專利名稱：一種抗常用蘇云金芽孢桿菌CryI單克隆抗體雜交瘤的制備方法及其單克隆抗體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以與轉(zhuǎn)基因植物中外源基因表達(dá)蛋白結(jié)合的抗體及其雜交瘤細(xì)胞系。具體而言，本發(fā)明提供了一種抗轉(zhuǎn)基因植物中常見的蘇云金芽抱桿菌CryI蛋白的單克隆抗體，可用于制備檢測轉(zhuǎn)基因植物中常見的CryI蛋白的試劑盒，屬于生物檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)簡稱Bt,屬于革蘭氏陽性土壤桿菌，廣泛分布于土壤、塵埃、水域、沙漠、植被、昆蟲尸體中。在芽孢形成過程中，蘇云金芽抱桿菌可以產(chǎn)生大量的伴胞晶體，由具有高度特異性殺蟲活性的結(jié)晶蛋白組成。這種蛋白質(zhì)通常被稱為殺蟲晶體蛋白(ICP)或δ-內(nèi)毒素。ICP通常以原毒素的形式存在，在昆蟲中腸堿性環(huán)境下，原毒素被降解成60kDa左右的片段并和受體結(jié)合。結(jié)合于受體的蛋白質(zhì)隨之插入到細(xì)胞膜上并形成穿孔，使細(xì)胞膜周質(zhì)和膜腔的離子平衡被破壞，引起細(xì)胞腫脹甚至破裂，從而導(dǎo)致昆蟲的死亡。Bt殺蟲晶體蛋白的選擇殺蟲特性是由昆蟲消化道上皮細(xì)胞表面的特異性受體決定的。由于Bt菌所產(chǎn)生的蛋白具有殺蟲能力，人們經(jīng)培養(yǎng)Bt菌生產(chǎn)出一種微生物制劑一Bt殺蟲劑。Bt殺蟲劑其殺蟲效果好，對人畜安全，對天敵無傷害，且較難產(chǎn)生抗藥性，已被廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)作物害蟲方面。隨著Bt殺蟲劑的不斷運用和發(fā)展，以Bt基因為外源基因培育新的具有自身抗蟲性的植物的基因工程技術(shù)相繼興起。隨著轉(zhuǎn)Bt基因植物的不斷發(fā)展及其商品化的種類不斷增加，轉(zhuǎn)基因生物本身的安全性以及它們對人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在威脅成為國際社會和廣大民眾廣泛關(guān)注的熱點問題之一。包括我國在內(nèi)的越來越多的國家制定并實施了轉(zhuǎn)基因食品的強(qiáng)制標(biāo)識制度。因此，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的科學(xué)管理和應(yīng)用需要得到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其成分檢測技術(shù)的支持。目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及成分檢測最常用的方法有兩類一類是針對其外源核酸成分的檢測技術(shù)；另一類是針對其外源蛋白質(zhì)成分的免疫學(xué)分析方法?；贒NA的檢測方法只能在核酸水平上反映轉(zhuǎn)基因樣品是否含有外源DNA，不能檢測其外源基因是處于沉默還是表達(dá)，該檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)Bt的抗性高低并無指導(dǎo)性意義。對于某些轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)品，DNA在加工過程中會降解掉而難以檢測，此時，需要利用酶聯(lián)免疫分析法來檢測轉(zhuǎn)基因的組分。基于外源蛋白的免疫學(xué)分析方法，采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因植物樣本快速、準(zhǔn)確、高效的檢測，其技術(shù)關(guān)鍵是制備具有高度特異性的抗體。用于轉(zhuǎn)基因的Bt ICP基因主要是CryI家族的基因，其中最常用的是CrylAb、CrylAc、CrylAh、CrylC和CrylA (由CrylAb前半段和CrylAc后半段組成的融合蛋白)。雖然帶有CrylAh和CrylC轉(zhuǎn)基因的品種目前還未在中國得到釋放，但將來有可能釋放，國外的也有可能流入。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中的Bt抗體，無論是多抗還是單抗，基本上只識別單一的Bt CryI基因，不能同時識別在轉(zhuǎn)基因植物中各種常見的Bt CryI基因，只能用于檢測單一 CryI基因的轉(zhuǎn)基因事件。如專利號申請?zhí)枮?0510130058. 9的專利中的抗體只針對CrylA中的一段16氨基酸殘基的多肽，目的是為了特異識別CrylA蛋白。我們經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)，該段多肽序列也僅出現(xiàn)在CrylAb和CrylAc中，在CrylAh及CrylC中存在序列差異，據(jù)此制備的抗體將不能識別CrylAh及CrylC。