本發(fā)明涉及新的丁酸產(chǎn)生菌以及含有它的飲食品、醫(yī)藥或者飼料組合物。
背景技術(shù)：
：乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸在下消化道中由主要來(lái)自食物的難消化性糖質(zhì)通過(guò)腸內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵而產(chǎn)生。短鏈脂肪酸不僅作為大腸粘膜上皮細(xì)胞的主要能量源被利用，還顯示多的生理作用。特別是丁酸，被認(rèn)為示出上皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用、抗炎癥作用、腸道的運(yùn)動(dòng)促進(jìn)作用等多樣的生理活性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1以及非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另外，提示了丁酸對(duì)于大腸癌、潰瘍性大腸炎的預(yù)防比較重要(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。近年來(lái)，已報(bào)告有促進(jìn)來(lái)自下消化道的消化道激素的分泌(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)、通過(guò)經(jīng)口投予而促進(jìn)末梢組織的能量消費(fèi)并抑制肥胖、并且改善胰島素抵抗性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)等。作為腸內(nèi)的丁酸濃度上升促進(jìn)劑，已知有某種的乳桿菌屬、雙歧桿菌屬的細(xì)菌(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。另外，作為產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌，已知有屬于Anaerostipes的細(xì)菌、特別是Anaerostipeshadrus(寵大真桿菌)(以下，A.hadrus)DSM3119T，丁酸產(chǎn)生菌SSC/2，丁酸產(chǎn)生菌SS2/1等(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5、非專(zhuān)利文獻(xiàn)6以及非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)平10－084909號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1：HamweHMetal.Reviewarticle:theroleofbutyrateoncolonicfunction.AlimentPharmacolTher.27:104-119(2008).非專(zhuān)利文獻(xiàn)2：RoyCCetal.Short-chainfattyacids:readyforprimetime？NutrClinPract.21:351-366(2006).非專(zhuān)利文獻(xiàn)3：ZhouJetal.PeptideYYandproglucagonmRNAexpressionpatternsandregulationinthegut.Obesity.14:683-689(2006).非專(zhuān)利文獻(xiàn)4：GaoZetal.Butyrateimprovesinsulinsensitivityandincreasesenergyexpenditureinmice.Diabetes.58:1509-1517(2009).非專(zhuān)利文獻(xiàn)5：Allen-Vercoeetal.Anaerobe18(2012)523-529非專(zhuān)利文獻(xiàn)6：AppliedandEnvironmentalMicrobilogy(2004)p5810-5817非專(zhuān)利文獻(xiàn)7：J.Bacteriology2004,186(7):2099-2106技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的課題然而，上述菌株的丁酸產(chǎn)生量不夠充分，要求丁酸產(chǎn)生能力更高的菌。因此，本發(fā)明的課題在于提供一種丁酸產(chǎn)生能力高的新的丁酸產(chǎn)生菌以及含有該菌的飲食品、醫(yī)藥或者飼料組合物。用于解決課題的方法在此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)向申請(qǐng)人保有的樣品庫(kù)中添加難消化性糖類(lèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，丁酸的產(chǎn)生量增大，進(jìn)一步作為難消化性糖類(lèi)使用L-山梨糖以及D-木糖醇培養(yǎng)上述庫(kù)并進(jìn)行篩選，將L-山梨糖作為基質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了與作為A.hadrus的基準(zhǔn)株的YIT10092T(DSM3119T)相比較，具有1.5倍以上的丁酸產(chǎn)生能力的新的丁酸產(chǎn)生菌。另外，發(fā)現(xiàn)將含有該丁酸產(chǎn)生菌和難消化性糖類(lèi)的組合物投予包括人類(lèi)的動(dòng)物時(shí)，腸內(nèi)的丁酸產(chǎn)生菌增加，在腸內(nèi)丁酸的產(chǎn)生增強(qiáng)，以致完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下的〔1〕～〔5〕?！?