用于捕獲生物活性劑的細胞標靶的組合物和方法
【專利說明】用于捕獲生物活性劑的細胞標靶的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年12月12日提交的序號為61/736, 426的美國臨時專利申請； 以及于2013年9月19日提交的序號為61/883, 313的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)；這兩篇 文獻通過引入整體并入本文。
[0003] 領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明提供了用于捕獲和鑒定生物活性劑的細胞標靶的組合物和方法。特別地， 本文提供了束縛至捕獲配體、細胞標靶（內(nèi)源的或者任選用報告分子標記的）、捕獲蛋白 (任選作為捕獲融合體存在）、表面（例如，展示捕獲配體、捕獲蛋白或捕獲融合體）的生物 活性劑，以及以此來捕獲和鑒定生物活性劑的細胞標靶的方法。
[0005] 背景
[0006] 細胞基表型篩選正越來越多地用于發(fā)現(xiàn)生物活性藥物候選物。藥物候選物的標靶 在細胞環(huán)境內(nèi)天然地運行，并且它們?nèi)绾闻c生物活性分子（例如，合成分子）相互作用受到 該環(huán)境的顯著影響。為此，當試圖鑒定生物活性分子的未知標靶時，優(yōu)選在捕獲用于鑒定前 使該標靶結(jié)合至活細胞內(nèi)的生物活性分子。因此，在捕獲前使結(jié)合發(fā)生于細胞裂解物中的 方法不是優(yōu)選的。對于介導期望的生物活性的初級標靶而言以及對于可導致傾向性或干擾 的脫靶而言，情況確實如此。發(fā)現(xiàn)并驗證這樣的生物活性分子的蛋白標靶常常使用親和富 集與質(zhì)譜法的組合。這樣的方法面臨一些挑戰(zhàn)。首先，靶分子與蛋白標靶之間經(jīng)常的中度 結(jié)合至弱結(jié)合使其難以捕獲靶蛋白或靶蛋白復合物，使結(jié)果偏向高親和相互作用子。此外， 親和富集法通常使用固定有候選靶分子的固體載體。當與溶液基動力學比較時，固體表面 上的結(jié)合動力學慢得多，進一步減少了捕獲靶蛋白或靶蛋白復合物的機會。來自細胞裂解 物的蛋白與固體載體的非特異性結(jié)合導致高背景，這進一步復雜化使用質(zhì)譜（MS)鑒定細 胞標靶。這樣的方法常常導致大量的推定命中，使其必須進行二次篩選來驗證潛在的標靶。 還需要開發(fā)和優(yōu)化用于靶分子-蛋白相互作用的高通量驗證測定，使其成為資源密集型方 法。
[0007] 概述
[0008] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了組合物和系統(tǒng)（例如，細胞、反應混合物、試劑 盒、容器等），其包含以下中的一種或多種（例如，所有）：(a)生物活性劑的細胞標靶；(b) 第一捕獲蛋白和第二捕獲蛋白的融合體；（c)束縛至第一捕獲配體的所述生物活性劑，其 中所述第一捕獲配體與所述第一捕獲蛋白基于其相互作用形成共價鍵；以及（d)展示第二 捕獲配體的固體表面，其中所述第二捕獲配體與所述第二捕獲蛋白基于其相互作用形成共 價鍵。在一些實施方案中，（a)包括生物活性化合物的多種細胞標靶。在一些實施方案中， 所述細胞標革El在細胞內(nèi)表達為與報告分子的融合體。在一些實施方案中，所述報告分子是 生物發(fā)光報告分子。在一些實施方案中，所述報告分子是生物發(fā)光蛋白的部分、組分或亞 基。在一些實施方案中，所述生物發(fā)光報告分子包含與SEQ ID NO. :3具有至少70% (例 如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)序列同一性的多肽。在一些實施方案中，所述 第一捕獲蛋白和第二捕獲蛋白二者都包含與SEQ ID NO. :1的至少70% (例如，75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99% )序列同一性。在一些實施方案中，所述融合體是同二聚物。在 一些實施方案中，所述生物活性劑是小分子。在一些實施方案中，所述細胞標靶是所述生物 活性劑的結(jié)合配偶體。在一些實施方案中，所述細胞標靶包括分子組合，例如，兩個或更多 個蛋白的復合物，或者蛋白與核酸的復合物。在一些實施方案中，所述第一捕獲配體和第二 捕獲配體包含相同的分子結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述固體表面選自由以下組成的清單： 孔、管、載片、板、基質(zhì)、樹脂、微流通道、毛細管、珠、顆粒（例如，微粒、納米顆粒等）等。在 一些實施方案中，固體表面是磁性的。在一些實施方案中，固體表面是非磁性的。在一些實 施方案中，所述細胞標靶結(jié)合至所述生物活性劑，所述第一捕獲蛋白結(jié)合至所述第一捕獲 配體，并且所述第二捕獲蛋白結(jié)合至所述固體表面上的所述第二捕獲配體。
