原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01080042308. 2,申請日為2010年9月24日，發(fā)明名稱為"原 生藻菌的轉(zhuǎn)化方法"的中國專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明設及原生藻菌（stramenopile)的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明還設及通過導入脂肪 酸不飽和化酶基因，不飽和脂肪酸含量增加的原生藻菌，從運些不飽和脂肪酸含量增加的 原生藻菌生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法等。
【背景技術】
[0003] 多不飽和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid,PUFA)是動物和人類營養(yǎng)中重 要的成分。由于如二十碳五締酸巧PA)或二十二碳六締酸值HA)運樣的ω3多不飽和脂肪 酸（也稱作η-3多不飽和脂肪酸）在兒童腦的發(fā)育、眼的機能、激素和其它信號物質(zhì)的合成 W及包括屯、血管障礙、癌癥和糖尿病的預防的健康狀況中實現(xiàn)各種作用（非專利文獻1)， 因此它們是人類營養(yǎng)中的重要成分。由于運樣的原因，多不飽和脂肪酸的制造已成為必要。
[0004] 一方面，已知分類于網(wǎng)粘菌化油yrinthula)綱的微生物制造多不飽和脂肪 酸。已經(jīng)報道屬于破囊壺菌（T虹austochytriales)科的微生物中，利用裂殖壺菌 (Schizochytrium)屬的微生物的含有多不飽和脂肪酸的憐脂的制備方法（專利文獻1)， 具有二十二碳六締酸生產(chǎn)能力的破囊壺菌燈虹austochytrium)屬的微生物（專利文獻2) 等。由于運些不飽和脂肪酸使得食物和/或飼料的強化成為可能，因此運些不飽和脂肪酸 的，特別是在真核生物中的，簡便經(jīng)濟的制造方法是非常必要的。 陽0化]在網(wǎng)粘菌類中，作為外源基因的導入方法，已經(jīng)報道了對于裂殖壺菌屬的特定菌 株（按照現(xiàn)在的分類體系（非專利文獻2)屬于Auranthiochytrium屬（非專利文獻3)) 的方法（專利文獻3、4)。而且，作為通過轉(zhuǎn)化使得脂肪酸組成變化的方法，雖然已知有破壞 聚酬合成酶（PK巧系基因，其結(jié)果是脂肪酸組成變化的例子（非專利文獻4)，但是，至今未 知操作構(gòu)成延長酶/去飽和酶通路的酶使得脂肪酸組成變化的報道。
[0006] 現(xiàn)有技術文獻
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻1 :日本特開2007-143479號公報
[0009] 專利文獻2 :日本特開2005-102680號公報
[0010] 專利文獻3 :日本特開2006-304685號公報 W11] 專利文獻4 :日本特開2006-304686號公報
[0012] 專利文獻5 :日本特開2005-287380號公報
[0013]專利文獻 6 :PCT/DK96/00051
[0014] 非專利文獻
[0015]非專利文獻 1 :Poulos,ALipids30:1-14, 1995 ;Horrocks，LA和Yeo ΥΚ,PharmacolRes40:211-225,1999
[0016] 非專利文獻 2:YokoyamaR. ,HondaD. ,Mycoscience48:199-211, 2007
[0017] 非專利文獻3 :第60屆日本生物工程學會大會講演要旨集，pl36, 2008
[00化]非專利文獻 4 :Lippmeie;rJC等人，Lipids.,Jul;44 (7) : 621-30. (2009),化址)2009Jun3.
