芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZY菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種芽孢桿菌（AaciBw1S 5/7. ) ZY菌株，還涉及 上述的菌株在抑制冬棗輪紋病的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 冬棗口感鮮嫩多汁，風(fēng)味酸甜適口，是鮮食品種中的佼佼者，自推廣種植以來(lái)給廣 大種植戶(hù)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)利益，但是隨著栽培面積的迅速增加，冬棗病害的發(fā)生愈來(lái)愈 重，其中冬棗輪紋病是較為常見(jiàn)和危害嚴(yán)重的真菌病害，冬棗輪紋病不僅直接造成冬棗產(chǎn) 量下降與品質(zhì)降低，而且病原真菌可分泌產(chǎn)生對(duì)人畜有害的毒素與代謝物，對(duì)人們的健康 構(gòu)成極大威脅。冬棗輪紋病的防治主要是通過(guò)噴灑化學(xué)藥物來(lái)防治，但長(zhǎng)期不合理使用化 學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了諸多問(wèn)題。如：化學(xué)農(nóng)藥的高毒、高殘留對(duì)人、畜的健康造成了危害，對(duì)土壤、 水體、大氣造成了嚴(yán)重污染，破壞了生態(tài)平衡；病原菌藥性的不斷增強(qiáng)，農(nóng)藥的使用量和使 用頻度不斷加大，出現(xiàn)了用藥量與病害相互遞增的惡性循環(huán)。因此開(kāi)發(fā)對(duì)人類(lèi)和環(huán)境友好、 并具良好防治效果的、新的植物病害防治辦法迫在眉睫。
[0003] 隨著人們對(duì)食品安全的日益重視，可持續(xù)控制病蟲(chóng)害發(fā)展的需要，生物防治受到 各國(guó)政府和植物保護(hù)專(zhuān)家的重視。生物防治以生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)來(lái)控制有害生物，是綜合防治 體系中一個(gè)必不可缺少的組成部分。它避免了化學(xué)農(nóng)藥使用帶來(lái)的一系列植保、環(huán)境和能 源方面的問(wèn)題，避免了農(nóng)藥殘留對(duì)人畜的危害。應(yīng)用生物農(nóng)藥取代化學(xué)農(nóng)藥已逐漸成為一 種趨勢(shì)。
[0004] 芽孢桿菌種群龐大，繁殖能力強(qiáng)，耐熱、耐酸堿、理化性質(zhì)穩(wěn)定，抑菌譜廣泛，在 植物病害生物防治中占有重要地位，是主要的生防菌種，包括枯草芽孢桿菌 、賭狀芽抱桿菌（ifeciBws Cerew1S)、地衣芽抱桿菌（ifeciBws 、 巨大芽抱桿菌576?? 、解淀粉芽抱桿菌、 多粘芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等。國(guó)內(nèi)外對(duì)芽 孢桿菌的研發(fā)已投入生產(chǎn)實(shí)踐，做成商品制劑，取得了高效的生防效果，實(shí)驗(yàn)了作物增產(chǎn)。
[0005] 然而，隨著生防菌研宄的廣泛開(kāi)展，新菌發(fā)現(xiàn)越來(lái)越難。貝殼堤是由生活在潮間帶 的貝類(lèi)死亡之后的殼體及碎肩，經(jīng)波浪搬運(yùn)，在高潮線(xiàn)附近堆積而成的。黃河三角洲濱州市 無(wú)棣、沾化海岸近五六千年以來(lái)成陸過(guò)程中形成的貝殼堤，生態(tài)環(huán)境獨(dú)特，與美國(guó)易斯安娜 州和南美蘇里南的貝殼堤并稱(chēng)為世界三大古貝殼堤，而且是世界上規(guī)模最大、惟一的新老 并存的貝殼堤。貝殼堤獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境賦予了該地區(qū)特有的生物資源，為發(fā)掘新的生防細(xì) 菌和開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥提供了良好的資源。加快生物農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用，符合我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的 需要，對(duì)于保障人們的飲食健康具有重要意義，發(fā)展前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)冬棗輪紋病日益嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種芽孢桿菌沙.）ZY， 該菌株在冬棗輪紋病防治中的應(yīng)用中起到了良好的作用。
[0007] 本發(fā)明提供的芽孢桿菌5Τ7.)ΖΥ菌株，于2013年4月19日保藏于"中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào) 院3號(hào)。保藏編號(hào)為CGMCC No. 7490。
[0008] 上述的芽孢桿菌沙.）ZY菌株，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表所 不O
[0009] 上述的芽孢桿菌5/Λ )ZY菌株在抑制冬棗輪紋病的應(yīng)用，也是本發(fā)明所 要保護(hù)的范圍。施用后對(duì)冬棗輪紋病的生防效果可達(dá)75. 6%。具體過(guò)程為：以LB培養(yǎng)基進(jìn) 行發(fā)酵一將發(fā)酵液對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行噴灑一對(duì)防治效果進(jìn)行測(cè)定。