〕一種屬于Anaerostipeshadrus(寵大真桿菌)的丁酸產(chǎn)生菌，其中，將菌株的冷凍保存液(將菌體懸濁在10％(w/v)脫脂奶－2％谷氨酸鈉溶液中而得到的溶液)(菌數(shù)：2.0～5.5×1010cells/mL)融化，將其一部分在添加有33mM的乙酸鈉和0.5(w/v)％的葡萄糖的PY液體培養(yǎng)基(PYGA培養(yǎng)基)4mL上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，在PYGA培養(yǎng)基上將培養(yǎng)液進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液的一部分在含有33mM的乙酸鈉和0.5(w/v)％的L-山梨糖的PY培養(yǎng)基上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，對(duì)培養(yǎng)液中的丁酸濃度進(jìn)行測(cè)定時(shí)的丁酸產(chǎn)生量與作為Anaerostipeshadrus(寵大真桿菌)的基準(zhǔn)株的Anaerostipeshadrus(寵大真桿菌)YIT10092T(DSM3119T)相比較為1.5倍以上?！?〕如〔1〕中記載的丁酸產(chǎn)生菌，其為Anaerostipeshadrus(寵大真桿菌)YIT12354(NITEBP－01831)或者Anaerostipeshadrus(寵大真桿菌)YIT12355(NITEBP－01832)?！?〕一種飲食品、醫(yī)藥或者飼料組合物，其含有難消化性糖類(lèi)和〔1〕或〔2〕中記載的丁酸產(chǎn)生菌?！?〕如〔3〕中記載的組合物，其中，難消化性糖類(lèi)是選自異麥芽糖、異麥芽酮糖、D-半乳糖醇、D-木糖醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、麥芽糖醇、D-甘露糖醇、乳糖醇和半乳寡糖中的1種以上?！?〕一種丁酸產(chǎn)生增強(qiáng)劑，其中，含有〔3〕或〔4〕所記載的組合物。發(fā)明的效果將本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌與難消化性糖類(lèi)共同投予包含人類(lèi)的動(dòng)物時(shí)，腸內(nèi)的丁酸產(chǎn)生菌增加，其結(jié)果，在腸內(nèi)丁酸產(chǎn)生增強(qiáng)。若腸內(nèi)的丁酸量增加，則如上所述，基于丁酸的各種生理作用增強(qiáng)。附圖說(shuō)明圖1示出將各種難消化性糖類(lèi)添加至從上述庫(kù)中選擇的5種(A～E)樣品時(shí)的丁酸產(chǎn)生量。圖2示出基于16SrRNA基因序列進(jìn)行的分離株的系統(tǒng)解析結(jié)果。將分離株2株(YIT12354以及YIT12355)用粗字示出。系統(tǒng)樹(shù)以鄰接法制作，在自展值(Bootstrap值)為50％以上(1,000次重復(fù))的位置記載數(shù)字。比例尺表示在該座位發(fā)生了0.01次的堿基取代。圖3示出在將難消化性糖類(lèi)作為基質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丁酸產(chǎn)生菌時(shí)的丁酸產(chǎn)生量。圖4示出在將難消化性糖類(lèi)作為基質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丁酸產(chǎn)生菌時(shí)的總短鏈脂肪酸中丁酸所占的比例。圖5示出向小鼠糞便中添加難消化性糖類(lèi)以及A.hadrusYIT12355時(shí)的丁酸濃度。圖6示出向小鼠糞便中添加難消化性糖類(lèi)以及A.hadrusYIT12355時(shí)的總短鏈脂肪酸中丁酸所占的比例。圖7示出向小鼠投予難消化性糖類(lèi)以及A.hadrusYIT12355后的盲腸內(nèi)容物中的來(lái)自細(xì)菌的16SrRNA基因的DGGE圖譜。圖8示出小鼠糞便培養(yǎng)系中的麥芽糖醇以及A.hadrusYIT12355的并用效果。具體實(shí)施方式本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌屬于A.hadrus(寵大真桿菌)，是在將L-山梨糖作為基質(zhì)時(shí)的丁酸產(chǎn)生量與作為A.hadrus(寵大真桿菌)的基準(zhǔn)株的A.hadrus(寵大真桿菌)YIT10092T相比較為1.5倍以上的菌。另外，在將L-山梨糖作為基質(zhì)時(shí)的丁酸產(chǎn)生量?jī)?yōu)選為YIT10092T的1.5～2.5倍，更優(yōu)選為1.5～2.0倍，更加優(yōu)選為1.5～1.7倍。而且，本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌與A.hadrusYIT10092T不同，能夠?qū)-木糖醇作為基質(zhì)產(chǎn)生丁酸。這里，將L-山梨糖或D-木糖醇作為基質(zhì)時(shí)的丁酸產(chǎn)生量，是指在作為糖類(lèi)僅僅添加L-山梨糖或D-木糖醇的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的丁酸產(chǎn)生量。此外，培養(yǎng)基組成以及培養(yǎng)條件為適于通常的丁酸產(chǎn)生菌的培養(yǎng)的條件即可，例如，將菌株的冷凍保存液(將菌體懸濁在10％(w/v)脫脂奶－2％谷氨酸鈉溶液中而得到的溶液)(菌數(shù)：2.0～5.5×1010cells/mL)融化，將其一部分在添加有33mM的乙酸鈉和0.5(w/v)％的葡萄糖的PY(蛋白胨酵母膏，peptone－yeastextract)液體培養(yǎng)基(PYGA培養(yǎng)基)4mL上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液在PYGA培養(yǎng)基上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液的一部分在含有33mM的乙酸鈉和0.5(w/v)％的L-山梨糖或D-木糖醇的PY培養(yǎng)基上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，測(cè)定培養(yǎng)液中的丁酸濃度即可。