專利名稱：Vangl2突變基因及其檢測方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及VANGL2突變基因，具體涉及神經(jīng)管畸形相關(guān) VANGL2突變基因及其檢測方法，尤其是VANGL2基因三個潛在致病突變位點的檢測，本發(fā)明還提供了該檢測方法的潛在用途，即應用于神經(jīng)管畸形孕前預警基因檢測及相關(guān)基因芯片中。
背景技術(shù)：
神經(jīng)管畸形(Neural tube defects, NTDs)是由于胚胎發(fā)育早期(通常為受精后觀天)因神經(jīng)管不閉合或閉合不全所造成的一組嚴重出生缺陷。常見為開放型，即受累神經(jīng)組織暴露于體表，主要包括無腦兒和脊柱裂。前者因頭部神經(jīng)管不閉合，表現(xiàn)為嚴重腦發(fā)育不全、發(fā)育顱骨損傷，一般在出生前或出生后一段時間內(nèi)死亡，而很多脊柱裂患兒可以存活，卻造成終身殘疾和生活質(zhì)量低下，給社會、家庭和個人帶來沉重的精神壓力和經(jīng)濟負擔。神經(jīng)管畸形世界范圍內(nèi)的平均發(fā)病率為1-2%。，而我國是神經(jīng)管畸形的高發(fā)國之一，高發(fā)區(qū)山西省的發(fā)病率據(jù)1996年的統(tǒng)計結(jié)果高達9. 7%。，開展三級預防后到2004年仍然有 3. 5%。，嚴重影響我國優(yōu)生優(yōu)育和人口質(zhì)量。Kibar Z.等人2001年發(fā)現(xiàn)神經(jīng)管畸形動物模型圈尾小鼠是由于Vangl2基因的錯義突變造成的。Vangl2基因編碼了一個胞內(nèi)區(qū)含有PDZ結(jié)合位點的四次穿膜蛋白，在神經(jīng)管閉合過程中發(fā)揮重要作用。2005年Doudney K.在66名神經(jīng)管畸形患者中進行的篩查沒有在VANGLl或VANGL2基因中找到突變。2007年Kikir Z.等在新英格蘭醫(yī)學雜志上發(fā)表文章，報道了他們在神經(jīng)管畸形患者VANGLl和VANGL2突變篩查中發(fā)現(xiàn)了 3個引起VANGLl 氨基酸序列改變的突變，但研究中并未找到VANGL2上的基因突變。目前國內(nèi)外的神經(jīng)管畸形檢測/預警技術(shù)，都是在孕后，胎兒發(fā)育到一定程度(妊娠11-20周)，采用甲胎蛋白含量測定、B超或彩超觀察、胎兒鏡、X光照射等方法對神經(jīng)管畸形進行檢測，達不到孕前預警的目的，而且有些方法對胚胎發(fā)育有一定的影響。因此需要尋求能夠更加早期、安全、靈敏的檢測方法對神經(jīng)管畸形的發(fā)生進行預警。VANGL2基因突變位點的檢測將有利于進一步認識神經(jīng)管畸形的發(fā)生機理，并通過在臨床上開展孕前VANGL2 突變篩查工作對神經(jīng)管畸形的發(fā)生進行預警。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供神經(jīng)管畸形相關(guān)VANGL2突變基因及其檢測方法，尤其涉及VANGL2基因三個潛在致病突變位點的檢測。本發(fā)明通過檢測VANGL2基因突變能進行神經(jīng)管畸形孕前早期預警。本發(fā)明的進一步目的是提供上述檢測方法的用途，所述檢測方法能應用于神經(jīng)管畸形孕前預警基因檢測及相關(guān)基因芯片中。本發(fā)明通過對從我國神經(jīng)管畸形高發(fā)區(qū)山西收集到的神經(jīng)管畸形散發(fā)和家系患者中進行的VANGL2基因突變篩查發(fā)現(xiàn)了 3個引起氨基酸序列改變的VANGL2突變，經(jīng)體外實驗證實所述的突變的VANGL2部分或完全喪失了與下游DVL家族基因的結(jié)合能力。結(jié)果提示，VANGL2基因突變是潛在的神經(jīng)管畸形致病風險因素?？山⑸婕癡ANGL2基因潛在致病突變位點的檢測方法以及應用于神經(jīng)管畸形孕前預警基因檢測及相關(guān)基因芯片中，應用于神經(jīng)管畸形孕前早期預警措施。本發(fā)明中，所述的神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2的突變基因，該VANGL2突變基因含有VANGL2基因序列，并且還含有18487C — T，20598C — T或MM9T — C雜合或純合突變中的一種或一種以上。上述神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2突變基因的編碼蛋白質(zhì)具有84S — F，353R — C 或者437F — S突變位點中的一種或一種以上。本發(fā)明提供了一種檢測上述神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2突變基因的方法。