAdEasy-Ι進行 同源重組，構建pAdEasy-6His-ICP47，Pac I單酶切后轉(zhuǎn)染細胞進行病毒包裝，構建重 組腺病毒載體r6His-ICP47。本發(fā)明所述的重組腺病毒載體能夠在真核細胞中表達6His_ICP47融合蛋白，降 低機體對載體及表達基因產(chǎn)物的排斥反應，以利于基因的長期表達，可用于基因治療、器官 組織移植或細胞移植等方面。


圖1為PCR擴增圖像
圖2為腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV圖譜 圖3為腺病毒包裝質(zhì)粒pAdEasy-Ι圖譜
圖4重組質(zhì)粒pTrack-ICP47 Hind III和EcoR V雙酶切鑒定圖像 圖5重組質(zhì)粒Kpn I和EcoR V雙酶切鑒定圖像 圖6 pA(Trrack-6His-ICP47的反向測序結(jié)果 圖7同源重組結(jié)果分析圖像
圖8重組質(zhì)粒pAdEasy-6His_ICP47 Pac I酶切鑒定 圖9重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染細胞 圖 10 Western-blot 圖像。
具體實施例方式實施例1擴增ICP47目的基因
NCBI網(wǎng)站查找HSV-I型ICP47的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設 計，設計的引物為
sense A 5' - GGO^TTATGTCGTGGGCCCTGGAAATG - 3' anti-sense B 5' - GGCCfi^TA7TTCAACGGGTTACCGGATTACG - 3' 上游引物和下游引物中加黑斜體序列分別為Hind III和EcoR V識別位點。引物由上海 賽百盛生物工程公司合成。臨床采集的HSV-I型DNA陽性腦脊液標本進行病毒提取DNA提取，操作依照試劑 盒說明書進行，將提取所得HSV-I DNA置于-20°C保存，以供PCR擴增。依照說明書要求，依次加入模板HSV-I DNA，上下游引物，Pfu DNA Polymerase, dNTPs,5XPCR Buffer及適量的ddH20，建立50μ 1 PCR反應體系，設置PCR儀反應程序 95°C預變性anin后，95°C 20s, 60°C 20s, 72°C 15s，進行；35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸 5min。PCR結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)標本2號和標本4號 在 6bp左右處出現(xiàn)一清晰的特異性條帶，與預期片段大小相同，見圖1。實施例2 pTrack_ICP47 的構建
腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV和包裝質(zhì)粒pAdEasy-Ι圖譜見圖2，圖3。PCR擴增產(chǎn) 物和腺病毒穿梭質(zhì)粒PAdtrack-CMV進行EcoR V和Hind III分步雙酶切反應，酶切成功后膠 回收PCR片段和pAdtrack-CMV載體片段，T4 DNA Ligase酶16°C過夜連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài) E. coli DH5 α，對生長出的菌落進行菌落PCR鑒定和酶切鑒定，篩選陽性克隆。限制性核酸內(nèi)切酶Hind III和EcoR V分別對重組質(zhì)粒pTrack_ICP47和空質(zhì)粒 pTrack-CMV進行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外線下觀察，重組質(zhì)粒pTrack-ICP47酶 切后可見約的插入片段，結(jié)果與ICP47預期片段大小相符合，而空質(zhì)粒pTrack-CMV 酶切后沒有出現(xiàn)對應的片段，見圖4。實施例3 pAdTrack-6His-ICP47 載體的構建
6XHis的正、反義鏈中分別含有限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I和Hind III的酶切粘性末端。Sense HI: 5' -CATGCATCATCATCATCATCATA-3‘ Anti-sense H2: 5， -AGCTTATGATGATGATGATGATGCATGGTAC-3，