[0019] 非專利文獻 5 :陽BSLett. 553, 440-444 (2003)
[0020] 非專利文獻 6:NucleicAcidsRes. (1994)22,4673-4680)
[0021] 非專利文獻 7 :Prasher,D.C.等人，Gene, 111 (2) : 229-233 (1992)
[0022] 非專利文獻 8:ChalfieΜ.等人，Science, 263:802-805,（1994)
[0023]非專利文獻 9 :Southe;rn,P.J.,和Berg,P. ,J.Molec.Appl.Gen. 1, 327-339. (1982)
[0024] 非專利文獻10 才實驗^號スhk^テッK2遺伝子解析①基礎P63-68,秀 潤社
[00巧]非專利文獻 11danger,F.,等人Proc.化tl.Acad.Sci(1977) 74, 5463
[0026] 非專利文獻12 才實驗^號スhk^テッΚ2遺伝子解析①基礎P117-128， 秀潤社
[0027]非專利文獻 13 :Adachi,J.等人Comput.Sci.Monogr. (1996) 28

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0測發(fā)明概述
[0029] 發(fā)明所解決的課題
[0030] 本發(fā)明目的是為了使原生藻菌的有用物質(zhì)的產(chǎn)生能力提高而導入外源基因進行 轉(zhuǎn)化。通過導入與原生藻菌的有用物質(zhì)的產(chǎn)生有關的外源基因，改變有用物質(zhì)的產(chǎn)生能力 本發(fā)明目的為改變原生藻菌產(chǎn)生的脂肪酸組成的方法，使原生藻菌蓄積大量的脂肪酸的方 法，不飽和脂肪酸的制造方法，不飽和脂肪酸含量增加的原生藻菌，從運些不飽和脂肪酸含 量增加的原生藻菌生產(chǎn)提供不飽和脂肪酸。通過本發(fā)明，提供了改變原生藻菌產(chǎn)生的脂肪 酸組成和使原生藻菌蓄積大量脂肪酸的方法，使得更加有效地制造多不飽和脂肪酸成為可 能。
[0031] 解決課題的方法
[0032] 本發(fā)明人，借鑒上述現(xiàn)有技術的狀況專屯、研究的結(jié)果，為了使原生藻菌產(chǎn)生大量 不飽和脂肪酸的能力提高，成功地導入外源基因進行轉(zhuǎn)化，并且，發(fā)現(xiàn)了通過向原生藻菌導 入脂肪酸不飽和化酶基因，并使其表達進行原生藻菌產(chǎn)生的脂肪酸組成的改變的方法，W 及使得該轉(zhuǎn)化的原生藻菌蓄積大量的不飽和脂肪酸的方法，并通過進一步促進其實用化目 的的研究、開發(fā)，直至完成了本發(fā)明。
[0033] 本發(fā)明將W下（1)~（22)記載的技術事項作為要點。
[0034] (1) 一種原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于向原生藻菌中導入外源基因。
[0035](2)根據(jù)（1)所述的原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其中所述原生藻菌為網(wǎng)粘菌類。 W36] 做根據(jù)似所述的原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其中所述網(wǎng)粘菌類為屬于網(wǎng)粘 菌屬（Labyrinthula)、交鏈抱霉屬（Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、 Labyrinthuloides、裂殖壺菌屬（Schizochytrium)、海洋壺菌屬（Aurantiochytrium)、 破囊壺菌屬（Thraustochytrium)、吾肯氏壺菌屬（叫kenia)、Obion邑ichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
[0037] (4)根據(jù)（1)至（3)任一項所述的原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其中所述微生物是裂殖 壺菌（Schizochytriumsp. )M-8 株（陽RMP-19755)、金黃色破囊壺菌燈虹austochytrium aureum)ATCC；34304、破囊壺菌燈虹austochytriumsp. )ATCC26185、裂殖壺菌 (Schizochytriumsp. )ALlAc、裂壺藻（Schizochytriumaggregatum)ATCC28209、吾肯氏 壺菌Onkeniasp. )ATCC28207、裂殖壺菌（Schizoch5rtriumsp. )S邸210(NBRC102615)、 裂殖壺菌（Schizochytriumsp.)S邸345 (NBRC102616)、BotiTochytriumradia1:um S邸353(NBRC104107)、或ParietichytriumsarkarianumS邸364(陽RMABP-11298)。
