一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在重金屬污染嚴(yán)重的土壤生態(tài)系統(tǒng)中，微生物處在重金屬脅迫環(huán)境下，經(jīng)過長期的自然選擇，也會(huì)形成一些獨(dú)特的微生物群落，其中包括一些重金屬耐性微生物，成為具有較高應(yīng)用價(jià)值的土壤修復(fù)材料。微生物對(duì)污染土壤的修復(fù)作用表現(xiàn)為促進(jìn)土壤的生物改造或生物改良、對(duì)土壤重金屬起到生物轉(zhuǎn)化和生物吸附作用，或者通過吸收、沉淀、固定、共價(jià)轉(zhuǎn)化等方式，將土壤中的有毒金屬離子低毒脂，從而降低重金屬對(duì)土壤環(huán)境的毒害，并且具有高效率、低成本、無二次污染等優(yōu)勢。利用微生物降低土壤重金屬毒性已經(jīng)成為修復(fù)重金屬污染環(huán)境的有效措施，受到環(huán)境治理工作者的普遍關(guān)注。
[0003]獲得重金屬耐性微生物菌株是成功利用微生物修復(fù)重金屬污染土壤的關(guān)鍵所在。野外采樣、室內(nèi)重金屬脅迫分離培養(yǎng)是篩選重金屬耐性微生物的常用方法，具有取樣簡單、操作方便和成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)見性較低，篩選效率不高等不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]—種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法，具體包括以下步驟:
[0007](1)選擇誘捕地:選擇重金屬污染嚴(yán)重的采礦廢棄地為重金屬耐性真菌誘捕地，采集樣品，分析誘捕地土壤重金屬污染情況，確定誘捕地土壤特征污染元素；
[0008](2)制備誘捕培養(yǎng)基:以Martin培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中加入誘捕地土壤特征污染元素中的一種或幾種重金屬元素，制備得到誘捕不同重金屬耐性真菌的誘捕培養(yǎng)基，所述誘捕培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基；
[0009](3)將誘捕培養(yǎng)基裝入誘捕袋中，所述誘捕袋為尼龍網(wǎng)袋，再將誘捕袋埋入誘捕地土壤中，2?3個(gè)月后，取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養(yǎng)基研磨后過篩，加無菌水稀釋后震蕩培養(yǎng)，隨后配制成不同濃度梯度的誘捕培養(yǎng)基稀釋液；
[0010](4)取各濃度的誘捕培養(yǎng)基稀釋液，分別涂布于誘捕培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后挑取單菌落，重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物；所述純培養(yǎng)物即為重金屬耐性真菌。
[0011]上述方案中，步驟(2)所述重金屬元素在Martin培養(yǎng)基中的濃度與其在誘捕地土壤中的濃度相當(dāng)。
[0012]上述方案中，步驟(3)所述誘捕袋的網(wǎng)眼為350目?450目。
[0013]上述方案中，步驟(3)所述將誘捕袋埋入誘捕地土壤中的具體操作步驟為:每年春季氣溫穩(wěn)定通過25°C之后，在誘捕地上隨機(jī)設(shè)置5?10個(gè)樣方，每個(gè)樣方內(nèi)按梅花5點(diǎn)法，從表土往下挖深20?25cm的豎坑5個(gè)，每個(gè)豎坑底部水平擺放1個(gè)裝有誘捕培養(yǎng)基的誘捕袋，回填表土與地表平。
[0014]上述方案中，步驟(3)所述振蕩培養(yǎng)的條件為:28°C?30°C、100r/min?110r/min條件下振蕩培養(yǎng)30min?60min。
[0015]上述方案中，步驟(3)中，誘捕培養(yǎng)基研磨后過30目篩。
[0016]上述方案中，步驟(4)所述培養(yǎng)的條件為:28°C?30°C培養(yǎng)4?5天。
[0017]本發(fā)明所述從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法，其關(guān)鍵的點(diǎn)在于:選擇重金屬污染嚴(yán)重的采礦廢棄地為誘捕地，以添加了誘捕地土壤特征污染元素的Martin培養(yǎng)基為誘捕培養(yǎng)基，春季氣溫穩(wěn)定通過25 °C時(shí)將裝有誘捕培養(yǎng)基的誘捕袋埋入土中，2?3個(gè)月后取出誘捕袋，利用袋中的誘捕培養(yǎng)基制備稀釋液，采用涂布法利用誘捕培養(yǎng)基分離、篩選對(duì)誘捕地土壤特征污染元素具有耐性的真菌。進(jìn)一步地，挑取獲得的純培養(yǎng)物(重金屬耐性真菌)的真菌菌絲和孢子，置于光鏡下(10X40倍)直接觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征，鑒定所誘捕的真菌所屬的種屬。
