一種產(chǎn)生物表面活性劑的混合菌及其篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種油田采油用微生物，尤其涉及一種產(chǎn)生物表面活性劑的混合菌及 其篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 強(qiáng)化采油是一類通過改善油藏及油藏流體的物理和化學(xué)特性提高原油采收率的 開采技術(shù)。石油開采技術(shù)大致可以分為一次采油、二次采油和三次采油，其中一次采油是利 用油層中的天然能量進(jìn)行的；二次采油是利用一定工藝技術(shù)恢復(fù)油層壓力來進(jìn)行油田開發(fā) 的，常見的為注水采油；此后提高采收率的技術(shù)屬于三次采油。目前除中東地區(qū)外，世界主 要產(chǎn)油國(guó)家的主力油田都已進(jìn)入開發(fā)后期，因此大力開發(fā)各類新型三次采油技術(shù)，提高油 井采收率，對(duì)于提高原油產(chǎn)量，緩解石油危機(jī)意義重大。
[0003] 微生物可在石油勘探、采收和石油環(huán)保三方面發(fā)揮重要作用。我國(guó)在"九五"、 "十五"期間，先后對(duì)微生物采油技術(shù)立項(xiàng)攻關(guān)，中國(guó)石化與中科院合作，在勝利油田圍繞石 油微生物技術(shù)進(jìn)行了大量的室內(nèi)基礎(chǔ)研宄和礦場(chǎng)應(yīng)用研宄，勝利油田1995年就建立了石 油微生物菌種庫(kù)，已掌握了 120多種不同用途的菌種。石油微生物技術(shù)在石油工業(yè)的生產(chǎn) 過程中具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和廣闊的應(yīng)用前景，它不但能進(jìn)一步提高石油采收率，延長(zhǎng)油田 開發(fā)壽命，而且能夠有效地降解石油污染物，解決油田生產(chǎn)中的原油污染問題，沒有二次污 染。目前，世界采油工業(yè)采收率也就50%左右，美國(guó)能源部（DOE)的研宄表明，微生物可提 高采收率10% -15%，可延長(zhǎng)油藏開發(fā)5-10年。挪威Statoil公司在Norne油田使用微生 物采油技術(shù)，結(jié)果增產(chǎn)7% -10%，預(yù)計(jì)在15年內(nèi)可累計(jì)增3000萬桶原油。我國(guó)勝利油田 在四個(gè)塊區(qū)的微生物采油試驗(yàn)也已累計(jì)增油6萬余桶。
[0004] 目前，世界各主要產(chǎn)油國(guó)都把微生物采油技術(shù)確定為新一代采油技術(shù)進(jìn)行重點(diǎn)研 宄，在生物增產(chǎn)領(lǐng)域，新的生物表面活性劑制劑，可以應(yīng)用在射孔、作業(yè)洗修井、完井等工藝 中，解決植物膠殘?jiān)膫?，并有良好的降粘清潔油垢，誘導(dǎo)油流，不傷害油藏。用該技術(shù)完 井，在環(huán)境保護(hù)的有利基礎(chǔ)上，比同類油井增產(chǎn)30%以上。然而，如何篩選產(chǎn)生物表面活性 劑的混合菌，尚未取得突破性進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種可生化提取得到高效的生物表面 活性催化制劑的產(chǎn)生物表面活性劑的混合菌的篩選方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明公開了一種產(chǎn)生物表面活性劑的混合菌，其由三種菌株混合組成，該三種 菌株分別為，
[0008] (1)名稱為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri)，保藏編號(hào)為CCTCC AB205091 ；
[0009] (2)名稱為類諾卡氏菌屬（Nocardioides ginsengagri)，保藏編號(hào)為CCTCC S2013441 ；
[0010] (3)名稱為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)，保藏編號(hào)為CCTCC AB205141。
[0011] 本發(fā)明還公開了上述產(chǎn)生物表面活性劑的混合菌的篩選方法，包括下述步驟：
[0012] (1)待篩選采油菌株的挑選；
[0013] (2)將（1)中挑選好的待篩選采油菌株進(jìn)行活化及培養(yǎng)；
[0014] (3)將經(jīng)（2)中活化及培養(yǎng)好的待篩選采油菌株利用血平板法進(jìn)行初步篩選，得 到初篩發(fā)酵液；
[0015] (4)將⑶中所得初篩發(fā)酵液采用排油圈法進(jìn)行復(fù)篩，得到產(chǎn)生物表面活性劑的 混合菌。
[0016] 其進(jìn)一步的技術(shù)方案是：
[0017] 步驟（1)中待篩選采油菌株包括保藏編號(hào)為CCTCC AB 205091且名稱為施氏假 單胞菌（Pseudomonas stutzeri)、保藏編號(hào)為CCTCC S2013441且名稱為類諾卡氏菌屬 (Nocardioides ginsengagri)和保藏編號(hào)為CCTCC AB 205141和名稱為地衣芽抱桿菌 (Bacillus licheniformis)的菌株。
[0018] 步驟⑵中待篩選采油菌株的活化過程為：將待篩選采油菌株轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng) 基上，37°C下培養(yǎng)2d，其中斜面培養(yǎng)基為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾 水 lOOOmL，ρΗ7· 0,121°C蒸汽滅菌 20min。