[0009] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供捕獲細胞標靶的方法，其包括以下步驟：(a)在使 所述細胞標靶結(jié)合生物活性劑的條件下，將束縛至第一捕獲配體的所述生物活性劑施用至 包含所述生物活性劑的細胞標靶的細胞；(b)裂解所述細胞以產(chǎn)生細胞裂解物；（c)在所述 第一捕獲配體與第一捕獲蛋白形成共價鍵的條件下，使所述細胞裂解物與所述第一捕獲蛋 白和第二捕獲蛋白的融合體接觸；(d)在所述第一捕獲配體與所述第一捕獲蛋白形成共價 鍵的條件下，使所述細胞裂解物與展示第二捕獲配體的固體表面接觸；以及（e)從所述細 胞裂解物分離所述固體表面。在另一些實施方案中，本發(fā)明提供捕獲細胞標靶的方法，其包 括以下步驟：(a)在使所述細胞標靶結(jié)合生物活性劑的條件下，將束縛至第一捕獲配體的 所述生物活性劑施用至包含所述生物活性劑的細胞標靶的細胞；(b)裂解所述細胞以產(chǎn)生 細胞裂解物；(c)使所述細胞裂解物與展示結(jié)合至第一捕獲蛋白和第二捕獲蛋白的融合體 的第二捕獲配體的固體表面接觸，其中所述第二捕獲蛋白與所述第二捕獲配體共價結(jié)合； 以及（d)從所述細胞裂解物分離所述固體表面。在一些實施方案中，所述細胞標靶是細胞 內(nèi)源的。在一些實施方案中，所述細胞標靶是與報告分子的融合體。
[0010] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供捕獲細胞標靶的方法，其包括以下步驟：(a)在使 所述細胞標靶結(jié)合生物活性劑的條件下，將束縛至第一捕獲配體的所述生物活性劑施用至 包含所述生物活性劑的細胞標靶的細胞；(b)在所述第一捕獲配體與第一捕獲蛋白形成共 價鍵的條件下，使所述第一捕獲配體與所述第一捕獲蛋白和第二捕獲蛋白的融合體接觸； (c)在所述第一捕獲配體與所述第一捕獲蛋白形成共價鍵的條件下，使所述捕獲融合體與 展示第二捕獲配體的固體表面接觸；以及（d)從所述細胞裂解物分離所述固體表面。在一 些實施方案中，方法包括裂解細胞以形成裂解物的步驟。在另一些實施方案中，本發(fā)明提供 捕獲細胞標靶的方法，其包括以下步驟：(a)在使所述細胞標靶結(jié)合生物活性劑的條件下， 將束縛至第一捕獲配體的所述生物活性劑施用至包含所述生物活性劑的細胞標靶的細胞； (b)使所述第一捕獲配體與展示結(jié)合至第一捕獲蛋白和第二捕獲蛋白的融合體的第二捕獲 配體的固體表面接觸，其中所述第二捕獲蛋白與所述第二捕獲配體共價結(jié)合；以及（C)從 所述細胞裂解物分離所述固體表面。在一些實施方案中，方法包括裂解細胞以形成裂解物 的步驟。在一些實施方案中，所述細胞標靶是與報告分子的融合體。在一些實施方案中，在 不進行細胞裂解的情況下，使步驟（a)和/或（b)的產(chǎn)物從細胞中排出（例如，分泌、胞吐、 活性去除）。
[0011] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供細胞的細胞裂解物、細胞組分或細胞級分，其包 含：(a)生物活性劑的細胞標靶，以及（b)束縛至第一捕獲配體的生物活性劑；所述細胞裂 解物還包含：(C)第一捕獲蛋白和第二捕獲蛋白的融合體，其中所述第一捕獲配體與所述 第一捕獲蛋白基于其相互作用而形成共價鍵，以及（d)展示第二捕獲配體的固體表面，其 中所述第二捕獲配體與所述第二捕獲蛋白基于其相互作用而形成共價鍵。在一些實施方案 中，（a)包括生物活性化合物的多種細胞標靶。在一些實施方案中，所述細胞標靶是與報告 分子的融合體。在一些實施方案中，所述報告分子是生物發(fā)光報告分子。在一些實施方案 中，所述報告分子是生物發(fā)光蛋白的部分、組分或亞基。