. 8, 202, 700 ;美國專利No. 8, 257, 939 ;通過引用整體 并入本文），在本文中稱為"HAL0TAG脫鹵素酶"，并且捕獲配體是HAL0TAG脫鹵素酶的底物， 例如鹵代燒，在本文中稱為"HAL0TAG配體"。在一些實施方案中，捕獲蛋白包含與SEQ ID NO. :1具有至少70%序列同一性（例如，75%同一性、80%同一性、85%同一性、90%同一 性、95%同一性、98%同一性、99%同一性）的多肽。在一些實施方案中，所述捕獲配體包含 氨基甲酸酯連接體。在某些實施方案中，所述捕獲配體是具有氨基甲酸酯連接體的氯代烷 配體，例如氨基甲酸氯代烷。
[0053] 在一些實施方案中，報告分子是當(dāng)受到特定條件（例如，基于能量吸收）觸發(fā)時能 夠生成、表現(xiàn)和/或發(fā)送信號（例如，熒光、共振能等）的實體。在某些實施方案中，本文中 的組合物、方法和系統(tǒng)提供了細(xì)胞標(biāo)靶與報告分子（例如，生物發(fā)光報告分子（例如，熒光 素酶（例如，NAN0LUC)))的融合體。在一些實施方案中，通過任意合適的結(jié)構(gòu)或機(jī)制（例 如，表達(dá)為融合構(gòu)建體（例如，具有或不具有肽連接體）、化學(xué)連接（例如，直接或間接）、酶 連接、由連接體（例如，肽、核酸、另一些聚合物（酯鍵、PEG連接體、碳鏈等）連接）來使細(xì) 胞標(biāo)靶和報告分子融合、束縛、連接等。
[0054] 在一些實施方案中，所述報告分子是生物發(fā)光報告分子（例如，表達(dá)為具有細(xì)胞 標(biāo)靶的融合蛋白）。在某些實施方案中，所述生物發(fā)光報告分子是熒光素酶。在一些實施 方案中，焚光素酶選自在奧爾類臍葫（Omphalotus olearius)、螢火蟲（例如，Photinini)、 海腎（Renilla reniformis)、多管水母屬（Aequoria)中發(fā)現(xiàn)的焚光素酶、其突變體、其部 分、其變體，以及適于本發(fā)明描述的系統(tǒng)和方法的任何其他熒光素酶。在一些實施方案中， 生物發(fā)光報告分子是來自臍菇屬（Oplophorus)的經(jīng)修飾的增強(qiáng)的熒光素酶（例如，來自 Promega Corporation的NAN0LUC酶，SEQ ID NO: 3或者與其具有至少70%同一性（例如， >70%、>80%、>90%、>95%)的序列。在一些實施方案中，蛋白傳感器是耐熱的賓夕法尼 亞螢火蟲（Photuris pennsylvanica)焚光素酶。示例性的生物發(fā)光報告分子在例如美國 專利申請No. 2010/0281552和美國專利申請No. 2012/0174242中有描述，這兩者都通過引 用整體并入本文。
[0055] 在一些實施方案中，所述生物發(fā)光報告分子包含NANOLUC(參見美國專利申請 No. 2010/0281552和2012/0174242,通過引用整體并入本文）。在一些實施方案中，所述生 物發(fā)光報告分子包含具有與SEQ ID NO :3至少70%同一性（例如，>70%、>80%、>90%、 >95%)的保持生物發(fā)光性質(zhì)的多肽。在某些實施方案中，NANOLUC酶或其變體的使用提供 了使得能夠檢測捕獲細(xì)胞標(biāo)靶（例如，處于低濃度）的特征（例如，信號強(qiáng)度、亮度、高光輸 出、窄譜等）。在一些實施方案中，NANOLUC的高光輸出使得低濃度（例如，〈1 μ M、〈l〇〇nM、 〈10nm、〈lnm等）的測定組分（例如，用于表達(dá)NANOLUC的DNA)可用于在生理相關(guān)條件下 進(jìn)行測定。在一些實施方案中，NANOLUC使得能夠檢測在表型篩選中鑒定的經(jīng)捕獲的細(xì)胞 標(biāo)靶。
[0056] 在一些實施方案中，提供了用于生物發(fā)光報告分子的底物。在一些實施方案中，生 物發(fā)光報告分子將底物轉(zhuǎn)化成反應(yīng)產(chǎn)物，并釋放光能，例如冷光，作為副產(chǎn)物。在一些實施 方案中，所述底物是用于熒光素酶的底物。在一些實施方案中，所述底物是用于來自臍菇 屬的經(jīng)修飾的增強(qiáng)的焚光素酶，例如，來自Promega Corporation的NANOLUC酶（例如SEQ ID NO :3)。在一些實施方案中，所述底物包括腔腸素、腔腸素衍生物、腔腸素的結(jié)構(gòu)等同物 或功能等同物、基本與腔腸素等同（例如，結(jié)構(gòu)方面和/或功能方面）的分子，或者功能方 面或結(jié)構(gòu)方面與腔腸素相似的分子。在一些實施方案中，所述生物發(fā)光報告分子將腔腸素、 腔腸素衍生物、腔腸素的結(jié)構(gòu)等同物或功能等同物、腔腸素的基本等同物轉(zhuǎn)化成腔腸酰胺 (coelenteramide)、腔腸酰胺衍生物、腔腸酰胺的結(jié)構(gòu)等同物或功能等同物或者腔腸酰胺 的基本等同物，并釋放光能作為副產(chǎn)物。