此外，為了確認(rèn)培養(yǎng)后的菌數(shù)，優(yōu)選測(cè)定PYGA培養(yǎng)基和/或含有33mM的乙酸鈉和0.5(w/v)％的L-山梨糖或D-木糖醇的PY培養(yǎng)基中的培養(yǎng)后的渾濁度(OD660)。培養(yǎng)液中的丁酸濃度的測(cè)定只要是能夠測(cè)定丁酸濃度的方法則沒(méi)有特別限定，例如能夠通過(guò)離子排斥高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定。另外，本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌具有在不是含有多種短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基(例如含有乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸的YCFA培養(yǎng)基)而是在僅含有乙酸(或者它的鹽)作為短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中也能夠產(chǎn)生丁酸的性質(zhì)。作為本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌的具體例，可以列舉A.hadrus(寵大真桿菌)YIT12354(NITEBP－01831)(以下，YIT12354)、A.hadrus(寵大真桿菌)YIT12355(NITEBP－01832)(以下，YIT12355)。本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌通過(guò)例如向作為唯一糖源添加有難消化性糖類(lèi)的液體培養(yǎng)基中，將上述庫(kù)的一部分、從自然界收集的微生物等接種并培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液播種至平板培養(yǎng)基，將生育的菌落進(jìn)行釣菌并對(duì)丁酸產(chǎn)生能力進(jìn)行測(cè)定，從而能夠從上述庫(kù)等分離。更具體而言，向作為唯一糖源添加有難消化性糖類(lèi)的液體培養(yǎng)基中，將上述庫(kù)、從自然界收集的微生物等的稀釋液接種并培養(yǎng)，另一方面，向沒(méi)有添加難消化性糖類(lèi)的液體培養(yǎng)基中接種并培養(yǎng)。培養(yǎng)后，向作為唯一糖源添加有難消化性糖類(lèi)的瓊脂平板培養(yǎng)基中，將各個(gè)培養(yǎng)液的一部分進(jìn)行播種，觀察生育的菌落。將從添加有難消化性糖類(lèi)的液體培養(yǎng)基得到的菌落與從沒(méi)有添加難消化性糖類(lèi)的液體培養(yǎng)基得到的菌落進(jìn)行比較，對(duì)形態(tài)明顯不同的菌落進(jìn)行釣菌。將釣菌的菌株，在向PY培養(yǎng)基中添加了33mM的乙酸鈉的PYA液體培養(yǎng)基中作為唯一糖源添加有L-山梨糖等難消化性糖類(lèi)而得到的液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)液中的丁酸濃度進(jìn)行測(cè)定即可。這里，難消化性糖類(lèi)的添加濃度優(yōu)選為0.1～5.0(w/v)％，進(jìn)一步更優(yōu)選為0.2～1.0(w/v)％，更加優(yōu)選為0.4～0.6(w/v)％。另外，培養(yǎng)優(yōu)選在30～40℃進(jìn)行12～48小時(shí)的厭氧培養(yǎng)，更加優(yōu)選在37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)。本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌能夠利用廣泛種類(lèi)的糖質(zhì)，在使用其他菌難以利用的L-山梨糖、D-木糖醇等難消化性糖類(lèi)作為基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)的情況下也具有產(chǎn)生丁酸的能力。另外，如后述實(shí)施例，進(jìn)行基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)解析的結(jié)果，被分類(lèi)為A.hadrus。與基準(zhǔn)株A.hadrusYIT10092T比較生化學(xué)性狀的結(jié)果，由于酶活性和糖利用性上存在差異，因此與基準(zhǔn)株不同，鑒定為新菌株。將YIT12354以及YIT12355保藏在國(guó)家技術(shù)評(píng)估學(xué)會(huì)專(zhuān)利微生物保藏中心(郵編292－0818日本國(guó)千葉縣木更津市Kazusa(かずさ)鐮足2－5－8120號(hào)室)，各自的保藏號(hào)分別為NITEBP－01831以及NITEBP－01832，保藏日為2014年03月19日。本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌在安全性方面沒(méi)有問(wèn)題，具有將難消化性糖類(lèi)作為基質(zhì)產(chǎn)生丁酸的能力。因此，含有本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌和難消化性糖類(lèi)的組合物作為飲食品、醫(yī)藥或者飼料用組合物有用。該組合物由于在包括人類(lèi)的動(dòng)物的腸內(nèi)產(chǎn)生丁酸，所以作為丁酸產(chǎn)生增強(qiáng)劑有用。丁酸如上所述，不僅作為大腸粘膜上皮細(xì)胞的能量源而被利用，而且具有上皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用、抗炎癥作用、腸道的運(yùn)動(dòng)促進(jìn)作用，另外具有大腸癌、潰瘍性大腸炎的預(yù)防治療、能量代謝調(diào)節(jié)作用，所以本發(fā)明的組合物作為具有這些生理活性的醫(yī)藥、飲食品、飼料特別有用。