[0018]本發(fā)明的有益效果如下:(1)本發(fā)明所述方法篩選預(yù)見性好:本發(fā)明以重金屬污染嚴(yán)重的礦業(yè)廢棄地為誘捕地，采用含有土壤特征污染元素的真菌培養(yǎng)基Martin為誘捕培養(yǎng)基誘捕重金屬耐性真菌，目標(biāo)明確，針對(duì)性強(qiáng)，大大提高了誘捕、篩選重金屬耐性真菌的預(yù)見性。(2)篩選效率高:本發(fā)明中，將裝有誘捕培養(yǎng)基的誘捕袋埋入誘捕地土壤中，由于誘捕培養(yǎng)基在土壤中與重金屬耐性真菌直接接觸，重金屬耐性真菌借助誘捕培養(yǎng)基的營養(yǎng)生活、繁殖，使得誘捕培養(yǎng)基中重金屬耐性真菌數(shù)量增加，有效提高了誘捕、篩選重金屬耐性真菌的效率，可以快速獲得重金屬耐性真菌。采用本發(fā)明所述從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法篩選土壤重金屬耐性真菌，獲得土壤特征污染元素耐性真菌的誘捕率達(dá)到100%。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0020]以下實(shí)施例中，選擇湖北大冶銅綠山銅鐵礦廢棄露采場為重金屬耐性真菌誘捕地。土壤平均Cu含量為518.32mg/Kg、平均Cd含量為2.05mg/Kg,均達(dá)到重度污染水平。Cu、Cd為誘捕土壤的特征污染元素。
[0021]實(shí)施例1誘捕重金屬Cu耐性真菌
[0022]2011年5月10日，將裝入誘捕培養(yǎng)基(Cu含量為550mg/Kg的Martin固體培養(yǎng)基)的誘捕袋(誘捕袋的大小為15cmX 10cm，網(wǎng)眼為400目)埋入誘捕地。誘捕地設(shè)5個(gè)樣方，樣方大小為3mX 3m，每個(gè)樣方內(nèi)按梅花5點(diǎn)法，從表土往下挖開口 30cmX30cm、深20?25cm的豎坑5個(gè)，每個(gè)豎坑底部水平擺放1個(gè)裝有誘捕培養(yǎng)基的誘捕袋，回填表土與地表平，共計(jì)埋入25個(gè)誘捕袋。
[0023]2011年7月10日，從土壤中取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養(yǎng)基研磨后過30目篩，取10g培養(yǎng)基用90ml無菌水稀釋，30°C、110r/min、振蕩培養(yǎng)30min后，靜置lOmin，分別配制成濃度梯度為10 2、ιο 3、10 4和10 5的稀釋液；用涂布法分別接種于誘捕培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)5d后，挑取單菌落，經(jīng)過重復(fù)劃線培養(yǎng)，從25個(gè)誘捕袋中獲得34個(gè)真菌純培養(yǎng)菌株，每個(gè)誘捕袋都分離得到重金屬Cu耐性真菌，誘捕袋平均分離到重金屬Cu耐性真菌的菌株1.36個(gè)，誘捕率為100%。經(jīng)鑒定和復(fù)篩，34個(gè)重金屬Cu耐性真菌菌株中，21株為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)，13 株為黑曲霉(Aspergillus niger)。
[0024]實(shí)施例2誘捕重金屬Cd耐性真菌
[0025]2012年6月5日，將裝入誘捕培養(yǎng)基(Cd含量為2mg/Kg的Martin固體培養(yǎng)基)的誘捕袋(誘捕袋的大小為15cmX 10cm，網(wǎng)眼為400目)埋入誘捕地。誘捕地設(shè)5個(gè)樣方，樣方大小為3mX 3m，每個(gè)樣方內(nèi)按梅花5點(diǎn)法，從表土往下挖開口 30cmX30cm、深20?25cm的豎坑5個(gè)，每個(gè)豎坑底部水平擺放1個(gè)裝有誘捕培養(yǎng)基的誘捕袋，回填表土與地表平，共計(jì)埋入25個(gè)誘捕袋。
[0026]2012年8月5日，從土壤中取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養(yǎng)基研磨后，參照實(shí)施例1的方法、步驟、條件，制備誘捕培養(yǎng)基稀釋液、分離培養(yǎng)重金屬Cd耐性真菌。從25個(gè)誘捕袋中獲得29個(gè)真菌純培養(yǎng)菌株，每個(gè)誘捕袋都分離得到重金屬Cd耐性真菌，誘捕袋平均分離到重金屬Cd耐性真菌的菌株1.16個(gè)，誘捕率為100%。經(jīng)鑒定和復(fù)篩，29個(gè)重金屬Cd耐性真菌菌株中，17株為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，12株為黑曲霉(Aspergillusniger)。