其他以完整重組CrylAb蛋白為免疫原制備出的單克隆抗體，事先并未以識別多種毒素蛋白作為設(shè)計依據(jù)，也未對其抗原表位進(jìn)行確認(rèn)，因此其識別多種毒素蛋白的能力無法確認(rèn)(張霄，紀(jì)煒，王耘，溫爽，劉賢進(jìn)，間接ELISA法檢測蘇云金芽孢桿菌(Bt) CrylAb毒蛋白抗體方法的建立，南京農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26 (4))。如果能夠制備針對轉(zhuǎn)基因植物常見Bt CryI蛋白的廣譜單克隆抗體，就可以利用一個試劑檢測多種CryI基因的轉(zhuǎn)基因事件，從而大大節(jié)約檢測成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供 一種能針對轉(zhuǎn)基因植物中常見的Bt CryI蛋白的廣譜單克隆抗體雜交瘤及其制備方法。本發(fā)明的第二個目的是提供一種特異性好的單克隆抗體的制備方法，該抗體能特異結(jié)合 Bt 重組抗原 Cry 1A、CryIAa> CrylAb、CryIAc> CryIAh> CrylC 和天然抗原。本發(fā)明的第三個目的是提供一種可以用于實驗室或田間檢測農(nóng)作物葉片中是否帶有常見Bt CryI基因的檢測試劑。解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段本發(fā)明對轉(zhuǎn)基因植物中常用的Bt ICP基因CrylAb、CrylAc、CrylAh、Crylc和CrylA的抗原表位分析后，選擇既有免疫原性又同源的13個氨基酸殘基作為合成多肽的序列。將合成的多肽與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠。經(jīng)細(xì)胞融合、重組CrylA篩選克隆，獲得高效分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞系。利用該雜交瘤細(xì)胞系用小鼠進(jìn)行腹水制備,Protein A/G柱親和層析純化腹水,獲得鼠單克隆抗體。用ELISA技術(shù)測定其亞類和親和常數(shù)。用免疫印記(WB)實驗檢測該抗體特異識別重組及轉(zhuǎn)基因水稻中的CryI蛋白的能力。具體地，本發(fā)明涉及以下幾個方面I. 一種單克隆抗體，其特征在于由保藏號為CGMCC 4856的小鼠雜交瘤細(xì)胞系70647s-9 產(chǎn)生。2.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是將具有序列表中SEQ ID No 1的氣基酸殘基序列的多妝與載體蛋白偶聯(lián)得到。3.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其為小鼠IgG2a亞型單克隆抗體。4.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其識別多種重組蘇云金芽抱桿菌CryI蛋白。5.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其用于免疫印跡，酶聯(lián)免疫檢測轉(zhuǎn)基因植物(水稻、棉花、玉米等)中的CryI蛋白。6.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于可以作為檢測試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測試劑盒的制備。7. 一種小鼠雜交瘤細(xì)胞系70647S-9，保藏號為CGMCC 4856，其特征在于能穩(wěn)定分泌權(quán)利要求I所述的單克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果
(I)本發(fā)明獲得的雜交瘤(70647S-9，保臧號為CGMCC 4856)分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，能識別重組蛋白CrylAb、CryIAc> CryIAh> CrylC和CrylA,具有檢測多種常見轉(zhuǎn)基因Bt CryI蛋白的特性，較之識別單一 Bt CryI基因的抗體具有更廣的用途。(2)本發(fā)明獲得的雜交瘤(70647S-9，保藏號為CGMCC 4856)產(chǎn)生的單克隆抗體與從轉(zhuǎn)基因水稻葉片的蛋白提取物中的CryI蛋白的結(jié)合有極強(qiáng)特異性和敏感性。(3)本發(fā)明獲得的雜交瘤(70647S-9，保藏號為CGMCC 4856)產(chǎn)生的單克隆抗體可應(yīng)用于免疫印記(Western blotting)、雙抗體夾心ELISA、間接ELISA、抗體芯片制備等轉(zhuǎn)基因植物的檢測與篩查，特異性和靈敏度高，具有很高的使用價值。