具體而言，本發(fā)明提供的檢測神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2突變基因的方法，其包括從待測樣品中得到核苷酸序列與VANGL2正?；虻男蛄羞M行比較，核對突變是否為 18487C — T, 20598C — T 或 24549T — C 中的一種。所述檢測方法主要包括以下步驟1)提取待檢測樣本中的DNA ；2)以該DNA為模板，以針對VANGL2基因或者VANGL2突變基因附近的編碼區(qū)設計的PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產(chǎn)物；3)測出PCR反應產(chǎn)物的核苷酸序列組成；4)將核苷酸序列與VANGL2正常基因的序列進行比較，確定是否有18487C — T， 20598C — T 或 24549T — C 突變。所述測出PCR反應產(chǎn)物的核苷酸序列組成可以使將PCR反應產(chǎn)物在測序儀測序或進行SNaPshot分型。進一步地，通過數(shù)據(jù)庫BLAST比對功能，按照正常讀碼框架進行翻譯以確定是否存在84S — F，353R — C或者437F — S氨基酸突變位點。本發(fā)明中，待檢測樣本可為血液、唾液、體液或者毛發(fā)、皮膚組織等。另外，還可以用其他方法實現(xiàn)突變位點的檢出，包括=SNaPshot,熒光定量PCR，變性高效液相色譜 (dHPLC)技術(shù)，限制性片段長度多態(tài)性(Restriction FragmentLength Polymorphism, RFLP)，芯片檢測等。本發(fā)明的進一步目的是提供了一種用于檢測神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2突變基因的試劑盒，其主要包括以針對VANGL2基因編碼區(qū)或者上述VANGL2突變基因附近編碼區(qū)設計的PCR引物，SNaPshot延伸引物，Taq DNA聚合酶，PCR緩沖體系和延伸反應體系。本發(fā)明的進一步目的是提供所述的神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2的突變基因在應用于神經(jīng)管畸形的孕前預警基因檢測或制備基因芯片中用途。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1 VANGL2正常與突變基因測序結(jié)果。圖2 VANGL2正常與突變基因SNaPshot檢測結(jié)果。
具體實施例方式下列實例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring harbor Labortory Press，1989)，分子克隆實驗室指南(第三版，科學出版社，200 中所述的條件，或按照生產(chǎn)廠商所建議的條件。實施例1山西神經(jīng)管畸形高發(fā)地區(qū)VANGL2基因突變的檢測一、提取待檢測樣本中的DNA對象在中國神經(jīng)管畸形(NTDs)高發(fā)地區(qū)山西收集一個NTD家系患者，包括2例 NTD患者，4例流產(chǎn)胎兒，21例正常家庭成員，另有無親緣關(guān)系的508例正常對照。對NTD胎兒進行病理解剖確診，胎兒樣本的采集通過倫理委員會批準并獲得胎兒父母的同意，由胎兒父母簽署知情同意書，對所有正常家庭成員及對照參與者進行詳細體格檢查，在簽署知情同意書后每人采集血樣5ml?；蚪MDNA提取采用常規(guī)酚氯仿抽提法。具體步驟如下1)抗凝血用TE做1倍稀釋，取SOOul稀釋后的樣品于2毫升印pendorf管，加入 8ul proteinase KQOmg/ml)，1/10 體積 10% SDS，55°C溫育過夜。2)在消化液中加入等體積Tris飽和酚，然后輕柔的來回顛倒印pendorf管，混勻 10分鐘。3) 12000rpm室溫離心5分鐘。4)用200ul吸頭緩慢的將上層水相吸入對應編號的新離心管，注意勿將兩相交界處的白色物質(zhì)吸出。5)在水相中加入等體積(400ul)酚-氯仿，輕柔的上下顛倒混勻5分鐘。6) 12000rpm室溫離心5分鐘，重復步驟4。7)在水相中加入等體積氯仿-己戊醇04 1)，輕柔的上下顛倒混勻5分鐘，靜置1分鐘。8) 12000rpm室溫離心5分鐘，重復步驟4。9)水相加入1/10體積3M NaAC (冰醋酸調(diào)PH到5. 2),2.5倍體積水相的(冰凍) 無水乙醇，來回顛倒充分混勻，置_20°C，沉淀30分鐘。10) 12000rpm，4°C，離心 10 分鐘。11)棄上清，加入750ul 75%乙醇，稍做搖晃，12000rpm離心5分鐘。12)輕柔地棄上清，在吸水紙上扣干乙醇，55°C烘干殘余乙醇，根據(jù)沉淀的多少加入80-IOOuITE溶解DNA。4°C放置48小時，或50°C水浴促溶4小時。13) 1 %瓊脂糖電泳檢測，Nanodrop定量，標化到20ng/ul，_20°C保存。二、VANGL2基因編碼區(qū)PCR擴增1.引物序列VANGL2E3F1 :5，-TTCCCATGTGTTCTTCTCTGTCTC-3‘