取上海賽百盛生物工程公司合成的6XHis tag正，反義鏈進行退火反應，退火結(jié)束后， 乙醇沉淀純化，與KpnI和Hind III雙酶切后的pAdTrack-CMV-ICP47進行連接反應，轉(zhuǎn)化感 受態(tài)E. coli DH5 α，篩選重組克隆，PCR和酶切鑒定。限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I和EcoR V分別對重組質(zhì)粒pTrack-6His_ICP47和空 質(zhì)粒pTrack-CMV進行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，重組質(zhì)粒pTraCk-6His-ICP47酶切后 可見約^Obp的插入片段，結(jié)果與6His-ICP47融合基因預期片段大小相符合，而空質(zhì)粒 pTrack-CMV酶切后沒有出現(xiàn)對應的片段，見圖5。PCR和酶切鑒定陽性后測序鑒定，測序正確后命名pAdTraCk-6His-ICP47。反向測 序結(jié)果見圖6。實施例4 重組質(zhì)粒pTrack-6His_ICP47與pAdEasy-Ι在感受態(tài)BJ5183中同源重組
構建成功的重組質(zhì)粒pAdTrack-6His-ICP47載體和空載體pAdTrack_CMV分別測定 0D260,計算DNA濃度后分別進行Riie I酶切，37°C酶切池后，瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié) 果，酶切成功后進行去磷酸化反應，膠回收后進行共轉(zhuǎn)化試驗。(1)將約WgPme I單酶切線性化的穿梭質(zhì)粒及約lOOng/μΙ的病毒骨架質(zhì)粒加入 感受態(tài)BJ5183細菌中，混勻，冰浴保存30min。42°C水浴中90sec。冰浴5min。加入400 μ 1 液體LB培養(yǎng)基，混勻后置于37°C搖床緩慢振搖60min。(2) 5000rpm離心lmin，棄上清400 μ 1左右，剩余上清將菌體沉淀吹打混勻，涂于 Kana+LB培養(yǎng)板，37 °C培養(yǎng)過夜。次日挑取平板上長出的菌落，37°C搖菌，提取質(zhì)粒，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，驗 證質(zhì)粒的大小，陽性重組質(zhì)粒大小約401ib，pAdtrak-CMV質(zhì)粒對照大小約為9220bp。電泳結(jié) 果中大質(zhì)粒為可能陽性克隆，進一步酶切鑒定，見圖7。以I^cI單酶切，0. 8%瓊脂糖凝膠電 泳如顯示出一條大片段(約301Λ)，及一條小片段(約3. 0或4. 51Λ)，基本確定為陽性克隆。 結(jié)果見圖8。構建成功的腺病毒載體命名為pAd Easy-6His-ICP47和pAdEasy-Track。實施例5腺病毒載體的包裝
Pac I線性化的同源重組質(zhì)粒4 μ g采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染生長至70%匯合的細 胞，5% C02，37°C培養(yǎng)過夜，次日換液。每日觀察細胞是否出現(xiàn)細胞病變效應(cytopathic effects, CPE)和熒光表達。轉(zhuǎn)染后第5-6天，各培養(yǎng)瓶開始出現(xiàn)少量CPE細胞，之后CPE細胞數(shù)量逐漸增加， 約轉(zhuǎn)染后7天，細胞出現(xiàn)片狀脫壁漂浮，熒光表達也達到80%以上，10天左右細胞全部漂浮 且熒光表達幾乎全部陽性，見圖9。圖9a為正常細胞；b為重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞 48h ；c為重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞第4d ；d為重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞第5d ；e為重組腺 病毒轉(zhuǎn)染細胞第6d ；f為重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞第7d，g為重組腺病毒轉(zhuǎn)染 細胞第8d，h為重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞第10d。收集細胞。-80°C與37°C反復凍融3個次，4°C 12000g離心5分鐘，取上清即得到 原始病毒液，取5μ 1病毒上清進行PCR鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。鑒定正確的重組病毒命名為 r-6His-ICP47,空載病毒命名為rlrack。重組病毒擴增，經(jīng)CsCl連續(xù)梯度離心純化，滴度測定后，病毒上清分裝成500 μ 1/ 管，-80°C保存。實驗例6 Western-blot 試驗
生長至70%匯合的細胞，加入病毒上清液感染細胞，當所有細胞變圓漂浮且熒光 表達接近100%時，收集細胞，加入預冷的PBS洗滌細胞3次后，每瓶細胞加200 μ 1含PMSF 的RIPA裂解液，吹打混勻，冰上裂解30min。12000rpm離心5分鐘，離心后80 μ 1上清加入 20 μ 1還原型5 X SDS上樣緩沖液，變性5分鐘，30 μ 1樣品上樣，電泳，濃縮膠時用80-100V， 到分離膠以后用150-200V，電泳至溴酚蘭剛跑出即終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，觀察 到膜上的蛋白條帶后，將膜晾干，依次進行奶粉封閉，TBST漂洗，一抗孵育，TBST漂洗，二抗 孵育，TBST漂洗，最后進行化學發(fā)光反應，顯影、定影后，室溫下晾干，拍照。結(jié)果見圖10。實施例7 CTL殺傷試驗