圖I :常用Bt CryI基因的序列比對 圖2 70647-S9對重組CrylAb、CrylAc和CrylA蛋白的WB檢測結(jié)果圖3 70647-S9對轉(zhuǎn)基因水稻的Western Blot檢測結(jié)果
具體實施例方式下面結(jié)合圖表和具體實施的方式對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對本發(fā)明的限制。實施例I免疫抗原的制備利用軟件分析Cry I Aa、CrylAb、Cry I Ac、Cry I Ah、CrylC 和 CrylA 蛋白序列，結(jié)合其同源性(圖I)、抗原性、親水性、表面可及性及二級結(jié)構(gòu)，選擇其中既具有免疫原性又具有序列同源性的12個氨基酸殘基(見序列表中SEQ IDNo 1)組成的多肽片段，用固相合成法合成，并用馬來酰亞胺法與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。具體步驟如下將10mg/ml 的 sulfo-GMBS (PIERCE 公司)和 10mg/ml 的 mcKLH(Thermo-Fisher 公司)以I : 5的比例混合,室溫下置于搖床上緩慢搖勻30min后，12000rpm離心5min。取上清，經(jīng)s印hadex G-25Fine (GE公司)分離收集活化好的載體蛋白質(zhì)KLH_suIfo-GMBS，以等質(zhì)量比滴加到10mg/ml的多肽溶液中，在室溫下旋轉(zhuǎn)混勻3h(或4°C旋轉(zhuǎn)過夜)即可。實施例2重組CrylA蛋白的制備—、基因克隆將編碼CrylA的基因序列(GenBank ACF32736. I)人工合成基因后，通過PCR的方法在該融合蛋白基因的5’和3’端分別加入NcoI和BamHI酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，分別對回收的融合蛋白基因和用于表達(dá)的質(zhì)粒載體PET-BPI進(jìn)行NcoI和BamHI酶切，再次電泳回收，以T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取平板上的克隆接種，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。PCR顯示融合蛋白基因陽性的克隆進(jìn)行測序分析，序列完全正確的克隆用于表達(dá)重組的CrylA蛋白。二、蛋白表達(dá)和純化按I : 100的比例將單菌落培養(yǎng)的過夜菌轉(zhuǎn)接至IOOml LB培養(yǎng)基，加入終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素，37°C振蕩培養(yǎng)至OD600為O. 6 O. 8。加入O. lmol/L的IPTG，25°C震蕩培養(yǎng)8h，收菌后超聲破碎。該重組蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，使用Ni柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的親和純化。用不同濃度的咪唑溶液進(jìn)行洗脫后，將各組分和流穿分別上樣進(jìn)行SDS-PAGE分離檢測，重組CrylA蛋白的純度在90%以上，濃度約為1-1. 5mg/mL，可以滿足抗體篩選和鑒定的要求。實施例3雜交瘤細(xì)胞系的建立一、免疫將實施例I中偶聯(lián)的多肽用弗氏完全佐劑(Sigma公司)乳化，免疫4_6周齡雌性Balb/c小鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)，腹部皮下注射每只小鼠6點，劑量為60yg/只。每14天加強(qiáng)免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐劑(Sigma公司)乳化，劑量為30 μ g/只。第3次加強(qiáng)免疫后7天以間接ELISA(波長450nm)檢測小鼠血清中抗免疫原的多抗效價，效價最高的小鼠以尾靜脈注射沖擊免疫，抗原用生理鹽水混勻，劑量為50μ g/只。二、細(xì)胞融合 無菌制備免疫達(dá)標(biāo)的小鼠脾細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0 (ATCC)以5 I比例混合，離心1500rpm，5min。棄上清后離心管放入37°C水浴中，在I分鐘內(nèi)緩慢加入Iml的PEG1500(ROche公司)，并攪動細(xì)胞。在溫水中靜置Imin后，加入IOml無血清的IMDM (Sigma公司),混勻，離心IOOOrpm, 5min。棄上清后，加入IOml血清(PAA公司)小心的將細(xì)胞吹打起來，并加入5ml混合IOxHAT (Sigma公司)的胸腺細(xì)胞，混勻。再加入25ml含有2. 