Rsv f融合前三聚體的制作方法
【專利說明】RSV F融合前三聚體
[0001] 相關(guān)申請(qǐng) 本申請(qǐng)要求2012年11月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/728, 498以及2013年10月 11日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/890, 086的權(quán)益。上述申請(qǐng)的完整教導(dǎo)通過引用并入本文。
[0002] 序列表 本申請(qǐng)含有已經(jīng)以ASCII形式電子提交且在此以其整體通過引用并入的序列表。所述 ASCII 拷貝，在 2013 年 11 月 18 日生成，名為 PAT055275-TO-PCT_SL.txt，大小為 76, 359 字 T。
[0003] 發(fā)明背景 呼吸道合胞病毒（RSV)是副粘病毒科肺炎病毒屬 中的包膜不分節(jié)負(fù)鏈RNA病毒。其為兒童出生后第一年中兒童間細(xì)支氣管炎和肺炎的主要 原因。RSV還引起重復(fù)感染，包括嚴(yán)重下呼吸道疾病，其可在任何年齡發(fā)作，特別是在老年人 或心臟、肺或免疫系統(tǒng)受損的人中。
[0004] 為了感染宿主細(xì)胞，副粘病毒諸如RSV，像其它包膜病毒諸如流感病毒和HIV，需 要病毒膜與宿主細(xì)胞的膜融合。對(duì)于RSV，保守融合蛋白（RSV F)通過偶聯(lián)不可逆的蛋白重 折疊和膜并置來融合病毒和細(xì)胞膜。在基于副粘病毒研宄的現(xiàn)有模型中，所述RSV F蛋白 最初折疊為亞穩(wěn)態(tài)"融合前"構(gòu)型。在細(xì)胞進(jìn)入過程中，所述融合前構(gòu)型經(jīng)歷重折疊且構(gòu)型 變化為其穩(wěn)定的"融合后"構(gòu)型。
[0005] RSV F蛋白由mRNA翻譯為約574個(gè)氨基酸的蛋白，稱為Fp Ftl的翻譯后加工包括 通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的信號(hào)肽酶去除N端信號(hào)肽。反式高爾基體中的細(xì)胞蛋白酶（特別是弗林 蛋白酶（furin))還在兩個(gè)位置（約109/110和約136/137)切割F。。該切割導(dǎo)致短干擾序 列的去除并且產(chǎn)生兩個(gè)保持彼此結(jié)合的亞單位，稱為F 1^SOkDa ;C端；約殘基137-574)和 F2 (~20kDa ;N端；約殘基1-109)。F1在其N端含有疏水性融合肽和還有兩個(gè)兩親性七肽重 復(fù)區(qū)域（HRA和HRB)。HRA接近所述融合肽，HRB接近所述跨膜結(jié)構(gòu)域。三個(gè)F 1-F2異源二 聚體在病毒顆粒中組裝為F1-F2同源三聚體。
[0006] 現(xiàn)在還未獲得但期望針對(duì)RSV感染的疫苗。生產(chǎn)疫苗的一種可能方法是基于純化 的RSV F蛋白的亞單位疫苗。然而，對(duì)于該方法，期望純化的RSV F蛋白是隨時(shí)間穩(wěn)定的單 一形式和構(gòu)型，在疫苗批次之間一致且方便純化。
[0007] RSV F蛋白可被截短，例如通過缺失跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾，以允許其表達(dá)為可以可 溶的胞外域。此外，盡管RSV F蛋白最初翻譯為單體，但該單體被切割且組裝為三聚體。當(dāng) RSV F蛋白為切割的三聚體形式時(shí)，暴露所述疏水性融合肽。不同三聚體例如可溶性胞外域 三聚體上的所述暴露的疏水性融合肽可彼此結(jié)合，導(dǎo)致形成玫瑰花結(jié)型。所述疏水性融合 肽也可與例如來自用于表達(dá)重組可溶RSV F蛋白的細(xì)胞的脂質(zhì)和脂蛋白結(jié)合。由于RSV F 蛋白加工、結(jié)構(gòu)和重折疊的復(fù)雜性，難以獲得純化的、均質(zhì)的免疫原性制備物。
[0008] RSV F的融合前形式含有在融合后形式上不存在的表位。參見，例如，Magro，M.等 k，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109 (8) : 3089-94 (2012))。因此，對(duì)于疫苗，穩(wěn)定的 融合前形式通常被認(rèn)為是抗原性上更期望的。已經(jīng)使用GCN-穩(wěn)定化的一般方案產(chǎn)生了幾 種RSV F構(gòu)建體。然而，在每種情況下，無論HRB是否用GCN、工程改造的二硫鍵或設(shè)計(jì)以加 強(qiáng)三聚體HRB疏水核心相互作用的點(diǎn)突變穩(wěn)定化，結(jié)果是無法從細(xì)胞有效表達(dá)和輸出的蛋 白。制備具有對(duì)其弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的突變以防止融合肽釋放的融合后RSV F的嘗試導(dǎo) 致RSV F無法形成與在充分研宄的副流感病毒F中觀察到的三聚體類似的三聚體。
[0009] 因此，需要改善的RSV F蛋白組合物和用于制備RSV F蛋白組合物的方法。