[0038] (5)根據(jù)（1)至（4)任一項所述的原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其中所述外源基因為與抗 生素耐受能力、發(fā)色蛋白質(zhì)、和/或脂肪酸不飽和化酶相關聯(lián)的基因。
[0039] (6)根據(jù)（1)至（5)任一項所述的原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其中與脂肪酸不飽和化酶 相關聯(lián)的基因為A5去飽和酶基因、Δ5去飽和酶基因、和/或ω3去飽和酶基因。
[0040] (7)根據(jù)（1)至（6)任一項所述的原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于利用電穿孔或 基因槍法導入外源基因。
[0041] (8) -種改變原生藻菌脂肪酸組成的方法，其特征在于導入脂肪酸不飽和化酶基 因，并表達該脂肪酸不飽和化酶。
[0042] (9)根據(jù)（8)所述的方法，其中脂肪酸不飽和化酶是去飽和酶。
[0043] (10)根據(jù)（8)或（9)所述的方法，其中脂肪酸不飽和化酶是Δ5去飽和酶、Δ5去 飽和酶、或ω3去飽和酶。 W44] (11)根據(jù)做至（10)任一項所述的方法，其中所述原生藻菌為網(wǎng)粘菌類。 W45](。）根據(jù)（11)所述的方法，其中所述網(wǎng)粘菌類為屬于網(wǎng)粘菌屬化油yrinthula)、 交鏈 抱霉屬（Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、 裂殖壺菌屬（Schizoch}ft;rium)、海洋壺菌屬（Aurantiochytrium)、破囊壺菌屬 (Thraustochytrium)、吾肯氏壺菌屬（Ulkenia)、Oblongichytrium、Botryochytrium、 Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
[0046] (13)根據(jù)（12)所述的方法，其中所述微生物是裂殖壺菌（Schizochytriumsp.) M-8 株（陽RMP-19755)、金黃色破囊壺菌燈虹austochytriumaureum)ATCC：M304、破囊 壺菌燈虹austochytriumsp.)ATCC26185、裂殖壺菌（Schizoch}ft;riumsp.)ALlAc、裂壺 藻（Schizoch}ft;riumaggregatum)ATCC28209、吾肯氏壺菌化化eniasp.)ATCC28207、 裂殖壺菌（Schizoch}ft;riumsp. )S邸210(NBRC102615)、裂殖壺菌（Schizoch}ft;rium sp.)SEK345(NBRC102616)、Bot巧ochytriumradiatumSEK353(NBRC104107)、或 ParietichytriumsarkarianumS邸364(陽RMABP-11298)。
[0047] (14)通過（8)至（13)任一項所述的方法使原生藻菌大量蓄積脂肪酸的方法。
[0048] (15)根據(jù)（14)所述的方法，其中所述脂肪酸為不飽和脂肪酸。
[0049] (16)根據(jù)（15)所述的方法，其中所述不飽和脂肪酸為碳原子數(shù)在18-22的不飽和 脂肪酸。
[0050] (17)通過（14)至（16)任一項所述的方法得到的脂肪酸。
[0051] (18)W脂肪酸組成的改變?yōu)槟康谋晦D(zhuǎn)化的原生藻菌。
[0052] (19)W使脂肪酸大量蓄積為目的被轉(zhuǎn)化的原生藻菌。
[005引 （20)根據(jù)（18)或（19)所述的原生藻菌，其為網(wǎng)粘菌類。