1%硝基纖維素(Sigma公司)的半固體培養(yǎng)基充分混勻，然后均勻的倒入20個細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入37?！鉉 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三、挑克隆融合后7天克隆細(xì)胞團(tuán)大小密度適中，在解剖鏡下，吸取圓、實、大的克隆團(tuán)打入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，放入37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。四、ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞3天后，細(xì)胞量大約占底面積2/3，取100 μ I上清用免疫原和合成多肽分別進(jìn)行ELISA篩選。陽性克隆完全換液，加入200 μ I含飼養(yǎng)細(xì)胞和I % HT (Sigma公司)的完全培養(yǎng)基。兩天后進(jìn)行第二次ELISA篩選，陽性克隆轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基(含飼養(yǎng)細(xì)胞和HT)的24孔板培養(yǎng)。五天后取100 μ I上清進(jìn)行第三次ELISA篩選，陽性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。實施例4腹水誘生法制備單克隆抗體一、腹水制備對數(shù)生長期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起，計數(shù) 5X105，lml。懸浮的細(xì)胞腹腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開始收集腹水。取出的腹水于4°C離心4000rpm，IOmin。小心吸出中間的腹水收集于離心管中，4°C或-20°C保存。二、單克隆抗體的純化用HiTrap rProteinAFF(GE公司)親和層析法按說明書從腹水中純化抗體。SDS-PAGE膠鑒定純度，Bradford法測定濃度。純化的抗體保存于_20°C。實施例5單克隆抗體特性鑒定一、亞類鑒定用IOOmM PBS (pH7. 4)稀釋包被羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)至O. 5μ g/ml，每孔加100μ 1，4°C，過夜。傾空液體，用含O. 05% Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200 μ I封閉液(含2% BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加入O. Iml雜交瘤上清，37°C孵育lh。傾空液體用PBS-T清洗3次。用封閉液I : 1000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(K，λ )抗體或I : 2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(IgM, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA)抗體(Southern Biotech 公司)0. Iml每孔分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50μ1含
O.15% ABTS(SouthernBiotech公司)和O. 03% H2O2的檸檬酸緩沖液(ΡΗ4. O)進(jìn)行顯色反應(yīng)，10-20min內(nèi)測定405nm波長下的OD值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體為IgG2a型鼠源單克隆抗體。二、親和常數(shù)測定包被合成多肽，包被濃度為2 μ g/ml, 100 μ I/孔，4°C包被過夜，PBS-T洗3次。每孔加200 μ I封閉液37°C封閉2h，PBS-T洗3次。實施例4中純化的單克隆抗體，從I : 200開始2倍梯度稀釋，最后I孔留空白對照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗I 20000稀釋，每孔100 μ 1，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100 μ I含O. I % TMB (Sigma公司)和O. 03% H2O2的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色I(xiàn)Omin,加50 μ I O. 5Μ硫酸溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定波長450nm的吸光值。畫出OD值對應(yīng)抗體稀釋倍數(shù)的曲線，找出彡1/2 “平臺OD值”對應(yīng)的稀釋倍數(shù)A。利用下列公式計算出親和常數(shù)為3. 8X109。