[0027]顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限制。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選擇誘捕地:選擇重金屬污染嚴(yán)重的采礦廢棄地為重金屬耐性真菌誘捕地，采集樣品，分析誘捕地土壤重金屬污染情況，確定誘捕地土壤特征污染元素； (2)制備誘捕培養(yǎng)基:以Martin培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中加入誘捕地土壤特征污染元素中的一種或幾種重金屬元素，制備得到誘捕不同重金屬耐性真菌的誘捕培養(yǎng)基，所述誘捕培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基； (3)將誘捕培養(yǎng)基裝入誘捕袋中，所述誘捕袋為尼龍網(wǎng)袋，再將誘捕袋埋入誘捕地土壤中，2~3個(gè)月后，取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養(yǎng)基研磨后過篩，加無菌水稀釋后震蕩培養(yǎng)，隨后配制成不同濃度梯度的誘捕培養(yǎng)基稀釋液； (4)取各濃度的誘捕培養(yǎng)基稀釋液，分別涂布于誘捕培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后挑取單菌落，重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物；所述純培養(yǎng)物即為重金屬耐性真菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述重金屬元素在Martin培養(yǎng)基中的濃度與其在誘捕地土壤中的濃度相當(dāng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述將誘捕袋埋入誘捕地土壤中的具體操作步驟為:每年春季氣溫穩(wěn)定通過25°C之后，在誘捕地上隨機(jī)設(shè)置5~10個(gè)樣方，每個(gè)樣方內(nèi)按梅花5點(diǎn)法，從表土往下挖深20~25cm的豎坑5個(gè)，每個(gè)豎坑底部水平擺放1個(gè)裝有誘捕培養(yǎng)基的誘捕袋，回填表土與地表平。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，誘捕培養(yǎng)基研磨后過30目篩。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述振蕩培養(yǎng)的條件為:28°C ~30°C、100r/min~110 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 30min~60min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述培養(yǎng)的條件為:28°C-30°C培養(yǎng)4~5天。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述誘捕袋的網(wǎng)眼為350目-450目。
【專利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法。所述方法為：選擇重金屬污染嚴(yán)重的采礦廢棄地為誘捕地，以添加誘捕地土壤特征污染元素的Martin培養(yǎng)基為誘捕培養(yǎng)基，春季氣溫穩(wěn)定通過25℃時(shí)將裝有誘捕培養(yǎng)基的誘捕袋埋入土中，2～3個(gè)月后取出誘捕袋，利用袋中的誘捕培養(yǎng)基制備稀釋液，采用涂布法利用誘捕培養(yǎng)基分離、篩選對(duì)誘捕地土壤特征污染元素具有耐性的真菌。本發(fā)明方法的目標(biāo)明確，針對(duì)性強(qiáng)，誘捕、篩選重金屬耐性真菌的預(yù)見性好；同時(shí)還具有誘捕、篩選重金屬耐性真菌的效率高的優(yōu)點(diǎn)，采用本發(fā)明所述方法篩選土壤重金屬耐性真菌，獲得土壤特征污染元素耐性真菌的誘捕率達(dá)到100%。
【IPC分類】C12N1/14
【公開號(hào)】CN105368724
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510966488
【發(fā)明人】康薇, 鄭進(jìn)
【申請(qǐng)人】湖北理工學(xué)院
【公開日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日