[0054] (21)根據(jù)（20)所述的原生藻菌，其中所述網(wǎng)粘菌類為屬于網(wǎng)粘菌屬 (L曰byrinthul曰）、交鏈 抱霉屬（Altorni曰）、Apl曰nochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、裂殖壺菌屬（Schizochytrium)、海洋壺菌屬（Aurantiochytrium)、 破囊壺菌屬（Thraustochytrium)、吾肯氏壺菌屬（叫kenia)、Obion邑ichytrium、 Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。 陽化日](22)根據(jù)（21)所述的原生藻菌，其中所述微生物是裂殖壺菌（Schizochytrium sp. )M-8 株（陽RMP-19755)、金黃色破囊壺菌燈虹austochytriumaureum)ATCC；34304、破 囊壺菌（T虹austochytriumsp. )ATCC26185、裂殖壺菌（Schizoch}ft;riumsp. )ALlAc、裂 壺藻（Schizochytriumaggregatum)ATCC28209、吾肯氏壺菌 〇J化eniasp.)ATCC28207、 裂殖壺菌（Schizoch}ft;riumsp. )S邸210(NBRC102615)、裂殖壺菌（Schizoch}ft;rium sp.)SEK345(NBRC102616)、BotryochytriumradiatumSEK353(NBRC104107)、或 ParietichytriumsarkarianumS邸364(陽RMABP-11298)。
[0056] 發(fā)明效果
[0057] 通過本發(fā)明，W下成為可能：導入與原生藻菌的有用物質(zhì)（不飽和脂肪酸）的產(chǎn) 生有關的外源基因而改變有用物質(zhì)的產(chǎn)生能力，通過該改變，改變原生藻菌產(chǎn)生的脂肪酸 組成的方法，使原生藻菌蓄積大量脂肪酸的方法，不飽和脂肪酸的制造方法，提供不飽和脂 肪酸含量增加的原生藻菌，從運些不飽和脂肪酸含量增加的原生藻菌生產(chǎn)提供不飽和脂肪 酸。通過改變原生藻菌產(chǎn)生的脂肪酸組成，W及提供使原生藻菌蓄積大量脂肪酸的方法，能 夠更加有效地制造多不飽和脂肪酸。
【附圖說明】
[0058] 圖1表示顯示敏感性的抗生素篩選結(jié)果。其中，A為金黃色破囊壺菌，B為破囊 壺菌，C為血0186,D為ALlAc。另外，X軸的項目名從左側(cè)開始按照如下的順序：對照 G418(2mg/ml)、博來霉素（Img/ml)、嚷嶺霉素（lOOyg/ml)、殺稻攝菌素（lOOyg/ml)、潮 霉素（2mg/ml)、氯霉素（30yg/ml)、卡那霉素（50yg/ml)、青霉素巧00yg/ml)、鏈霉素 巧00μg/ml)、四環(huán)素（100μg/ml)。
[0059] 圖2表示金黃色破囊壺菌化aureum)在液體培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其中，A為 G418-0. 5mg/ml~，B為潮霉素-1.Omg/ml~，C為殺稻攝菌素-75μg/ml~。 W60] 圖3表示破囊壺菌（T虹austochytriumsp.)在液體培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其 中，A為G418-lmg/ml~，B為潮霉素-0. 3mg/ml~，C為殺稻攝菌素-0. 6mg/ml~，D為博 來霉素-70μg/ml~。 陽06U 圖4表示血0186在液體培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其中，A為G418-0. 175mg/ml~， B為潮霉素-0. 8mg/ml~，C為博來霉素-8μg/ml~。 陽06引 圖5表示ALlAc在液體培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其中，A為G418-0. 6mg/ml~，B 為潮霉素-32μg/ml~，C為殺稻攝菌素，D為博來霉素，殺稻攝菌素W及博來霉素需要較高 濃度。
[0063]圖6表示金黃色破囊壺菌化aureum)在平板培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其中， G418-lmg/ml~，潮霉素-2mg/ml~，殺稻攝菌素-0. 4mg/ml~。 W64] 圖7表示破囊壺菌（T虹austochytriumsp.)在平板培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其 中，G418-1. 5mg/ml~，潮霉素-6mg/ml~，殺稻攝菌素-1. 4mg/ml~，博來霉素需要較高濃 度。 W65] 圖8表示血0186在平板培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其中，G418-0. 5mg/ml~，潮霉 素-2.Omg/ml~，殺稻攝菌素-0. 5mg/ml~，殺稻攝菌素中W1. 42mg/ml抑制增殖。
[0066]圖9表示ALlAc在平板培養(yǎng)時的最低抑菌濃度。其中，G418-1.Omg/ml~，潮霉素-1.Om邑/ml~。 W67] 圖10表示耐藥性基因盒的模式圖巧F-la啟動子、終止子）。[符號的說 明]1. 18S2. 1R3. 2F4.ne〇-p;r〇-3F5.n-G-p;r〇-3F6.n-te;rm-G-4R7.n-te;rm-G-4F8.終 止子5R。