作為難消化性糖類(lèi)可以列舉L-山梨糖、D-木糖、異麥芽酮糖、乳果糖、D-海藻糖等的單糖、二糖；異麥芽糖、D-半乳糖醇、D-木糖醇、D-山梨糖醇、麥芽糖醇、D-甘露糖醇、赤蘚糖醇、乳糖醇等的糖醇；半乳寡糖、低聚果糖、低聚乳果糖、異麥芽低聚糖、大豆低聚糖、黑曲霉寡糖、低聚龍膽糖、果膠低聚糖、環(huán)糊精等的低聚糖；發(fā)芽大麥；菊糖；難消化性糊精；抗性淀粉等。其中，優(yōu)選本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌能夠利用的難消化性糖類(lèi)、特別是選自異麥芽糖、異麥芽酮糖、D-半乳糖醇、D-木糖醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、麥芽糖醇、D-甘露糖醇、乳糖醇、半乳寡糖中的1種以上。本發(fā)明的組合物中，優(yōu)選將丁酸產(chǎn)生菌以活菌含有104cfu～1014cfu。另外難消化性糖類(lèi)理想為含有0.01(w/v)％～90(w/v)％，優(yōu)選含有0.05(w/v)％～50(w/v)％。本發(fā)明的組合物能夠制成適宜飲食品、醫(yī)藥或者飼料各自的形態(tài)。制成醫(yī)藥的情況下，例如，能夠與固體或者液體的醫(yī)藥用無(wú)毒性載體混合，制成慣用的醫(yī)藥品制劑的形態(tài)。作為這樣的制劑，可以列舉例如，片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等的固體制劑；溶液劑、懸濁劑、乳劑等的液體制劑；冷凍干燥制劑等。這些制劑能夠通過(guò)制劑上的慣用方法制備。作為上述的醫(yī)藥用無(wú)毒性載體，可以列舉例如，葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明膠、白蛋白、水、生理鹽水等。另外，按照需要，能夠適當(dāng)添加穩(wěn)定化劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、粘合劑，等滲劑、賦形劑等的慣用的添加劑。另外，在制成飲食品的情況下，能夠制成固體狀、液體狀等的任意的形態(tài)。制成飲食品的情況下，直接，或者與各種營(yíng)養(yǎng)成分一同含有即可。具體而言，適當(dāng)使用作為飲食品能夠使用的添加劑，通過(guò)慣用的方法成形為適于食用的形態(tài)，即，成形為顆粒狀、粒狀、片劑、膠囊、糊狀體等即可。作為飲食品的種類(lèi)，可以列舉例如，火腿、香腸等的肉加工食品；魚(yú)糕、竹輪等的水產(chǎn)加工食品；面包、點(diǎn)心、黃油、奶粉等的食品；水、果汁、牛奶、冷飲、茶飲料等的飲料。另外，作為飼料的情況下也相同。本發(fā)明的組合物在投予包括人類(lèi)的動(dòng)物的情況下，從使在腸內(nèi)產(chǎn)生丁酸的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選經(jīng)口投予，其每日的投予量以丁酸產(chǎn)生菌的活菌數(shù)計(jì)為1.0×104cfu以上，進(jìn)而更優(yōu)選為1.0×108cfu～1.0×1012cfu。實(shí)施例以下舉出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1(丁酸產(chǎn)生菌的分離)(1)通過(guò)樣品庫(kù)的培養(yǎng)的各種難消化性糖類(lèi)的丁酸產(chǎn)生促進(jìn)效果從申請(qǐng)人保有的樣品庫(kù)中選擇5種(A～E)樣品，搬入手套箱內(nèi)，將各樣品20g轉(zhuǎn)移至帶有過(guò)濾器的均質(zhì)袋PYXON－30(ELMEX公司制造)中。向其中加入各樣品的9倍量的已厭氧置換的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)進(jìn)行10倍稀釋后，使用過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾去除殘?jiān)苽淞藰悠废♂屢?。向樣品稀釋?.5mL添加發(fā)芽大麥(GBF)、L-阿拉伯糖、D-半乳糖醇、半乳寡糖、D-木糖醇、D-木糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、麥芽糖醇、D-甘露糖醇、低聚果糖的各糖類(lèi)的10(w/v)％溶液0.5mL(糖類(lèi)的最終濃度為0.5(w/v)％)，以37℃厭氧培養(yǎng)24小時(shí)。將其結(jié)果示于圖1。從圖1確認(rèn)到，如果向5種(A～E)樣品添加難消化性糖類(lèi)進(jìn)行培養(yǎng)，丁酸產(chǎn)生量增加，上述庫(kù)中存在丁酸產(chǎn)生菌。(2)YIT12354以及YIT12355的分離將上述樣品2種(C和E)搬入手套箱內(nèi)。對(duì)各樣品進(jìn)行充分的均質(zhì)化后，將一部分轉(zhuǎn)移至帶有過(guò)濾器的均質(zhì)袋PYXON－30(ELMEX公司制造)中。向其中加入各樣品的9倍量的已厭氧置換的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)進(jìn)行勻質(zhì)化，去除殘?jiān)悠废♂屢旱囊徊糠衷赑Y(表1)、添加L-山梨糖0.5(w/v)％的PY(PYS)以及添加D-木糖醇0.5(w/v)％的PY(PYX)液體培養(yǎng)基上進(jìn)行0.5％接種，在37℃厭氧培養(yǎng)了24小時(shí)。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液使用厭氧置換的PBS進(jìn)行106-7倍稀釋?zhuān)臃N在PY、PYS以及PYX瓊脂平板培養(yǎng)基上，以37℃進(jìn)行72小時(shí)厭氧培養(yǎng)。對(duì)在PYS以及PYX平板培養(yǎng)基中生育的菌落之中，與PY平板培養(yǎng)基上的菌落比較時(shí)形態(tài)不同的菌落進(jìn)行釣菌，接種在PYS以及PYX液體培養(yǎng)基中，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。