售產(chǎn)品，可采用中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中屯、(ACCC)出 售的編碼為10454的水稻內(nèi)生泛菌菌種。
[0018] 所述的小球藻可W為蛋白核小球藻，也可采用市售產(chǎn)品，可采用中國科學(xué)院野生 生物種質(zhì)庫淡水藻種庫(FACHB)市售的編號(hào)為FACHB-1222的蛋白核小球藻。
[0019] 步驟2)中，所述的第二輪菌藻共培養(yǎng)的條件為:培養(yǎng)條件均為23°C~33°C，光強(qiáng) 1500~2500LUX，光周期為10~14虹晝/10~Hhr夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻 2~6次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為2~12天。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的第二輪菌藻共培養(yǎng)的 條件為:培養(yǎng)條件均為28°C，光強(qiáng)2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天 搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻4次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為4~8天。
[0020] 所述的第二次加入的水稻內(nèi)生泛菌和第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌的比為0.25~ 4:1。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的第二次加入的水稻內(nèi)生泛菌和第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌的比為 1:1，能夠更好地促進(jìn)小球藻的生長，越能夠提高提高藻細(xì)胞的葉黃素含量。
[0021 ] 步驟3)中，所述的離屯、為:6000~1000化/min離屯、5~20min，進(jìn)一步優(yōu)選，所述的 離屯、為:80(K)r/min離屯、lOmin。作為優(yōu)選，所述的后處理包括:洗涂、離屯、和干燥，將小球藻 細(xì)胞沉淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經(jīng)6000~1000化/min離屯、5~20min后收集，之后在30°C ~50°C低溫條件下烘干，得到小球藻藻細(xì)胞干品。進(jìn)一步優(yōu)選，將小球藻細(xì)胞沉淀加入蒸饋 水重懸洗涂后，經(jīng)8000r/min離屯、IOmin后收集，之后在37~40°C低溫條件下烘干，得到菌藻 細(xì)胞干品。
[0022] 步驟4)中，所述的有機(jī)溶劑提取液為甲醇-二氯甲燒提取液，所述的甲醇-二氯甲 燒提取液由體積比1~3:1的甲醇和二氯甲燒組成。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的甲醇-二氯甲燒提取 液由體積比2:1的甲醇和二氯甲燒組成。
[0023] 所述的菌藻粉的質(zhì)量與有機(jī)溶劑提取液的體積為lg:25~60ml。進(jìn)一步優(yōu)選，所述 的菌藻粉的質(zhì)量與有機(jī)溶劑提取液的體積為Ig :40ml。
[0024] 本發(fā)明補(bǔ)菌增藻技術(shù)的機(jī)理在于:在菌藻互作的共培養(yǎng)過程中，由于采用的是小 球藻適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，共生細(xì)菌能夠促進(jìn)微藻的生長，相反，微藻可能產(chǎn)生細(xì)菌生 長抑制物質(zhì)，如綠藻素等抑制菌細(xì)胞的增殖（加 Oi 〇，et al.Nitrifying bacterial growth inhibition in the presence of algae and cyanobacteria.Biotechnology and Bioengineering，2010，107(6): 1004-1011.)，如此隨著培養(yǎng)周期的延長，菌藻培養(yǎng)液 中藻細(xì)胞呈逐漸增長趨勢(shì)，而菌細(xì)胞數(shù)量則逐漸衰減，會(huì)越來越少，最后菌藻培養(yǎng)體系中只 有極少量的菌細(xì)胞存活（Guo Z,Tong Y W.The interactions between Chlorella vulg曰ris 曰nd 曰Ig曰I symbiotic b曰cteri曰 under photo曰utotrophic 曰nd photoheterotrophic condition.Journal of Applied Phycology,2014,26(3):1483-1492.)。因此，菌對(duì)藻的增殖促進(jìn)作用在一定范圍內(nèi)隨接種菌藻比的增大而增大，而且在補(bǔ) 菌初期的增藻效果比后期更為明顯。作為優(yōu)選，本發(fā)明初始接種菌藻比為1000:1，首輪培養(yǎng) 周期為8天，補(bǔ)菌后培養(yǎng)周期為4-8天，W達(dá)到最佳技術(shù)效果。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] 本發(fā)明中，由于水稻內(nèi)生泛菌屬植物內(nèi)生菌，安全無毒，采用本發(fā)明技術(shù)獲得的水 稻內(nèi)生泛菌-小球藻的混合細(xì)胞產(chǎn)品能直接作為原料應(yīng)用于葉黃素的提取和產(chǎn)品制備，從 而達(dá)到降低小球藻制備葉黃素的工業(yè)生產(chǎn)成本。菌藻共培養(yǎng)周期結(jié)束后，離屯、收集菌藻細(xì) 胞沉淀，洗涂干燥后用于葉黃素提取制備。