青海弧菌q67b及其分離篩選和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及青?；【鶴67B及其分離篩選和應(yīng)用，屬微生物學(xué)的發(fā)光細(xì)菌分離篩 選和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。青?；【鶴67B是淡水發(fā)光菌。從青海省青海湖所產(chǎn)的青海避魚(yú)體 表采集淡水發(fā)光菌，經(jīng)分離、純化、篩選后，得到一種新的淡水發(fā)光菌種菌株，leSrDNA序列 分析表明，該菌屬弧菌屬，定名為"青海弧菌Q67B(Vibrioqin曲aiensisQ67B)"。2010年 1月28日將其送交武漢市中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNO: M2010104,保藏中屯、地址為：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，郵編：430072。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)光菌是一大類能自身發(fā)出巧光的細(xì)菌，在條件合適時(shí)，其發(fā)光恒定。若發(fā)光菌接 觸到有毒有害物質(zhì)時(shí)，其發(fā)光就會(huì)受抑制，抑制程度與所接觸的毒物的毒性大小和毒物的 濃度有關(guān)。因此發(fā)光菌可用于檢測(cè)樣品的生物學(xué)毒性。上世紀(jì)八十年代，發(fā)光菌就己被用 于環(huán)境污染的檢測(cè)。我國(guó)也于1995年發(fā)布了將發(fā)光菌用于水環(huán)境污染的毒性檢測(cè)的國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)。但不管國(guó)際還是國(guó)內(nèi)，均使用來(lái)源于海洋的海洋發(fā)光菌，該發(fā)光菌適應(yīng)海洋的高鹽度 (相當(dāng)于化C1的質(zhì)量百分濃度為3% )和高滲透壓的環(huán)境條件，否則無(wú)法生長(zhǎng)，更不會(huì)發(fā) 光。當(dāng)用于陸地淡水樣品時(shí)，必須在淡水樣品中添加化C1，直至淡水樣品中化C1的最終質(zhì) 量百分濃度為3 %，否則淡水樣品中的海洋發(fā)光菌很快就喪失發(fā)光能力，甚至細(xì)菌的細(xì)胞因 低滲透壓而吸水破裂，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)。上世紀(jì)九十年代，隨著發(fā)光菌應(yīng)用于環(huán)境污染的 毒性檢測(cè)日益增多，許多研究者發(fā)現(xiàn)，對(duì)有些種類的淡水樣品，其檢測(cè)結(jié)果往往與其它生物 檢測(cè)結(jié)果不太吻合，尤其是那些含有重金屬鹽的樣品。究其原因，乃對(duì)淡水樣品添加化C1 所致。所W有研究者改用葡萄糖取代化C1來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓，使之與質(zhì)量百分濃度為3%的 化C1溶液等滲，但效果并不理想，檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性較差。運(yùn)是因?yàn)楹Ｑ蟀l(fā)光菌必需要有一 定濃度的化離子存在時(shí)才能保持良好而穩(wěn)定的發(fā)光性能，缺乏化離子的環(huán)境對(duì)海洋發(fā)光 菌的發(fā)光是不利的，必然影響到海洋發(fā)光菌發(fā)光的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的嚴(yán)重偏差。 如果使用不需要化離子并適應(yīng)較低的滲透壓就能正常發(fā)光的淡水發(fā)光菌作為檢測(cè)用發(fā)光 細(xì)菌，對(duì)淡水樣品就不必添加化C1，避免了應(yīng)用海洋發(fā)光菌作為檢測(cè)用發(fā)光細(xì)菌的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個(gè)目的是公開(kāi)一種青?；【鶴67B，其特征在于，
[0004] (1)形態(tài)特征：該菌的菌體呈桿狀微彎，大小介于0. 5~0. 7微米X1. 5~2微米， 革蘭氏染色陰性，用利夫生鞭毛染色，觀察到單極生鞭毛似峨料狀，細(xì)胞內(nèi)累積聚β-徑基 下酸；
[0005] (2)生理生化特征：該菌適于生長(zhǎng)的溫度范圍和抑范圍分別為4°C~40°C和 P冊(cè)~抑10,對(duì)弧菌抑制劑2,4-二氨基-6, 7-二異丙基噪晚敏感，具有耐鹽、耐高滲透壓和 低滲透壓的能力，能在介于質(zhì)量百分濃度0%~8%之間的化C1溶液中生長(zhǎng)和發(fā)光；
[0006] (3)基因特征：16SrDNA序列：
[0008] 所述的青?；【鶴67B的進(jìn)一步特征在于，該菌最適于生長(zhǎng)的溫度和抑值分別為 25°C和抑 9.0。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是推出一種分離篩選青?；【鶴67B的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目 的，本發(fā)明采用W下的技術(shù)方案，其特征在于，該菌經(jīng)過(guò)四個(gè)步驟，篩選得到：第一步獲取淡 水發(fā)光菌，從青海省青海湖所產(chǎn)的青海避魚(yú)體表采集到的發(fā)光菌，經(jīng)分離純化，獲得淡水發(fā) 光菌；第二步溫度適應(yīng)性篩選，在兩個(gè)不同的溫度下對(duì)第一步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行溫度 適應(yīng)性篩選；第Ξ步pH值適應(yīng)性篩選，在兩個(gè)不同的pH值下對(duì)第二步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn) 行抑值適應(yīng)性篩選；第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選，用重金屬鹽和有機(jī)毒物對(duì)第Ξ步獲得的 淡水發(fā)光菌先后進(jìn)行兩次毒物反應(yīng)靈敏性篩選。