從這些分離株之中，選出在培養(yǎng)液中產(chǎn)生丁酸的株。其結(jié)果，選出了分離株2株(YIT12354以及YIT12355)。[表1]PY培養(yǎng)基組成(每1L)用CO2氣體厭氧置換、pH6.9。平板培養(yǎng)基是在上述的組成中以成為1.6％的方式添加瓊脂。進(jìn)行121℃、15分鐘高壓釜滅菌?！?：鹽類(lèi)溶液I(每1L)※2：鹽類(lèi)溶液II(每1L)實(shí)施例2(YIT12354以及YIT12355的特征1)(1)丁酸產(chǎn)生量1)基于各種菌株的從L-山梨糖以及D-木糖醇的丁酸的產(chǎn)生將各菌株的冷凍保存液(將菌體懸濁在10％(w/v)脫脂奶-2％谷氨酸鈉溶液中而得到的溶液)(菌數(shù)：2.0～5.5×1010cells/mL)融化，將其一部分在添加有33mM的乙酸鈉和0.5(w/v)％的葡萄糖的PY液體培養(yǎng)基(PYGA培養(yǎng)基)4mL上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液的一部分在新的PYGA培養(yǎng)基上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)后，測(cè)定了培養(yǎng)液的渾濁度(OD660)。之后，將培養(yǎng)液一部分，向在PY培養(yǎng)基中含有0.5(w/v)％的L-山梨糖或D-木糖醇以及33mM的乙酸鈉的培養(yǎng)基(含有L-山梨糖的培養(yǎng)基：PYSA，含有D-木糖醇的培養(yǎng)基：PYXA)上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，測(cè)定了渾濁度(OD660)。對(duì)培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液中的有機(jī)酸濃度使用離子排斥HPLC進(jìn)行定量。此時(shí)，將在添加有乙酸鈉但沒(méi)有添加L-山梨糖或D-木糖醇的PY培養(yǎng)基(PYA培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的結(jié)果作為空白組。[表2](渾濁度的測(cè)定結(jié)果)在PYGA液體培養(yǎng)基中以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)后的渾濁度(OD660)在PYSA或PYXA上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)后的渾濁度(OD660)(HPLC分析條件)洗脫液：15mM高氯酸-7％乙腈pH調(diào)整劑：15mM高氯酸-60mM三羥甲基氨基甲烷-7％乙腈分離柱：有機(jī)酸分析用柱RSpakKC-811×2(昭和電工公司制造)柱溫度：42℃注入試樣量：10μL流速：1.0mL/min分析時(shí)間：35分鐘檢測(cè)器：Waters432導(dǎo)電度檢測(cè)器槽溫度：45℃此外，丁酸產(chǎn)生量依照(數(shù)1)算出。[數(shù)1]丁酸產(chǎn)生量＝(在PYSA或PYXA培養(yǎng)基中進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)時(shí)的丁酸量)—(在PYA培養(yǎng)基中進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)時(shí)的丁酸量)結(jié)果示于表3。[表3]基于各種菌株的從L-山梨糖以及D-木糖醇的丁酸產(chǎn)生量從表3可知，分離株2株的添加L-山梨糖時(shí)的丁酸產(chǎn)生量均表示為基準(zhǔn)株的1.5倍以上。另外，基準(zhǔn)株不能利用D-木糖醇來(lái)產(chǎn)生丁酸，而分離株2株在將D-木糖醇作為基質(zhì)時(shí)產(chǎn)生了丁酸。2)在加入了乙酸鹽以及乳酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)的丁酸產(chǎn)生量將在與上述1)所記載的條件相同條件下在PYGA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌液的一部分，在向含有33mM的乙酸鈉的PYA培養(yǎng)基進(jìn)一步加入40mM的乳酸鈉的培養(yǎng)基上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液中的有機(jī)酸濃度使用離子排斥HPLC進(jìn)行分析。分析條件以與上述1)相同的條件進(jìn)行。此外，丁酸產(chǎn)生量依照(數(shù)2)算出。[數(shù)2]丁酸產(chǎn)生量＝(在PYA培養(yǎng)基中添加40mM的乳酸鈉得到的培養(yǎng)基中進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)時(shí)的丁酸量)－(在不含40mM的乳酸鈉的PYA培養(yǎng)基中進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)時(shí)的丁酸量)結(jié)果示于表4。[表4]非專(zhuān)利文獻(xiàn)6中，記載有在向YCFA(33mM乙酸+9mM丙酸+1.2mM異丁酸+1.0mM異戊酸+1.0mM戊酸)培養(yǎng)基中加入35mM的乳酸鹽而得到的培養(yǎng)基中，在37℃，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)時(shí)的已知丁酸產(chǎn)生菌SS2/1以及SSC/2的丁酸產(chǎn)生量分別為12.98mM、13.49mM?？芍?，本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌具有在不是如YCFA這樣含有多種短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基、而是在僅含有乙酸(或者它的鹽)作為短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中也能夠產(chǎn)生丁酸的性質(zhì)。