一種通過菌藻共培養(yǎng)提高葉黃素產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及葉黃素制備提取領(lǐng)域，具體設(shè)及一種通過菌藻共培養(yǎng)提高葉黃素產(chǎn)量 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉黃素（lutein)，又名黃體素，是含氧類胡蘿h素--類葉黃素(xanthophyl)中的 一種，廣泛存在于花弁、水果蔬菜等植物中，作為一種天然黃色素，葉黃素可用作食品、醫(yī)藥 和化妝品的色素添加劑。此外，葉黃素能激發(fā)免疫反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力，防治年齡相關(guān)性 視黃斑退化引起的視力下降和失明等生理活性(吳正云，等，微藻生物合成葉黃素的研究進(jìn) 展.食品科學(xué)，2010，31 (01): 268-273)。美國(guó)從20世紀(jì)70年代起開始從萬(wàn)壽菊中提取葉黃 素，1995年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了葉黃素作為食品補(bǔ)充劑用于食品和飲料。 我國(guó)衛(wèi)生部也于2007年批準(zhǔn)葉黃素用于賠烤食品、飲料、果凍、果醬W及冷凍食品。目前具 有生物功能活性的葉黃素均來(lái)自植物。但植物種植占地面積大，成本高，周期長(zhǎng)，受氣候條 件影響大，導(dǎo)致葉黃素的生產(chǎn)成本較高。
[0003] 小球藻是一種單細(xì)胞綠藻，其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，易于大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞中含有豐富的 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是蛋白核小球藻具有長(zhǎng)期安全食用的歷史，其中人工培養(yǎng)的蛋白核小球藻 已被批準(zhǔn)作為新食品資源。小球藻尤W富含葉黃素（lutein)而受到關(guān)注(吳正云，等，小球 藻異養(yǎng)生長(zhǎng)及葉黃素合成量影響因子的優(yōu)化研究.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2007， 25(1):6-11)
[0004] 新興的菌藻共生技術(shù)有望突破當(dāng)前小球藻開發(fā)方面存在的產(chǎn)率低、收獲難、成本 高等技術(shù)限制，大大拓寬小球藻的生產(chǎn)應(yīng)用范圍。已有研究表明微藻和微生物之間存在從 寄生到共生等廣泛的互作現(xiàn)象，某些微生物能通過分泌生長(zhǎng)激素和信號(hào)調(diào)節(jié)物質(zhì)促進(jìn)藻細(xì) 胞生長(zhǎng)，提高藻細(xì)胞生物量和生化組分的積累[Ueda H,et al.Bacterial communities constructed in artificial consortia of bacteria and Chlorel la vulgaris .Microbes Environment，2010，25( I): 36-40 ?] D但不同種類的細(xì)菌對(duì)小球藻生長(zhǎng) 和代謝的影響不同，有的促進(jìn)，有的抑制，效果差別很大。通過篩選獲得優(yōu)良菌株作為小球 藻的共生菌，人工構(gòu)建菌藻共生體系一方面有望使藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率大幅提高(Park Y，et al.Growth promotion of Chlorella elIipsoidea by co-inoculation with Brevundimonas sp. isolated from the microalga.Hydrobiologia,2008,598(I):219-228；Kim B H，et al.民ole of rhizobium，a plant growth promoting bacterium,in enhancing algal biomass through mutualistic interaction.Biomass and Bioenergy ,2014,69(3) :95-105.),并可能通過利用共生菌分泌產(chǎn)生的生物絮凝劑的作用 提高藻細(xì)胞的絮凝率，大幅降低藻細(xì)胞的采收成本化ee J，et al .Microalgae-associated bacteria play a key role in the flocculation of Chlorella vulgaris.Bioresource Technology ,2013,131(2): 195-201;施春陽(yáng)，等?微生物絮凝劑的 研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].污染防治技術(shù)，2013,26(3) :48-51.)。
[0005] 植物內(nèi)生菌是能夠定殖在健康植物內(nèi)，并與宿主植物建立和諧共生關(guān)系的一類微 生物。水稻植株含有許多內(nèi)生微生物，是重要的內(nèi)生細(xì)菌資源，來(lái)源于水稻植株的內(nèi)生泛菌 可W顯著促進(jìn)宿主水稻的生長(zhǎng)，提高其生物量、葉綠素及憐含量的生物學(xué)作用（Fen巧，et al.民ice endophyte Pantoea aggIomeransYSI9promotes hostplant growth and affects allocations of hostphotosynthates.Journal of Applied Microbiology, 2006，100(5): 938-945.劉佳，等.內(nèi)生成團(tuán)泛菌HAUMl對(duì)宿主水稻的定殖及促生作用.湖北 農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(23): 4820-4824.)。由于小球藻與植物細(xì)胞一樣具有葉綠體，能夠進(jìn)行 光合作用，其生化代謝特征與植物具有相似性，理論上，對(duì)植物具有代謝調(diào)節(jié)作用的植物內(nèi) 生菌也能影響小球藻的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)，但迄今國(guó)內(nèi)外未見采用包括水稻內(nèi)生菌在內(nèi)的植 物內(nèi)生菌促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)及生化組分合成積累的技術(shù)研究和應(yīng)用。