[0019] 步驟（2)中待篩選采油菌株的培養(yǎng)過程依次包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。
[0020] 所述種子培養(yǎng)的過程為：取經(jīng)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)活化后的帶篩選菌株的種子一環(huán)， 轉(zhuǎn)接于種子液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)速為160r/min，其中種子液體培養(yǎng)基為： 葡萄5g，牛肉3g，蛋白胨10g，MgSO4 · 7H20為2g，去離子水1000mL，ρΗ7· 2,121°C蒸汽滅菌 20min〇
[0021] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的過程為：以4%的接種量將種子培養(yǎng)所得種子液接種于初始發(fā)酵 培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為160r/min，其中初始發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖20g，蛋白 胨 4g，KH2PO4為 5g，K 2冊(cè)04為 5g，MgSO 4 · 7H20 為 0· 25g，NaCl 為 2g，CaCl2S 0· 08g，去離子 水 lOOOmL，ρΗ7· 0,121°C蒸汽滅菌 20min。
[0022] 步驟（3)中血平板法的步驟為：用無菌牙簽將經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)好的待篩選菌株點(diǎn)種在 冷卻的血平板分離培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h~48h，根據(jù)血平板上溶血圈直徑來初步判斷菌 株產(chǎn)生物表面活性劑的能力，其中血平板分離培養(yǎng)基為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g， 瓊脂15g~20g，蒸餾水lOOOmL，pH7. 0~7. 2,121°C蒸汽滅菌20min，在培養(yǎng)基冷卻至45°C 左右時(shí)，加入IOOmL新鮮豬血上清液，混勻。
[0023] 步驟（4)中排油圈法的步驟為：取點(diǎn)種有待篩選菌株且直徑為15cm的血平板分離 培養(yǎng)皿，加入IOOmL水后加入ImL液體石蠟，待液體石蠟擴(kuò)散成一個(gè)圓形油膜時(shí)，在其中心 加入10 μ L經(jīng)離心、萃取后的去雜發(fā)酵液，測(cè)定排油圈的直徑并跟蹤測(cè)定5天。
[0024] 本發(fā)明還公開了上述產(chǎn)生物表面活性劑的混合菌提取制備所得的生物表面活性 劑。
[0025] 其進(jìn)一步的技術(shù)方案是：
[0026] 所述生物表面活性劑的主要成分是為鼠李糖脂。
[0027] 所述的生物表面活性劑的理化指標(biāo)為：外觀呈現(xiàn)棕茶色半透明濃縮液體且有酵素 氣味；pH值為5~7,密度為1~I. lg/cm3,完全溶于水且能夠與任何礦化度的污水配伍，但 不溶于油；沸點(diǎn)為l〇〇°C，且耐溫彡220°C。
[0028] 本發(fā)明還公開了上述生物表面活性劑在制備油田采油用生物表面活性劑中的應(yīng) 用。
[0029] 本發(fā)明還公開了上述生物表面活性劑在油田采油中的應(yīng)用。
[0030] 其進(jìn)一步的技術(shù)方案是：
[0031] 所述生物表面活性劑的應(yīng)用濃度為0. 5~3. Owt. %，最優(yōu)的應(yīng)用濃度為2. 0%。
[0032] 所述生物表面活性劑適用于不高于220°C的工作環(huán)境。
[0033] 所述生物表面活性劑應(yīng)用于稠油熱采井增產(chǎn)。
[0034] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的混合菌綜合了三種菌株 的優(yōu)點(diǎn)，能夠產(chǎn)生應(yīng)用于油田采油的生物表面活性劑，且該混合菌的篩選方法適用面廣泛， 有效降低了篩選成本，此外該篩選方法準(zhǔn)確性高、選擇性強(qiáng)、流程方便易操作，且與現(xiàn)有技 術(shù)相比周期更短。
[0035] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。
【附圖說明】
[0036] 圖1是菌株DN4-3的生長(zhǎng)曲線；
[0037] 圖2為種齡對(duì)脂肽發(fā)酵的影響；
[0038] 圖3為不加生物表面活性劑靜態(tài)洗油效果圖；
[0039] 圖4為添加2 %生物表面活性劑靜態(tài)洗油效果圖；
[0040] 圖5為不加生物表面活性劑靜態(tài)洗油后油砂圖
[0041] 圖6為添加2%生物表面活性劑靜態(tài)洗油后油砂圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于 說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0043] 一、本發(fā)明所述產(chǎn)生物表面活性劑的混合菌的篩選方法，包括以下步驟：
[0044] (1)菌株的活化：將待篩選采油菌株轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基