[0057] 在一些實施方案中，基于所連接的報告分子的特征（例如，焚光、冷光、質(zhì)量（例如 通過質(zhì)譜（MS))、放射性、酶活性等）來檢測細(xì)胞標(biāo)靶。在一些實施方案中，基于細(xì)胞標(biāo)靶的 特征（例如，熒光、冷光、質(zhì)量（例如通過質(zhì)譜（MS))、放射性等）來檢測細(xì)胞標(biāo)靶。
[0058] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供了多個（例如，兩個）捕獲蛋白的融合體。在一些 實施方案中，兩個捕獲蛋白在融合（例如，二聚化）時都保持其活性。在一些實施方案中，兩 個捕獲蛋白都保持共價結(jié)合其對應(yīng)的捕獲配體的能力。在一些實施方案中，捕獲融合體是 兩個不同捕獲蛋白（例如，其結(jié)合不同捕獲配體）的異二聚物。在另一些實施方案中，捕獲 融合體是具有相同氨基酸序列的結(jié)合相同捕獲配體的兩個捕獲蛋白的同二聚物。在一些實 施方案中，兩個捕獲蛋白是共價連接的。在一些實施方案中，捕獲蛋白端對端連接（例如， N-C - N-C、N-C - C-N、C-N - N-C、C-N - C-N)。在一些實施方案中，捕獲融合體表達(dá)為兩個 融合蛋白。在一些實施方案中，表達(dá)后連接（例如，化學(xué)連接、酶連接等）兩個捕獲蛋白以 得到捕獲融合體。在一些實施方案中，通過任意合適的結(jié)構(gòu)或機(jī)制（例如，表達(dá)為融合體、 化學(xué)連接（例如，直接或間接）、酶連接、由連接體（例如，肽、核酸、聚合物、酯鍵、PEG連接 體、碳鏈等）連接）來使捕獲蛋白（例如，HAL0TAG蛋白）融合、束縛、連接等。連接的類型 不應(yīng)視為限制。在一些實施方案中，兩個捕獲蛋白直接連接。在一些實施方案中，兩個捕 獲蛋白由連接體分隔。任何合適的連接體（例如，肽（例如，具有蛋白酶切割位點(diǎn)（例如， TEV切割位點(diǎn)））、其它聚合物、烷基鏈、經(jīng)取代的烷基鏈等）可用于連接捕獲融合體的捕獲 蛋白。在一些實施方案中，捕獲蛋白中的一個或兩個包含與SEQ ID NO :170%或更大的（例 如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)序列同一性。
[0059] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了作為單體（例如，不作為捕獲融合體）的捕獲蛋 白。在一些實施方案中，捕獲蛋白連接至固體表面（例如，孔、管、載片、板、基質(zhì)、樹脂、微流 通道、毛細(xì)管、珠、顆粒（例如，微粒、納米顆粒等）等）。在一些實施方案中，多個捕獲蛋白 (例如，作為單體）連接至表面。在一些實施方案中，通過任意合適的結(jié)構(gòu)或機(jī)制（例如，表 達(dá)為融合體、化學(xué)連接（例如，直接或間接）、酶連接、由連接體（例如，肽、核酸、聚合物、酯 鍵、PEG連接體、碳鏈等）連接）來使捕獲蛋白（例如，HALOTAG蛋白）融合、束縛、連接等。 連接的類型不應(yīng)視為限制。
[0060] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于發(fā)現(xiàn)和驗證細(xì)胞中蛋白或蛋白復(fù)合物是生 物活性小分子的結(jié)合標(biāo)靶的靈敏方法。在一些實施方案中，這些方法包括選擇具有期望表 型響應(yīng)的小分子庫（例如，從表型篩選確定），以及通過任何合適的方法（例如，化學(xué)合成） 來連接捕獲配體（例如，HALOTAG配體）。然后，用小分子/捕獲配體（SM/CL)處理細(xì)胞以 重生成表型響應(yīng)。在一些實施方案中，SM/CL化合物是細(xì)胞可滲透的。在一些實施方案中， 細(xì)胞滲透性使得能夠重生成表型響應(yīng)。在一些實施方案中，氯代烷和氨基甲酸酯良好地適 于保持和/或增強(qiáng)細(xì)胞滲透性。在一些實施方案中，隨后裂解細(xì)胞，并捕獲連接至蛋白或蛋 白復(fù)合物的SM/CL。在一些實施方案中，由兩個捕獲蛋白的融合體（又稱"捕獲融合體"或 "捕獲二聚物"）來介導(dǎo)捕獲結(jié)合至蛋白復(fù)合物的SM/CL，這使得能夠快速捕獲從而最小化 蛋白相互作用子的解離，和/或降低其他蛋白的非特異性結(jié)合。在一些實施方案中，在具有 低非特異性結(jié)合性質(zhì)的固體載體上完成捕獲。在一些實施方案中，以高特異性洗脫靶蛋白 (例如，細(xì)胞標(biāo)靶）進(jìn)一步降低背景，從而使得能夠進(jìn)行更好的標(biāo)靶鑒定。