[0010] 芽孢桿菌（5/7. ) ZY菌株的篩選 將從貝沙堤島灘涂采集的土樣稱(chēng)取3g，在無(wú)菌條件下研碎，放入盛有無(wú)菌生理鹽水的 錐形瓶中，加入一定量的玻璃珠后，在37°C恒溫?fù)u床中進(jìn)行振蕩48h，使土壤與水充分混 勻。將土壤懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?00 μ 1不同稀釋度的土壤溶液分別在佐貝爾培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基上涂布，每個(gè)濃度溶液做一次重復(fù)，37°C培養(yǎng)24h后取出平板，觀察各平板上的菌 落數(shù)并記錄。在無(wú)菌條件下，挑取各不同單菌落在新的平板上劃線(xiàn)分純，直至平板上菌落純 化。將形態(tài)特征不同的各單菌落分別與冬棗輪紋病菌做初步拮抗實(shí)驗(yàn)，觀察各菌落抑菌效 果并做好記錄，最終獲得抑菌效果最好的sp. ZY。
[0011] 芽孢桿菌5/7. ) ZY菌株菌落特征：在LB培養(yǎng)基平板上菌落較大、圓形、 隆起、不透明；幼齡菌表面光滑，邊緣整齊、產(chǎn)黏液，培養(yǎng)48h以上菌落表面呈現(xiàn)白色褶皺。
[0012] 芽孢桿菌5/7. ) ZY菌株的細(xì)胞形態(tài)特征：革蘭氏陽(yáng)性菌，短桿狀，有芽 孢，中生或端生。
[0013] 芽孢桿菌?。㈱Y菌株的生理生化特征：生長(zhǎng)溫度4~55°C，NaCl耐受 范圍是〇~7% ;能利用麥芽糖、乳糖、山梨醇和果糖，不利用L-天冬氨酸、肌酸；接觸酶實(shí)驗(yàn)、 V-P實(shí)驗(yàn)、西蒙氏實(shí)驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，甲基紅實(shí)驗(yàn)、纖維素水解實(shí) 驗(yàn)、酯酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)為陰性。
[0014] 該菌發(fā)酵液產(chǎn)生活性物質(zhì)，發(fā)酵LB培養(yǎng)基組成為g/L :酵母浸出膏5g ;蛋白胨 IOg ;NaCl IOg ;蒸餾水 1000 mL ;pH 7. 0-7. 2。
[0015] 芽孢桿菌UaciBw1S 577. ) ZY菌株的16S rDNA基因序列特征：CGMCC No. 7490接 種于LB培養(yǎng)基，120 rpm，37°C震蕩培養(yǎng)16h，離心收集菌體，懸浮后加入溶菌酶和SDS破壁， 采用酚-氯仿法提取基因組DNA，用正相引物27F (5' -GAGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3'），和反 向引物1541R(5'-AAGGAGGTGATC CAGCC-3'），對(duì)其16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的產(chǎn) 物由北京三博公司進(jìn)行測(cè)序。PCR條件為：94°C，10min ;94°C，45s ;55°C，45s ;72°C，90s ; 30個(gè)循環(huán)；72°C 10min，4°C保存。16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1452bp，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù) 揮對(duì)Y1C, 實(shí)與 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus methylotrophicus, Bacillus 的同源性較高，其中，其同源性最高的是同源性達(dá) 99%，其16S rDNA的序列如序列表1所示。
[0016] 參照《Bergey s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VID的內(nèi)容，根據(jù)其 形態(tài)特征和生理生化特征，以及16S rDNA基因序列結(jié)果，經(jīng)多相分類(lèi)鑒定ZY為一新菌，屬 于芽抱桿菌屬（AaciBw1S 5/7. ZY )。
[0017] 5/Λ )ZY菌株可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如：普通牛肉汁、LB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中生長(zhǎng)， 也可以在佐貝爾（Zobell) 2216E培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基或添加葡萄糖或蔗糖的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明提供的5/7. )ZY菌株，是一種優(yōu)良的生 防芽孢桿菌，該菌株以及其液體發(fā)酵液均能夠產(chǎn)生對(duì)冬棗輪紋病菌有抑制作用的活性代謝 產(chǎn)物，對(duì)冬棗輪紋病的生防效果達(dá)75. 6%以上，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是芽孢桿菌（5/7. ) ZY菌落形態(tài)圖； 圖2是芽孢桿菌5/7. ) ZY對(duì)冬棗輪紋病菌生長(zhǎng)的影響圖； 圖3是芽孢桿菌5/7. ) ZY菌株發(fā)酵液對(duì)冬棗輪紋病菌生長(zhǎng)的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】來(lái)對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明，以便本領(lǐng)域的技 術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。
[0021] 實(shí)施例1 本發(fā)明提供的芽孢桿菌5/7. ) ZY菌株的分離篩選。