本發(fā)明技術(shù)操作簡單，成本低廉，具有快速增加 小球藻細(xì)胞生長量和提高葉黃素產(chǎn)率的顯著效果，W蛋白核小球藻藻種和兩輪加菌共培養(yǎng) 為例，周期分別為12和16天時(shí)，所收獲的菌藻共培養(yǎng)液中藻細(xì)胞濃度分別同比對(duì)照增加 93.97倍和103.93倍，菌藻細(xì)胞干重產(chǎn)率分別同比純?cè)迮囵B(yǎng)對(duì)照組增加65.55和72.36倍，菌 藻細(xì)胞葉黃素產(chǎn)率分別同比純?cè)迮囵B(yǎng)對(duì)照組增加68.67和75.00倍，提高幅度極為顯著。本 發(fā)明所述的方法能通過快速小球藻生長速率而達(dá)到提高小球藻的葉黃素產(chǎn)率的技術(shù)效果， 在小球藻的應(yīng)用開發(fā)方面效益顯著，前景廣闊。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清 楚、完整的描述。給出的實(shí)施例僅為了闡釋本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。W 下出現(xiàn)的百分?jǐn)?shù)，如沒有特別說明，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[002引實(shí)施例一：
[0029] 1)采用水稻內(nèi)生泛菌菌種購自中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中屯、(ACCC)，編碼為10454,菌 種按常規(guī)方法活化挑單菌落后，接種到含IOmL LB液體培養(yǎng)基的=角瓶中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)， 將擴(kuò)增培養(yǎng)16h后處于對(duì)數(shù)生長期的菌液按菌液:液體LB培養(yǎng)基體積比=1:10接種后進(jìn)行 二次擴(kuò)培，培養(yǎng)條件為37°C，200rpm恒溫?fù)u床中黑暗培養(yǎng)。連續(xù)擴(kuò)培=次，培養(yǎng)條件為37°C， 2(K)rpm恒溫?fù)u床中黑暗培養(yǎng)。第S次擴(kuò)培IOh至ODsoo = I作為菌藻共培養(yǎng)的種子細(xì)胞，根據(jù) 生長曲線，菌生長處于對(duì)數(shù)期，采用常規(guī)平板計(jì)數(shù)法測定培養(yǎng)液中的有效活菌數(shù)（CFU， Colony-Forming化its)，此時(shí)菌液濃度約為2 X 108CFU/mL。根據(jù)菌藻共培養(yǎng)所需菌細(xì)胞數(shù) 量，取適量種子菌液于室溫25 °C、800化/min離屯、IOmin，沉淀用3倍體積無菌水洗涂兩次，再 離屯、IOmin收集菌體細(xì)胞，加入與種子菌液等體積的BGll液體培養(yǎng)基懸浮備用。
[0030] 2)采用蛋白核小球藻藻種購自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫淡水藻種庫(FAOffl), 具體為，編號(hào)為FAC皿-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按1(T2，1(T3，1(T 4進(jìn)行梯度稀釋，取稀 釋藻液10化L涂布于BGl 1固體培養(yǎng)基(為BG11液體培養(yǎng)基中添加2 %瓊脂），培養(yǎng)皿置于光照 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天后，BGll培養(yǎng)基中長出深綠色的單藻落，用無菌槍頭挑取單藻落到含 IOmL BGll液體培養(yǎng)基的S角瓶中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。將擴(kuò)增培養(yǎng)7天后處于對(duì)數(shù)生長期的藻 細(xì)胞按藻液:液體BGl 1培養(yǎng)基體積比=1:10接種后進(jìn)行二次擴(kuò)培，如此共擴(kuò)培3次，每次培 養(yǎng)7天。培養(yǎng)條件為:28°C，光強(qiáng)2000LUX，光周期為12虹晝/1化r夜，每天早晚各搖動(dòng)一次。第 3次擴(kuò)增培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)用常規(guī)血球板計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中的小球藻細(xì)胞濃度為2.6 X IO7個(gè)cel 1/mL，作為小球藻種子細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0031 ] 3)同時(shí)設(shè)定菌藻共培養(yǎng)組和純?cè)迮囵B(yǎng)對(duì)照組，其中菌藻共培養(yǎng)組蛋白核小球藻種 子細(xì)胞初始接種濃度為2 X IO5個(gè)cell/mL，水稻內(nèi)生泛菌種子細(xì)胞初始接種濃度為2 X IO8CRVmL,如此菌藻細(xì)胞接種比為1000:1，混勻后進(jìn)行首輪菌藻共培養(yǎng)，菌藻共培養(yǎng)組設(shè)A 和B兩個(gè)試驗(yàn)組，每組500ml X3瓶。純?cè)迮囵B(yǎng)對(duì)照組僅接種蛋白核小球藻種子細(xì)胞，初始接 種濃度為2X IO5個(gè)cell/mL。純?cè)迮囵B(yǎng)對(duì)照組(Control)設(shè)CA和CB兩個(gè)試驗(yàn)組，每組為500ml X 3瓶，培養(yǎng)條件均為28 °C，光強(qiáng)2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天 搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻4次，培養(yǎng)周期為8天。
[0032] 4)共培養(yǎng)第9天，按菌藻共培養(yǎng)初始接種的水稻內(nèi)生泛菌細(xì)胞濃度2X 10化即/mL 補(bǔ)接種入水稻內(nèi)生泛菌種子細(xì)胞