[0061] 在一些實施方案中，捕獲融合體（例如，HALOTAG二聚物）或與小分子/HALOTAG配 體綴合物結(jié)合的捕獲蛋白（例如，HALOTAG)可用于以高通量模式驗證陽性相互作用。
[0062] 在一些實施方案中，提供了用于快速捕獲結(jié)合至細(xì)胞標(biāo)靶（例如，蛋白或蛋白復(fù) 合物）的SM-CL的捕獲融合體（例如，HALOTAG二聚物）或捕獲蛋白（例如，HALOTAG)。在 一些實施方案中，將HALOTAG二聚物或捕獲蛋白（例如，HALOTAG)用于捕獲結(jié)合至生物活 性劑的細(xì)胞標(biāo)靶的生物活性劑/HALOTAG配體綴合物。提供優(yōu)于其他捕獲系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)的 HALOTAG二聚物和/或HALOTAG蛋白的特征例如，a) HALOTAG與HALOTAG配體反應(yīng)的快速動 力學(xué)（例如，即使當(dāng)配體與大蛋白或蛋白復(fù)合物復(fù)合時亦如此），以及b)使用兩種不同模 式完成的快速捕獲（圖1)。在一些實施方案中，將HALOTAG二聚物（或另一捕獲融合體） 或HALOTAG蛋白（或其他捕獲蛋白）用于制成用于共價捕獲HALOTAG配體（或其他捕獲配 體）的HALOTAG蛋白珠（或其他蛋白捕獲珠 ）。HALOTAG (或其他捕獲蛋白）采取保持功能 效率的方向。此外，結(jié)合至珠的HALOTAG二聚物是量化的，從而使得能夠精確控制珠表面的 蛋白密度。在另一些實施方案中，以相對于小分子/HALOTAG配體（或其他捕獲配體）一定 的化學(xué)計量過量將HALOTAG二聚物（或另一捕獲融合體）添加至溶液中，以利用小分子/ HALOTAG配體（或其他捕獲配體）與蛋白復(fù)合物結(jié)合的快速的溶液基動力學(xué)。在一些實施 方案中，將展示捕獲融合體、捕獲蛋白、捕獲配體和/或優(yōu)化的HAL0LINK珠的表面用于特異 性捕獲復(fù)合物。在一些實施方案中，為了下游檢測（例如，質(zhì)譜）進(jìn)行的蛋白復(fù)合物從珠的 洗脫對鑒定正確的"命中"十分重要。在一些實施方案中，捕獲（例如，HALOTAG二聚物）包 含TEV切割，其使得能夠選擇性洗脫復(fù)合物，留下任何非特異性結(jié)合的蛋白（例如，改進(jìn)的 超過背景的信號）。在一些實施方案中，通過使用用捕獲配體（例如，HALOTAG配體）活化 的多孔板，使測定轉(zhuǎn)化成高通量模式（例如，用于驗證）。
[0063] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供了展示捕獲蛋白（例如，HALOTAG、HALOTAG二聚物 等）的表面。在一些實施方案中，提供了在其表面上展示捕獲蛋白的配體（例如，HALOTAG 配體）的表面。將捕獲融合體添加至表面，并使捕獲融合體固定于表面上。然后，將捕獲融 合體固定于其表面上的表面用于捕獲（捕獲配體）_(生物活性劑）_(細(xì)胞標(biāo)靶）復(fù)合物。 在另一些實施方案中，提供展示使得能夠?qū)⒉东@蛋白固定于其表面上的官能團(tuán)的表面。可 使用用于這樣的固定的任何合適的化學(xué)物質(zhì)。將捕獲蛋白添加至表面，并使捕獲融合體固 定于表面上（例如，化學(xué)固定、酶固定、直接固定、經(jīng)連接體固定等）。然后，將捕獲蛋白固定 于其表面上的表面用于捕獲（捕獲配體）-(生物活性劑）-(細(xì)胞標(biāo)靶）復(fù)合物。
[0064] 實驗
[0065] 實施例1
[0066] 在開發(fā)本發(fā)明的實施方案期間進(jìn)行了實驗以證實該捕獲配體/捕獲融合體方法 的捕獲生物活性劑細(xì)胞標(biāo)靶的功能。
[0067] 使HEK239T細(xì)胞生長于96-孔板或6