另外，丁酸產(chǎn)生量本身也比SS2/1以及SSC/2高。(2)基于16SrRNA基因序列的分離株的系統(tǒng)解析結(jié)果對(duì)從各菌株的培養(yǎng)液通過(guò)珠酚法提取DNA，將16SrDNA的全長(zhǎng)使用PCR擴(kuò)增后，對(duì)序列的幾乎全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序。將得到的序列供日本DNADataBank(DDBJ)的FASTA檢索，與已知菌種的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。而且，通過(guò)使用ClustalX的鄰接(NJ)法對(duì)分離株的序列進(jìn)行系統(tǒng)解析，使用Tree－View程序制作了系統(tǒng)樹(shù)。將結(jié)果示于圖2?；赮IT12354以及YIT12355的16SrRNA基因序列(大約1,450bp)進(jìn)行系統(tǒng)解析的結(jié)果，均位于梭菌簇XIVa中的Anaerostipes屬的子簇，而且與作為A.hadrus(＝寵大真桿菌)的基準(zhǔn)株的A.hadrusYIT10092T的序列分別顯示了99.7％以及99.8％的相同性。從該結(jié)果可知，YIT12354以及YIT12355均被分類(lèi)在A.hadrus中。(3)各種菌株的生化學(xué)性狀的比較各種菌株的生化學(xué)性狀檢查使用了市售的API-ZYM、RapidID32AAPI以及APIKENKI20A(SYSMEXBioMerieux(株))。檢查方法依照產(chǎn)品手冊(cè)進(jìn)行。結(jié)果示于表5。[表5]各種菌株的生化學(xué)的性狀的比較+，正反應(yīng)；-，負(fù)反應(yīng)；+w，弱反應(yīng)從表5可知，這些3菌株雖然顯示類(lèi)似的性質(zhì)，但并不是同一性質(zhì)，相互之間在菌株水平上不同。此外，3菌株均是革蘭氏陽(yáng)性的桿菌。從這些結(jié)果，YIT12354以及YIT12355判定為新的菌株，在國(guó)家技術(shù)評(píng)估學(xué)會(huì)專(zhuān)利微生物保藏中心，分別以保藏號(hào)NITEBP-01831以及NITEBP-01832保藏。實(shí)施例3(YIT12354以及YIT12355的特征2)a)難消化性糖類(lèi)作為難消化性糖類(lèi)，使用了半乳寡糖(GOS)、麥芽糖醇、D-甘露糖醇、乳糖醇、異麥芽糖、異麥芽酮糖、L-山梨糖、D-山梨糖醇。其中，除了GOS以外使用了試劑級(jí)別的制品。GOS使用了從市售的Oligomate55N(Yakult藥品工業(yè))用活性碳柱將單糖以及乳糖部分(在上消化道被消化吸收的部分)去除而得到的制品。具體而言，使用了如下得到的GOS糖液：向灌注了使用凈化水溶脹的活性碳(和光純藥公司制造)的柱中，添加使用凈化水稀釋的糖液，使用2％乙醇溶液對(duì)柱進(jìn)行清洗后，使用50％乙醇溶液將難消化性部分溶出，對(duì)溶出液進(jìn)行減壓干燥，得到GOS糖液。b)使用菌株使用了作為代表性的人類(lèi)腸內(nèi)丁酸產(chǎn)生菌的作為A.hadrus的基準(zhǔn)株的A.hadrusYIT10092T(DSM3119T)以及分離株2株。c)丁酸產(chǎn)生能力的評(píng)價(jià)將上述的菌株在添加有0.5％D-葡萄糖的含有33mM的乙酸鈉的PYA培養(yǎng)基(PYGA培養(yǎng)基)中，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。將培養(yǎng)液的一部分在含有0.5(w/v)％的各難消化性糖類(lèi)的PYA培養(yǎng)基(試驗(yàn)培養(yǎng)基)中進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)于培養(yǎng)液中的有機(jī)酸濃度通過(guò)離子排斥HPLC進(jìn)行了分析。分析條件以與上述實(shí)施例2相同的條件進(jìn)行。對(duì)有機(jī)酸濃度進(jìn)行定量后，將從各難消化性糖類(lèi)的丁酸產(chǎn)生量以及總短鏈脂肪酸中丁酸所占的比例依照以下的式算出。[數(shù)3]·(丁酸產(chǎn)生量)＝(培養(yǎng)后的試驗(yàn)培養(yǎng)基中的丁酸量)—(培養(yǎng)后的不含各種難消化性糖類(lèi)的PYA培養(yǎng)基中的丁酸量)·(丁酸的比例)＝(培養(yǎng)后的試驗(yàn)培養(yǎng)基中的丁酸量)/(培養(yǎng)后的試驗(yàn)培養(yǎng)基中的(乙酸量+丙酸量+丁酸量))×100將結(jié)果示于圖3以及圖4。從圖3以及圖4可知，YIT12354以及YIT12355與基準(zhǔn)株YIT10092T相比較，能夠利用多的難消化性糖類(lèi)，并且，丁酸產(chǎn)生量也多。另外，分離株2株的L-山梨糖添加時(shí)的丁酸產(chǎn)生量均顯示為基準(zhǔn)株的1.5倍以上。而且，可知總短鏈脂肪酸中丁酸所占的比例也與基準(zhǔn)株YIT10092T相比較，丁酸的比例高。實(shí)施例4(向小鼠糞便中添加各難消化性糖類(lèi)以及YIT12355時(shí)的丁酸以及相對(duì)于總短鏈脂肪酸的丁酸的比例)將小鼠的糞便0.8g使用PBS進(jìn)行12.5倍稀釋?zhuān)砑痈鞣N難消化性糖類(lèi)(乳糖醇、麥芽糖醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、D-木糖醇)0.5％、以及1.0％的在PYGA培養(yǎng)基上進(jìn)行了前培養(yǎng)的YIT12355后，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。另外，沒(méi)有添加各種難消化性糖類(lèi)的培養(yǎng)基也同樣地進(jìn)行了培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)培養(yǎng)液中的有機(jī)酸濃度通過(guò)離子排斥HPLC進(jìn)行了分析。