[0010] 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及呼吸道合胞病毒F (RSV F)復(fù)合物，其包含三個(gè)RSV F胞外域多肽（每個(gè)包 含內(nèi)源HRA區(qū)域），和至少一個(gè)寡聚化多肽，其中三個(gè)胞外域多肽和至少一個(gè)寡聚化多肽形 成六螺旋束，條件是RSV F多肽的內(nèi)源HRA區(qū)域不是六螺旋束的部分。任選地，每個(gè)RSV F 胞外域多肽可以包含HRB區(qū)域，且每個(gè)寡聚化多肽可以包含寡聚化區(qū)域。六螺旋束可以包 含每個(gè)RSV F胞外域的HRB區(qū)域和每個(gè)寡聚化肽的寡聚化區(qū)域。寡聚化區(qū)域可以包含RSV F HRA氨基酸序列。任選地，所述復(fù)合物可以由三個(gè)RSV F胞外域多肽和三個(gè)寡聚化多肽 組成。所述寡聚化多肽中的一個(gè)或多個(gè)可以進(jìn)一步包含可操作連接至寡聚化區(qū)域的功能性 區(qū)域。所述功能性區(qū)域可以獨(dú)立地選自免疫原性載體蛋白、抗原、顆粒形成多肽、脂質(zhì)和可 以使寡聚化多肽與脂質(zhì)體或微粒結(jié)合的多肽。所述功能性區(qū)域可以是抗原。所述抗原可 以是RSV G。任選地，所述RSV F胞外域多肽中的一個(gè)或多個(gè)是未切割的RSV F胞外域多 肽。任選地，所述RSV F胞外域多肽中的一個(gè)或多個(gè)是切割的RSV F胞外域多肽。任選地， 所述RSV F胞外域多肽中每個(gè)含有一個(gè)或多個(gè)改變的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。任選地，所述 RSV F胞外域多肽中的一個(gè)或多個(gè)可以包含WO 2011/008974(其整體通過引用并入本文） 中先前描述的氨基酸序列或突變。所述RSV F胞外域多肽的氨基酸序列可以包含選自以下 的序列：SEQ ID N0:8 (Del21 Furx)、SEQ ID N0:3 (Furmt)、SEQ ID N0:4 (Furdel)、SEQ ID N0:5 (Furx)、SEQ ID N0:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID N0:7 (Furx R113Q、 K123Q、K124Q)、SEQ ID N0:9 (Delp23Furx)、SEQ ID N0:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID N0:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID N0:12 (N 端弗林蛋白酶）、SEQ ID N0:13 (C 端弗林蛋白酶）、 SEQ ID NO: 14 (因子Xa)、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 26 (融合肽缺失I)和其中省略信 號(hào)肽和/或HIS標(biāo)簽的任何上述物質(zhì)。所述RSV F胞外域多肽中的至少一個(gè)可以是包含C 端6螺旋束形成部分的重組多肽。C端六螺旋束形成部分可以包含包膜病毒的融合蛋白的 七肽重復(fù)區(qū)域。所述七肽重復(fù)區(qū)域可以是來自包膜病毒的I型融合蛋白的HRA或HRB。例 如，所述七肽重復(fù)區(qū)域可以選自RSV F HRA、RSV F HRB和HIV gp41 HRA。任選地，所述六 螺旋束包含三個(gè)重組RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束形成部分和每個(gè)寡聚化肽的寡聚化 區(qū)域。所述RSV F胞外域多肽可以呈融合前構(gòu)型。所述RSV F復(fù)合物的特征可在于當(dāng)在負(fù) 染電子顯微圖中觀察時(shí)的圓形。所述RSV F復(fù)合物可以包含RSV F的融合后形式上不存在 的融合前表位。
[0011] 本發(fā)明還涉及呼吸道合胞病毒F(RSV F)復(fù)合物，其包含三個(gè)RSV F胞外域多肽 (每個(gè)含有內(nèi)源HRA區(qū)域和內(nèi)源HRB區(qū)域），所述RSV F胞外域多肽中的至少一個(gè)進(jìn)一步包 含C端6螺旋束形成部分，其中所述復(fù)合物的特征在于由C端6螺旋束形成部分和內(nèi)源HRB 區(qū)域形成的六螺旋束。
[0012] 本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生呼吸道合胞病毒F(RSV F)復(fù)合物的方法，所述方法包括： a)提供RSV F蛋白胞外域多肽和至少一個(gè)寡聚化多肽，和b)在適合于形成RSV F復(fù)合物 的條件下組合RSV F胞外域多肽和至少一個(gè)寡聚化多肽，由此產(chǎn)生RSV F復(fù)合物，其中所述 RSV F胞外域多肽中的三個(gè)和所述寡聚化多肽中的至少一個(gè)形成六螺旋束，條件是所述RSV F胞外域多肽的內(nèi)源HRA區(qū)域不是六螺旋束的部分。（a)中提供的RSV F胞外域多肽可以 是未切割的RSV F胞外域多肽。（a)中提供的RSV F胞外域多肽可以含有一個(gè)或多個(gè)改變 的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。（a)中提供的RSV F胞外域多肽可以是純化的單體。任選地，所 述方法可以進(jìn)一步包括（c)用蛋白酶切割產(chǎn)生的復(fù)合物中的RSV F蛋白胞外域多肽。（a) 中提供的RSV F蛋白胞外域多肽可以在昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽類細(xì)胞、酵母細(xì)胞、四膜 蟲細(xì)胞或其組合中表達(dá)。每個(gè)RSV F胞外域多肽可以包含HRB區(qū)域，且每個(gè)寡聚化多肽可 以包含寡聚化區(qū)域。每個(gè)RSV F胞外域多肽可以包含HRB區(qū)域，且每個(gè)外源寡聚化多肽可 以包含寡聚化區(qū)域。所述六螺旋束可以包含每個(gè)RSV F胞外域多肽的HRB區(qū)域和每個(gè)寡 聚化肽的寡聚化區(qū)域。每個(gè)寡聚化區(qū)域可以包含RSV F HRA氨基