在一些實施方案中，所述生物發(fā)光 報告分子包含與SEQ ID NO. :3具有至少70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、 99%)序列同一性的多肽。在一些實施方案中，所述第一捕獲蛋白和第二捕獲蛋白二者都 包含與 SEQ ID NO. :1 的至少 70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)序列 同一性。在一些實施方案中，所述融合體是同二聚物。在一些實施方案中，所述生物活性劑 是小分子。在一些實施方案中，所述細胞標靶是所述生物活性劑的結(jié)合配偶體。在一些實 施方案中，所述細胞標靶包括分子組合，例如，兩個或更多個蛋白的復合物，或者蛋白與核 酸的復合物。在一些實施方案中，所述第一捕獲配體和第二捕獲配體包含相同的分子結(jié)構(gòu)。 在一些實施方案中，所述固體表面選自由以下組成的清單：孔、管、載片、板、基質(zhì)、樹脂、微 流通道、毛細管、珠、顆粒（例如，微粒、納米顆粒等）等。在一些實施方案中，所述細胞標靶 結(jié)合至所述生物活性劑，所述第一捕獲蛋白結(jié)合至所述第一捕獲配體，并且所述第二捕獲 蛋白結(jié)合至所述固體表面上的所述第二捕獲配體。
[0012] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了組合物和系統(tǒng)（例如，細胞、反應混合物、試劑 盒、容器等），其包含以下中的一種或多種（例如，所有）：(a)生物活性劑的細胞標靶；(b) 束縛至捕獲配體的所述生物活性劑；以及（c)展示捕獲蛋白的固體表面，其中所述捕獲蛋 白與所述捕獲配體基于其相互作用而形成共價鍵。在一些實施方案中，（a)包括生物活性化 合物的多種細胞標靶。在一些實施方案中，所述細胞標靶是細胞內(nèi)源的。在一些實施方案 中，所述細胞標革G在細胞內(nèi)表達為與報告分子的融合體。在一些實施方案中，所述報告分子 是生物發(fā)光報告分子。在一些實施方案中，所述報告分子是生物發(fā)光蛋白的部分、組分或亞 基。在一些實施方案中，所述生物發(fā)光報告分子包含與SEQ ID NO. :3具有至少70%序列 同一性的多肽。在一些實施方案中，所述捕獲蛋白包含與SEQ ID NO. :1的至少70%序列 同一性。在一些實施方案中，本發(fā)明包括測量結(jié)合至所述固體表面或從所述固體表面釋放 的生物發(fā)光的附加步驟（e)。在一些實施方案中，所述生物活性劑是小分子。在一些實施方 案中，所述小分子是合成分子。在一些實施方案中，所述小分子是蛋白功能抑制劑，例如酶 或受體的抑制劑。在一些實施方案中，所述細胞標靶包括分子組合，例如，兩個或更多個蛋 白的復合物，或者蛋白與核酸的復合物。在一些實施方案中，所述細胞標靶是所述生物活性 劑的結(jié)合配偶體。在一些實施方案中，所述細胞標靶包括分子組合，例如，兩個或更多個蛋 白的復合物，或者蛋白與核酸的復合物。在一些實施方案中，所述細胞標靶非共價地結(jié)合至 所述生物活性劑。在一些實施方案中，所述固體表面選自由以下組成的清單：孔、管、載片、 板、基質(zhì)、樹脂、微流通道、毛細管、珠、顆粒（例如，微粒、納米顆粒等）等。在一些實施方案 中，所述細胞標靶結(jié)合至所述生物活性劑，并且所述捕獲蛋白結(jié)合至所述捕獲配體。在一些 實施方案中，所述細胞標靶非共價地結(jié)合至所述生物活性劑，并且所述捕獲蛋白共價地結(jié) 合至所述捕獲配體。在一些實施方案中，所述捕獲配體是氯代烷。在一些實施方案中，所述 捕獲配體包含連接體。在一些實施方案中，所述捕獲配體包含氨基甲酸酯連接體。在一些 實施方案中，所述捕獲配體包含可切割連接體。在某些實施方案中，所述捕獲配體包含氨基 甲酸酯連接體和可切割連接體。
[0013] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供組合物和系統(tǒng)（例如，反應混合物、試劑盒、容器 等），其包含：(a)束縛至捕獲配體的生物活性劑；以及（b)展示捕獲蛋白的固體表面，其中 所述捕獲蛋白與所述捕獲配體基于其相互作用形成共價鍵。在一些實施方案中，所述生物 活性劑非共價地結(jié)合至細胞標靶。在一些實施方案中，所述細胞標靶是細胞內(nèi)源的。在一 些實施方案中，所述細胞標靶在細胞內(nèi)表達為與報告分子的融合體。在一些實施方案中，所 述報告分子是生物發(fā)光報