分析條件以與上述實(shí)施例2相同的條件進(jìn)行。對(duì)有機(jī)酸濃度進(jìn)行定量后，依照與(數(shù)3)相同的式算出丁酸產(chǎn)生量和丁酸的比例。其結(jié)果示于圖5以及圖6。如圖5以及圖6所示，與難消化性糖類(lèi)的單獨(dú)添加時(shí)以及本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌單獨(dú)添加時(shí)相比，通過(guò)將丁酸產(chǎn)生菌與難消化性糖類(lèi)組合，丁酸產(chǎn)生被大大促進(jìn)。另外，丁酸相對(duì)于總短鏈脂肪酸的比例也同樣地，與難消化性糖類(lèi)的單獨(dú)添加時(shí)以及本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌的單獨(dú)添加時(shí)相比，通過(guò)將這些進(jìn)行組合而被大大提高。實(shí)施例5(對(duì)于攝取了難消化性糖類(lèi)的小鼠的YIT12355的反復(fù)經(jīng)口投予試驗(yàn))1)試驗(yàn)設(shè)計(jì)整體的試驗(yàn)日程示于表6。小鼠在經(jīng)過(guò)1周的F2飼料(FunabashiFarm公司制造)馴化飼養(yǎng)后，使各組的平均體重幾乎相等的方式分成6組。之后，投予1周的對(duì)照飼料(表7)，切換至含有難消化性材料的精制飼料投予2周。將YIT12355的活菌懸濁液以2次/周，總計(jì)4次使用經(jīng)口探針投予。在試驗(yàn)最后日進(jìn)行解剖，回收盲腸以及結(jié)腸內(nèi)容物并調(diào)查有機(jī)酸濃度。另外，對(duì)腸道內(nèi)容物中的YIT12355的菌數(shù)通過(guò)定量PCR法進(jìn)行測(cè)定，并且對(duì)腸內(nèi)菌群整體的變化使用PCR－DGGE(變性梯度毛細(xì)管電泳，DenaturingGradientGelElectrophoresis)法進(jìn)行了調(diào)查。＜試驗(yàn)系統(tǒng)＞使用動(dòng)物：小鼠C57BL/6J(4周齡：日本CLEA)試驗(yàn)期間：3周使用的難消化性糖類(lèi)：乳糖醇、麥芽糖醇難消化性糖類(lèi)的投予量：5％(w/w)投予菌株：YIT12355菌投予量：活菌投予量3.9～6.9×108cfu/小鼠(生理鹽水懸濁液的探針投予)。以包含死菌的總菌數(shù)計(jì)為3.6～4.6×109cfu/小鼠。組構(gòu)成：6組(5只/組)－/－組，對(duì)照AH/－組，YIT12355單獨(dú)投予－/LAC組，乳糖醇單獨(dú)投予－/MAL組，麥芽糖醇單獨(dú)投予AH/LAC組，YIT12355和乳糖醇共同投予AH/MAL組，YIT12355和麥芽糖醇共同投予飼料組成：以AIN－93G為基底的精制飼料(表7)測(cè)定項(xiàng)目：盲腸內(nèi)菌群解析(使用定量PCR法的投予菌的菌數(shù)測(cè)定、使用DAPI計(jì)數(shù)法的總菌數(shù)測(cè)定、使用PCR－DGGE法的菌群變化觀察)[表6][表7]飼料組合物2)投予菌(YIT12355)的制備以及菌數(shù)測(cè)定YIT12355是通過(guò)在PYGA培養(yǎng)基以37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，將離心沉淀物懸濁在10％脫脂奶－2％谷氨酸鈉溶液中，將在－80℃冷凍得到的產(chǎn)物的作為冷凍保存品。YIT12355的投予菌液的制備使用該冷凍保存品如下進(jìn)行。將YIT12355的冷凍保存品液融化，在4mL的PYGA培養(yǎng)基上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。將培養(yǎng)液的一部分在相同組成的培養(yǎng)基56mL上進(jìn)行1％接種，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。將菌液在4℃、以10,000rpm進(jìn)行10分鐘的離心后，去除上清液。加入預(yù)先厭氧置換過(guò)的冷生理鹽水30mL將沉淀物再懸濁，進(jìn)行離心后去除上清液。將沉淀物用6mL的冷生理鹽水再懸濁后作為投予菌液。此外，菌體的懸濁在手套箱內(nèi)進(jìn)行。將菌液用厭氧置換的生理鹽水進(jìn)行階段稀釋?zhuān)赑YGA平板培養(yǎng)基上播種后，以37℃進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)后，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)算出活菌數(shù)?？偩鷶?shù)通過(guò)將菌液的一部分使用4％多聚甲醛/PBS溶液固定后，通過(guò)DAPI計(jì)數(shù)法測(cè)定。3)腸道內(nèi)容物的采集在投予試驗(yàn)飼料的第二周使用二乙醚將小鼠麻醉，通過(guò)頸椎脫臼使其安樂(lè)死。開(kāi)腹并摘取盲腸組織以及結(jié)腸組織，回收內(nèi)容物。盲腸以及結(jié)腸內(nèi)容物使用PBS進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)怨┨崛NA。4)腸道內(nèi)容物中的菌群解析a)使用定量PCR法的YIT12355的菌數(shù)測(cè)定從腸道內(nèi)容物的10倍稀釋液中通過(guò)珠酚法提取DNA。即，向腸道內(nèi)容物的稀釋液200μL中加入0.3g的玻璃珠(直徑0.1mm)和300μL的Tris－SDS溶液(將250mL的200mMTris－HCl80mMEDTApH9.0與50mL的10％SDS混合而得到的溶液)、以及500μL的TE飽和苯酚，使用FastPrepFP120(力量級(jí)別5.0)進(jìn)行30秒鐘劇烈的振蕩。