[0006] 已有研究表明，通氣量和葡萄糖濃度等對(duì)小球藻比生長(zhǎng)速率和細(xì)胞的葉黃素含量 的影響趨勢(shì)大體相同，即有利于提高小球藻比生長(zhǎng)速率的條件也同時(shí)有利于增加細(xì)胞的葉 黃素含量，運(yùn)可能是由于葉黃素為初級(jí)類胡蘿h素，其合成在很大程度上與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān) (Zhang D H,et al.Composition and accumulation of secondary carotenoids in Qilorococcum sp.[J]. J Appl Phycol, 1997,9(2) :147-155;吳正云，等，小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng) 及葉黃素合成量影響因子的優(yōu)化研究.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2007,25(1) :6- 11)。
[0007] 本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前小球藻工業(yè)化生產(chǎn)中藻細(xì)胞生產(chǎn)效率低，葉黃素制備成本較高的 關(guān)鍵技術(shù)限制，開發(fā)一種應(yīng)用水稻內(nèi)生泛菌促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)速率和提高葉黃素產(chǎn)量的人工 菌藻共培養(yǎng)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種通過菌藻共培養(yǎng)提高葉黃素產(chǎn)量的方法，通過應(yīng)用水稻內(nèi)生泛 菌和小球藻進(jìn)行菌藻共培養(yǎng)提高小球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和生物量，同時(shí)提高藻細(xì)胞的葉黃 素含量。
[0009] -種通過菌藻共培養(yǎng)提高葉黃素產(chǎn)量的方法，包括W下步驟：
[0010] 1)將第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌和小球藻在光照下進(jìn)行第一輪菌藻共培養(yǎng)，培養(yǎng) 結(jié)束后，得到第一輪菌藻共培養(yǎng)液；
[0011] 2)在第一輪菌藻共培養(yǎng)液中再補(bǔ)加第二次加入的水稻內(nèi)生泛菌，在光照下進(jìn)行第 二輪菌藻共培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，得到第二輪菌藻共培養(yǎng)液；
[0012] 3)對(duì)第二輪菌藻共培養(yǎng)液經(jīng)離屯、后得到菌藻細(xì)胞沉淀，之后經(jīng)后處理得到菌藻細(xì) 胞干品；
[0013] 4)將小球藻細(xì)胞干品粉碎，得到菌藻粉，之后采用有機(jī)溶劑提取液提取葉黃素，得 到葉黃素。
[0014] W下作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案：
[0015] 步驟1)中，所述的第一輪菌藻共培養(yǎng)的條件為:培養(yǎng)條件均為23°C~33°C，光強(qiáng) 1500~2500LUX，光周期為10~14虹晝/10~Hhr夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻 2~6次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為6~12天。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的第一輪菌藻共培養(yǎng)的 條件為:培養(yǎng)條件均為28°C，光強(qiáng)2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天 搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻4次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為8天。
[0016] 所述的第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌和小球藻的菌藻比為1~10000:1，在一定范圍 內(nèi)，水稻內(nèi)生泛菌的比例越高，越能夠促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)，越能夠提高藻細(xì)胞的葉黃素含 量。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌和小球藻的菌藻比為10~1000:1。再進(jìn) 一步優(yōu)選，所述的第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌和小球藻的菌藻比為100~1000:1。
[0017] 所述的水稻內(nèi)生泛菌可采用市