[0068] 圖11表示耐藥性基因盒的模式圖（泛素啟動子、終止子）。[符號的說明]1. NdellSSF2. 18s-fug-ubq-R3.Ubpro-Hindlll-R4.Ubp;roG418fuslR日.ubp;roG418fus2F 6. G418ubtersus3R7.G418ubterfus4F8.KpnlterR。
[0069] 圖12表示構(gòu)建的網(wǎng)粘菌-大腸桿菌穿梭載體（shuttle-vector)。
[0070] 圖13表示將G418耐受能力作為指標的A.limacinum轉(zhuǎn)化體的評價。
[007U圖14表示A.limacinum轉(zhuǎn)化體和野生株的形態(tài)比較。 陽07引 圖15表示通過W基因組DNA作為模板的PCR的A.limacinum轉(zhuǎn)化體的評價。[符 號的說明]1:轉(zhuǎn)化體1 2:轉(zhuǎn)化體2 3:轉(zhuǎn)化體3 4:轉(zhuǎn)化體4 5:轉(zhuǎn)化體5 6:野生型7:陽 性對照（W導入的DNA片段作為模板）
[0073] 圖16表不通過印記雜交（southernblotting)的A.limacinum轉(zhuǎn)化體的評價。 [符號的說明](A)1.陽性對照（476pg的導入DNA) 2.轉(zhuǎn)化體1，甜曰1處理3.轉(zhuǎn)化體1， Pstl處理4.轉(zhuǎn)化體1，化ndlll處理5.轉(zhuǎn)化體l，EcoRl處理6.轉(zhuǎn)化體l，BamHl處理7~ 11.陰性對照（野生型）；度）1.陽性對照（3化g的導入DNA) 2.野生型，Pstl處理3.轉(zhuǎn) 化體5,Pst1處理4.轉(zhuǎn)化體4,Pst1處理5.轉(zhuǎn)化體3,Pst1處理6.轉(zhuǎn)化體2,Pst1處理 7. 轉(zhuǎn)化體1，Pst1處理。
[0074] 圖17表示通過RT-PCR的A.limacinum轉(zhuǎn)化體的評價。[符號的說明]1:轉(zhuǎn)化體 1 2 :轉(zhuǎn)化體2 3 :轉(zhuǎn)化體3 4 :轉(zhuǎn)化體4 5 :轉(zhuǎn)化體5 6 :野生型7 :陽性對照（W導入的DNA 片段為模板）8~13 :W總RNA為模板。 陽07引 圖18表示金黃色破囊壺菌化aureum)轉(zhuǎn)化體和野生株的形態(tài)比較。其中，A為 野生型，B為轉(zhuǎn)化體1，C為轉(zhuǎn)化體2,D為轉(zhuǎn)化體3。
[0076]圖19表示通過W基因組DNA作為模板的PCR和印記雜交（southernblotting) 的金黃色破囊壺菌化aureum)轉(zhuǎn)化體的評價。[符號的說明](A)M:(1)X174/Hincll， 入化ndlll1 :無模板2 :陽性對照（導入DM片段）3 :轉(zhuǎn)化體1 4 :轉(zhuǎn)化體2 5 :轉(zhuǎn)化體3 6 :野生型度)P:陽性對照（導入DM2. 5ng) 1 :野生型，Notl處理2 :轉(zhuǎn)化體1，Notl處理 3 :轉(zhuǎn)化體2,Notl處理4 :轉(zhuǎn)化體3,Notl處理。 陽077] 圖20表示通過RT-PCR的金黃色破囊壺菌化aureum)轉(zhuǎn)化體的評價。[符號的說 明]Μ:d)X174/HincII，AHindlll1 :轉(zhuǎn)化體1 2 :轉(zhuǎn)化體2 3 :轉(zhuǎn)化體3 4 :野生型5 :陽性 對照（導入DNA片段）6~9 :在1~4中WRNA為模板的PCR(陰性對照）。
[0078] 圖21表示通過W基因組DM作為模板的PCR和印記雜交（southernblotting) 的破囊壺菌燈虹austochytriumsp.)ATCC26185轉(zhuǎn)化體的評價。[符號的說明](A)l: 入Hindlll消化 /d)x-174HincII消化 2 :野生型DNA(2F/5R) 3 :野生型DM(僅 2F) 4 :野 生型DNA(僅5R) 5 :轉(zhuǎn)化體-1DNA(2F/5R) 6 :轉(zhuǎn)化體-1DNA(僅2F) 7 :轉(zhuǎn)化體-1DNA(僅 5R) 8 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(2F/5R) 9 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(僅 2F) 10 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(僅 