VANGL2E3R1 :5’ -AGCAGGAAAACCAGCACCAT-3‘ VANGL2E5F 5' -TTCCTATGGCCTCTCCCAGA-3’VANGL2E5R :5’ -CAGCAACGGAAAACAAGCAC-3， VANGL2E7F :5’ -GCTCAGGGACGTCCTTCTTG-3’ VANGL2E7R :5’ -AGAAGAAGAAGGGTGGCAGGA-3‘
2.反應體系反應體系
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2的突變基因，其特征在于，其含有VANGL2基因序列，還含有18487C — T，20598C — T或MM9T — C雜合或純合突變中的一種或一種以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2的突變基因，其特征在于，所述 VANGL2突變基因的編碼蛋白質(zhì)具有84S — F，353R — C或者437F — S突變位點中的一種或一種以上。
3.—種檢測如權(quán)利要求1所述的VANGL2突變基因的方法，其特征是，從待測樣品中得到核苷酸序列與VANGL2正?；虻男蛄羞M行比較，核對突變是否為18487C —T， 20598C — T 或 MM9T — C 中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測VANGL2突變基因的方法，其特征是，所述檢測方法包括以下步驟1)提取待檢測樣本中的DNA；2)以該DNA為模板，以針對VANGL2基因或者VANGL2突變基因附近的編碼區(qū)設計的PCR 引物進行PCR反應，得到PCR反應產(chǎn)物；3)測出PCR反應產(chǎn)物的核苷酸序列組成；4)將核苷酸序列與VANGL2正常基因的序列進行比較，確定是否有18487C—T， 20598C — T 或 24549T — C 突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測VANGL2突變基因的方法，其特征是，該方法還包括步驟通過數(shù)據(jù)庫BLAST比對功能，按照正常讀碼框架進行翻譯以確定是否存在84S — F， 353R — C或者437F — S氨基酸突變位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測VANGL2突變基因的方法，其特征是，所述測出PCR反應產(chǎn)物的核苷酸序列組成可以使將PCR反應產(chǎn)物在測序儀測序或進行SNaPshot分型。
7.一種用于檢測神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2突變基因的試劑盒，其特征在于，其主要包括有以針對VANGL2基因編碼區(qū)或者權(quán)利要求1中所述VANGL2突變基因附近編碼區(qū)設計的PCR引物，SNaPshot延伸引物，Taq DNA聚合酶，PCR緩沖體系和延伸反應體系。
8.權(quán)利要求1所述神經(jīng)管畸形相關(guān)基因VANGL2的突變基因在應用于神經(jīng)管畸形的孕前預警基因檢測或基因芯片中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及神經(jīng)管畸形相關(guān)VANGL2突變基因及其檢測方法和用途，所述的VANGL2突變基因，其含有VANGL2基因序列，并且還含有18487C→T，20598C→T或24549T→C雜合或純合突變中的一種或一種以上；本發(fā)明從待測樣品中得到核苷酸序列與VANGL2正?；虻男蛄羞M行比較，核對突變是否為18487C→T，20598C→T或24549T→C中的一種或多種，以及按照正常讀碼框架進行翻譯以確定是否存在84S→F，353R→C或者437F→S氨基酸突變位點；本發(fā)明還公開了通過測序或SNaPshot檢測所述VANGL2突變基因的試劑盒。本發(fā)明所述VANGL2突變基因及檢測方法將有利于進一步認識神經(jīng)管畸形的發(fā)生機理，并通過在臨床上開展孕前VANGL2突變篩查工作對神經(jīng)管畸形的發(fā)生進行孕前預警。
文檔編號C12N15/12GK102168087SQ201010115179
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者楊雪艷, 王紅艷, 金力, 雷云平 申請人:復旦大學