[0010] 所述的分離篩選青海弧菌Q67B的方法的進(jìn)一步特征在于，所述的兩個(gè)不同的溫 度是4°C和40°C。
[0011] 所述的分離篩選青?；【鶴67B的方法的進(jìn)一步特征在于，所述的兩個(gè)不同的抑 值是抑5.0和抑11.0。
[0012] 所述的分離篩選青?；【鶴67B的方法的進(jìn)一步特征在于，所述的重金屬鹽和有 機(jī)毒物分別是化C12和苯酪。
[0013] 青海弧菌Q67B具有寬的生長(zhǎng)和發(fā)光的溫度范圍：4°C~40°C;具有寬的生長(zhǎng)和發(fā) 光的抑值范圍：P冊(cè).0~抑11. 0 ;具有耐鹽、耐高滲透壓和低滲透壓的能力，能在介于質(zhì)量 百分濃度0%~8%之間的化C1溶液中生長(zhǎng)和發(fā)光；對(duì)毒物的毒性反應(yīng)靈敏，特別適合用于 陸地淡水樣品或固體樣品的水相抽提物的生物毒性快速檢測(cè)和淡水樣品的生物毒性快速 篩選。
[0014] 現(xiàn)結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。一種分離篩選青?；【鶴67B的方法，其 特征在于，具體操作步驟：
[0015] 第一步獲取淡水發(fā)光菌
[0016] (1)取新鮮的青海省青海湖所產(chǎn)的青海避魚(yú)，截成小段，室溫下放置10小時(shí)~24 小時(shí)，在暗室內(nèi)檢視，在發(fā)綠色巧光的亮點(diǎn)處，用滅菌的接種針括取，劃線于培養(yǎng)皿內(nèi)，
[0017] (2)將第一步（1)所述的培養(yǎng)皿置于暗室中，20°C培養(yǎng)10小時(shí)~18小時(shí)，從中挑 取發(fā)光良好的單菌落，
[0018] (3)對(duì)第一步（2)所述的單菌落進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)Ξ~五次，取得單細(xì)胞純培養(yǎng) 物，轉(zhuǎn)接于斜面試管，培養(yǎng)生長(zhǎng)后得斜面菌種，即淡水發(fā)光菌，保存于4°C冰箱備用，
[0019] (4)所述的培養(yǎng)皿和斜面試管內(nèi)需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基的配方為，Μ拆〇4 2. 47g，MgC〇3 0. 79g，Μ濁。0. 〇9g，MgClz0. 109g，CaC〇3 0. 103g，KC1 0. 122g，化C1 8. 29邑， Mg化C〇3)20. 50g，酵母膏5g，膜腺5g，甘油3g，瓊脂20g，溶于1000血蒸饋水中，pH9. 0， 12rC滅菌20分鐘，膽于4°C的冰箱備用；
[0020] 第二步溫度適應(yīng)性篩選
[0021] (1)將第一步（3)所得的斜面菌種，轉(zhuǎn)接于五~十支斜面試管，
[002引似將第二步（1)所述的斜面試管置于暗室中，20°C培養(yǎng)16小時(shí)~18小時(shí)，檢查 發(fā)光狀況，選出發(fā)光良好的菌支，
[0023] (3)將第二步（2)選出的菌支分別轉(zhuǎn)接于五~十支斜面試管，
[0024] (4)將第二步做所述的試管置于暗室中，20°C培養(yǎng)16小時(shí)~18小時(shí)，檢查發(fā)光 狀況，選出發(fā)光良好的菌支，
[00巧](5)將第二步（4)選出的菌支分別劃線轉(zhuǎn)接于十個(gè)平皿，平分成兩組，為第I組和 第II組，分別于4°C和40°C培養(yǎng)16小時(shí)~18小時(shí)，
[0026] (6)另取十個(gè)平皿，平分成兩組，為第III組和第IV組，每組五個(gè)平皿，暗室中挑取第 I組的每一個(gè)平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第III組的五個(gè)平皿，暗室中挑 取第II組的每一個(gè)平皿中發(fā)光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第IV組的五個(gè)平皿，將第 III組和第IV組分別于40°C和4°C培養(yǎng)16小時(shí)~18小時(shí)，
[0027] (7)另取十支斜面試管，分別對(duì)應(yīng)上述第III組和第IV組的每個(gè)平皿，將各平皿中發(fā) 光良好的一個(gè)單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于十支對(duì)應(yīng)斜面試管中，20°C培養(yǎng)16小時(shí)~18小時(shí)，
[0028] (8)另取五支斜面試管，選取第二步（7)所述的十支斜面試管中發(fā)光良好的五個(gè) 斜面，分別轉(zhuǎn)接到五支斜面試管中，得到五支斜面菌種，保存于4°C冰箱內(nèi)備用，
[0029] (9)所述的斜面試管和平皿內(nèi)需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基與上述的第一步需 用的固體培養(yǎng)基完全相同，
[0030] (10)經(jīng)第二步溫度適應(yīng)性篩選操作后所得的菌種，具有耐低溫4°C和耐高溫40°C 的性能；
[0031] 第Ξ步抑值適應(yīng)性篩選
[0032] (1)取第二步的做所得的斜面菌種，分別轉(zhuǎn)接于抑5. 0和抑11. 0的液體培養(yǎng)基 中，各為五瓶，20°C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)~18小時(shí)，
[0033] (2)在經(jīng)第Ξ步（1)操作后的抑5. 0和抑11. 0液體培養(yǎng)物中，各選取其中發(fā)光良 好的培養(yǎng)物，進(jìn)行交換轉(zhuǎn)接，即將抑5. 0液體培養(yǎng)基中選中的菌