生長至70%匯合的細胞，加入病毒上清液感染細胞，當所有細胞變圓漂浮且熒光表達接近100%時，收集細胞，PBS調(diào)整細胞濃度為1 X 106/ml。反復凍融5次，離心后將上 清經(jīng)0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌，分裝后_20°C保存。采集健康人肝素抗凝外周血，生理鹽水與抗凝血1:1稀釋后，以2 :1比例加入淋巴 細胞分離液面上，2000rpm離心20min，吸取白色云霧狀狹帶細胞，PBS洗滌2次后，含10% FBS的RPMI-1640重懸細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，37°C，5%C02培養(yǎng)3小時。貼壁生長者為單 核細胞，未貼壁細胞富含大量的T淋巴細胞。未貼壁細胞離心后用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，加入終濃度為 5ng/ml 的 rhIL-2，37°C，5%C02 培養(yǎng)。貼壁細胞每孔中加入含10% FCS的RPM11640培養(yǎng)液，加入終濃度為IOOng/ 111161^5 和11^-4，371，5%0)2培養(yǎng)，第3(1，貼壁細胞即為0(細胞。換液后，加入40 μ 1/孔 的抗原肽，第8d收集各組懸浮的DC，1:50的比例與T淋巴細胞混合培養(yǎng)3d。收集各組靶細胞和DC刺激后的T淋巴細胞，加入96孔板，調(diào)節(jié)效靶比為20:1，每 組設3個復孔，370C，5%C02培養(yǎng)28h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20 μ L，孵育4h，離心棄 上清，加入150 μ 1/孔DMS0，振蕩IOmin后，酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長處測定各孔光吸收 度，記錄結(jié)果。T淋巴細胞殺傷活性=靶細胞對照組OD值-(實驗組OD值一效應對照組OD值)/ 靶細胞對照組OD值X 100%
結(jié)果顯示，致敏T淋巴細胞對未轉(zhuǎn)染組的殺傷率為(33. 97士6. 19)%，明顯低于其 對r-Track轉(zhuǎn)染的殺傷率(57. 33士7. 77) %和對r_6His_ICP47轉(zhuǎn)染的殺傷率 (45. 15士6. 20) %，并且致敏T淋巴細胞對r-6His-ICP47轉(zhuǎn)染的殺傷率低于r-Track 轉(zhuǎn)染的殺傷率(P<0. 05)，表達ICP47基因的重組腺病毒載體具有降低CTL殺傷活性的 作用，有利于重組基因在體內(nèi)的長期表達，在基因治療、器官組織移植或細胞移植等方面具 有很大的應用潛力。
權利要求
1.一種表達ICP47基因的腺病毒載體，其特征在于該載體包含編碼單純皰疹病毒1 型ICP47基因的表達區(qū)，能夠在真核細胞中表達單純皰疹病毒1型ICP47蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的表達ICP47基因的腺病毒載體，其特征在于在ICP47基因 的5，端連有6XHis片段，可表達融合基因6His-ICP47。
3.根據(jù)權利要求1所述的表達ICP47基因的腺病毒載體，其特征在于該載體能夠在 真核細胞中表達6His-ICP47融合蛋白，便于蛋白的純化，用于抗體研制和生產(chǎn)。
4.一種權利要求1中所述表達ICP47基因的腺病毒載體的構建方法，其特征在于單 純皰疹病毒1型ICP47基因雙酶切構建于腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV后，將6XHis片 段連接于ICP47基因的5’端，RiieI單酶切后與腺病毒包裝質(zhì)粒pAdEasy-Ι進行同源重組， 構建重組腺病毒載體pAdEaSy-6HiS-ICP47，Pac I單酶切后轉(zhuǎn)染細胞進行病毒包裝， 構建重組腺病毒r6His-ICP47。
全文摘要
一種表達ICP47基因的腺病毒載體及其構建方法，其特征是該載體包含編碼單純皰疹病毒1型ICP47基因的表達區(qū)，能夠在真核細胞中表達單純皰疹病毒1型ICP47蛋白。此外在ICP47基因的5’端連有6×His片段，可表達融合基因6His-ICP47，能夠在真核細胞中表達6His-ICP47融合蛋白。表達ICP47基因的腺病毒載體，可降低機體對載體及表達基因產(chǎn)物的排斥反應，以利于基因的長期表達，用于基因治療、器官組織移植或細胞移植等方面。
文檔編號C12N15/861GK102061312SQ201010561369
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月27日 優(yōu)先權日2010年11月27日
發(fā)明者余祖江, 潘雪, 王鵬, 翟廣玉, 闞全程 申請人:鄭州大學