5R) 11 : 轉(zhuǎn)化體-3DNA(2F/5R) 12 :轉(zhuǎn)化體-3RNA(僅2F) 13 :轉(zhuǎn)化體-3RNA(僅5R) 14 :陽性 對照畑/5R) 15 :陽性對照（僅2F) 16 :陽性對照（僅5R)度）1 :λHindlll消化/ Φx-174Hincn消化 2 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(2F/4R) 3 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(僅 2F) 4 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(僅 4R) 5 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(3F/4R) 6 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(僅 3F) 7 :轉(zhuǎn)化體-2DNA(3F/5R) 8 :轉(zhuǎn)化 體-2DNA(僅5R)(C) 1:野生型，PstI處理2:野生型Hindlll處理3:轉(zhuǎn)化體-IPstI處 理4 :轉(zhuǎn)化體-1，Hindlll處理5 :轉(zhuǎn)化體-2,PstI處理6 :轉(zhuǎn)化體-2,Hindlll處理71 : 轉(zhuǎn)化體-3,PstI處理8 :轉(zhuǎn)化體-3,Hindlll處理10 :陽性對照（lOOng的導入DNA)。
[0079] 圖22表不通過RT-PCR的破囊壺菌（T虹austochytriumsp.)ATCC26185轉(zhuǎn)化體的 評價。[符號的說明](A)l:AHindin消化/d)x-174Hincn消化 2 :野生型cDNA(3F/4R)3 : 野生型cDNA(僅3F) 4:野生型cDNA(僅4R) 5:野生型RNA(3F/4R) 6:野生型RNA(僅 3巧7 :野生型RNA(僅4R) 8 :轉(zhuǎn)化體-IcDNA(3F/4R) 9 :轉(zhuǎn)化體-IcDNA(僅3F) 10 :轉(zhuǎn)化 體-1cDNA(僅 4R) 11 :轉(zhuǎn)化體-1RNA(3F/4R) 12 :轉(zhuǎn)化體-1RNA(僅 3巧 13 :轉(zhuǎn)化體-1RNA(僅 4R) 14 :陽性對照（3F/4R) 15 :陽性對照（僅3F) 16 :陽性對照（僅4R)度）1 :AHindlll 消化 /Φx-174HincII消化t2 :轉(zhuǎn)化體-2cDNA(3F/4R) 3 :轉(zhuǎn)化體-2cDNA(僅 3F) 4 :轉(zhuǎn)化 體-2cDNA(僅 4R) 5 :轉(zhuǎn)化體-2RNA(3F/4R) 6 :轉(zhuǎn)化體-2RNA(僅 3F) 7 :轉(zhuǎn)化體-2RNA(僅 4R) 8 :轉(zhuǎn)化體-3cDNA(3F/4R) 9 :轉(zhuǎn)化體-3cDNA(僅 3F) 10 :轉(zhuǎn)化體-3cDNA(僅 4R) 11 : 轉(zhuǎn)化體-3RNA(3F/4R) 12 :轉(zhuǎn)化體-3RNA(僅3F) 13 :轉(zhuǎn)化體-3RNA(僅4R) 14 :陽性對照 (3F/4R) 15 :陽性對照（僅3巧16 :陽性對照（僅4R)。
[0080] 圖23表示通過W基因組DNA為模板的PCR的裂殖壺菌（Schizochytriumsp.) ALlAc轉(zhuǎn)化體的評價。[符號的說明]1~3道：轉(zhuǎn)化體4~6道：野生株7道：無模板 DNA(陰性對照）8道擬導入的DNA為模板（陽性對照）。
[0081] 圖24表示制得的GFP(綠色巧光蛋白）基因/耐新霉素基因表達盒的模式圖。 化-pro-Fl和化-term-R2在序列中分別有化ηI位點。 陽0間圖25表示W(wǎng)對照株和GFP基因/耐新霉素基因表達盒導入株來源的基因組DNA作為模板的PCR分析。各自表示如下：Α，Β是Aurantiochytriumsp.mh0186、C，D是金黃 色破囊壺菌化aureum)中PCR結(jié)果、W及A,C是耐新霉素基因、B，D是擴增GFP基因的結(jié) 果。[符號的說明]Μ:λHindlll消化/Φx-174HincII消化N:野生株（陰性對照）C:耐 新霉素基因表達盒導入株（A，C中是陽性對照/B，D中是陰性對照）T:GFP基因/耐新霉 素基因表達盒導入株P:將GFP基因/耐新霉素基因表達盒作為模板（陽性對照）。
[0083] 圖26表示W(wǎng)對照株和GFP基因/耐新霉素基因表達盒導入株來源的c