親和常數(shù)《 150000xA
抗體原始濃度三、單抗反應(yīng)特異性選擇Bt重組CrylAb、CrylAc、CrylA蛋白，用免疫印跡的方法檢測本發(fā)明的單克隆抗體的識別特異性。免疫印跡實驗過程如下每種蛋白上樣約lOOng，進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore公司)。將膜置于含5%脫脂奶粉的TBS-T封閉液中4°C過夜。加入單克隆抗體70647-S9(l 1000稀釋)4°C孵育過夜。用TBS-T洗膜后，加入I 5000稀釋的羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育I小時。再次TBST洗膜，加入ECL超敏顯色液(普利萊公司)，用ImageQuant ECL儀器(GE公司)捕獲顯色圖像。圖2顯示的是單克隆抗體70647-S9對重組蛋白的免疫印記結(jié)果。該抗體可以識別CrylAb、CryIAc> CrylA蛋白，而不識別其他無關(guān)重組蛋白。實施例6本發(fā)明單克隆抗體的應(yīng)用效果從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻葉片中提取蛋白，用實施例5中所述的免疫印跡的方法檢測本發(fā)明的單克隆抗體在檢測轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用效果。圖3顯示的是單克隆抗體70647-S9對轉(zhuǎn)基因水稻的免疫印記結(jié)果。該抗體可以檢測經(jīng)100倍稀釋的轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白提取物，而對非轉(zhuǎn)基因水稻沒有檢出，檢出的特異性和靈敏度都很高。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于由保藏號為CGMCC 4856的小鼠雜交瘤細(xì)胞系70647s-9 產(chǎn)生。
2.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是將具有序列表中SEQ ID No 1的氣基酸殘基序列的多妝與載體蛋白偶聯(lián)得到。
3.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其為小鼠IgG2a亞型單克隆抗體。
4.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其識別多種重組蘇云金芽抱桿菌CryI蛋白。
5.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于其用于免疫印跡，酶聯(lián)免疫檢測轉(zhuǎn)基因植物(水稻、棉花、玉米等)中的CryI蛋白。
6.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于可以作為檢測試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測試劑盒的制備。
7.一種小鼠雜交瘤細(xì)胞系70647S-9，保藏號為CGMCC 4856，其特征在于能穩(wěn)定分泌權(quán)利要求I所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對轉(zhuǎn)基因中常見蘇云金芽抱桿菌(Bt)CryI蛋白的廣譜單克隆抗體及其制備方法，目的是提供一種新的可以檢測天然轉(zhuǎn)基因植物(水稻、棉花、玉米等)中是否存在Bt蛋白的單克隆抗體。制備該單克隆抗體的專用抗原，是根據(jù)常見Bt CryI蛋白的氨基酸序列設(shè)計的多肽與載體蛋白偶聯(lián)得到的。該單克隆抗體的亞型為IgG2a，親和常數(shù)達(dá)到3.84×109。該單克隆抗體能識別CryI家族中的多個蛋白，可用于多種BT CryI蛋白的檢測。本發(fā)明還提供了分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系70647s-9，保藏號為CGMCC No.4856。該細(xì)胞系能夠穩(wěn)定分泌高效價的該單克隆抗體。
文檔編號G01N33/577GK102816235SQ201110128699
公開日2012年12月12日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者尹長城, 劉國振, 吳 琳, 劉斯奇, 郝育杰, 鄧漢超, 韋漢福, 潘秦 申請人:北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司