以15,000rpm進(jìn)行5分鐘離心后，向400μL的上清液中加入苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)溶液400μL，使用FastPrepFP120(力量級(jí)別4.0)進(jìn)行45秒鐘振蕩。以15,000rpm進(jìn)行5分鐘離心后，向上清液250μL中加入25μL的3M乙酸鈉(pH5.4)以及250μL的異丙醇進(jìn)行混合。以15,000rpm進(jìn)行5分鐘離心后，去除上清液，加入500μL的70％乙醇再次以15,000rpm進(jìn)行5分鐘離心。去除上清液，將沉淀物干燥，溶解于1.0mL的TE緩沖液。將得到的DNA溶液使用凈化水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)鳛槟０錎NA溶液。定量PCR使用7500Real－TimePCRSystem(LifeTechnologies公司制造)進(jìn)行。反應(yīng)液的總量為20μL，將含有1.0μM的各引物的SYBRPremixExTaqII(TakaraBio(株))與模板DNA溶液混合后，供以進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)條件設(shè)為，以95℃加熱2分鐘后，將以95℃進(jìn)行20秒鐘、以55℃進(jìn)行20秒鐘、以72℃進(jìn)行50秒鐘的反應(yīng)作為一個(gè)循環(huán)，將該循環(huán)重復(fù)40個(gè)循環(huán)，并以72℃反應(yīng)3分鐘。進(jìn)一步，接續(xù)地為了進(jìn)行Tm值解析，以60℃反應(yīng)1分鐘后，以0.2℃/秒的溫度梯度升溫至95℃，測(cè)定此時(shí)的SYBRGreenI的熒光來(lái)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的2根鏈解離時(shí)的溫度(Tm)。將定量PCR中使用的A.hadrus特異性引物的序列示于表8。此外，A.hadrus的定量所使用的校正曲線利用從調(diào)制為一定菌數(shù)的A.hadrusYIT12355的菌體中提取的DNA作為模板而制作。[表8]定量PCR所使用的A.hadrus特異性引物b)相對(duì)于腸內(nèi)的總菌數(shù)的YIT12355的占有率的測(cè)定將腸道內(nèi)容物的10倍稀釋液的一部分使用4％多聚甲醛/PBS溶液固定后，使用DAPI計(jì)數(shù)法測(cè)定了總菌數(shù)。上述的YIT12355的菌數(shù)除以總菌數(shù)算出占有率(％)。[數(shù)4](YIT12355的占有率)(％)＝(YIT12355的菌數(shù)/總菌數(shù))×100c)使用PCR－DGGE法的盲腸內(nèi)容物中的菌群解析將在上述4)－a中提取的DNA按組匯集，將此作為模板通過(guò)賦予了GC封條的引物(表9)將細(xì)菌的16SrRNA基因片段(包含V3、V4區(qū)域)通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件是在50μL的反應(yīng)液中以5μL的10×ExTaqBuffer、1μL的BSA(20mg/mL)溶液、2μL的2.5mMdNTP、1μL的25pmol/μL引物溶液、1.25units的ExTaqpolymeraseHS(TakaraBio公司)、0.1ng模板(template)DNA進(jìn)行的。溫度條件以94℃5分鐘、(94℃20秒、55℃45秒、72℃1分鐘)×30循環(huán)、72℃7分鐘進(jìn)行。將擴(kuò)增產(chǎn)物使用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN公司制造)純化后，以每1well中200ng的方式將DNA加到凝膠中。使用通過(guò)GradientFormer(Bio-Rad公司)實(shí)施了35-50％的變性劑的濃度梯度(此處的100％變性劑是指7M的脲與40％甲酰胺的混合物)的8％丙烯酰胺凝膠(8％丙烯酰胺/Bis(37∶5∶1)、1×TAE(pH8.0)、0.1％TEMED、0.1％過(guò)硫酸銨)以60℃、130V進(jìn)行5分鐘的電泳后，以70V進(jìn)行16小時(shí)的電泳。電泳后，使用GelRed(Biotium公司)進(jìn)行染色，在UV燈下進(jìn)行了帶的確認(rèn)拍攝。此外，為了特定來(lái)自A.hadrusYIT12355的帶，將從本菌株的純培養(yǎng)菌體提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR，作為電泳樣品。[表9]PCR-DGGE所使用的引物引物序列(5’-3’)GC-341FGCclamp*-CCTACGGGAGGCAGCAG(序列號(hào)3)800RGGACTACCAGGGTATCTAAT(序列號(hào)4)*GCclamp＝CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG(序列號(hào)5)將腸內(nèi)的總菌數(shù)以及YIT12355的菌數(shù)、以及YIT12355的占有率的測(cè)定結(jié)果示于表10，將使用PCR-DGGE法的盲腸內(nèi)容物中的菌群解析結(jié)果示于圖7。[表10]ND；＜定量下限值6.0log10(cells/g內(nèi)容物)通過(guò)表10可知，僅投予YIT12355，或者僅投予難消化性糖類(lèi)時(shí)，腸內(nèi)的A.hadrus的菌數(shù)以及占有率均沒(méi)有大的變化，但通過(guò)將本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌與難消化性糖類(lèi)組合投予，會(huì)使A.hadrus的菌數(shù)以及占有率大幅上升。另外，根據(jù)圖7，在AH/LAC組以及AH/MAL組中，來(lái)自YIT12355的帶(圖7的圈部分)增加，因此，通過(guò)將本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌與難消化性糖類(lèi)組合投予，在觀察腸內(nèi)的菌群整體的變化時(shí)，也能夠確認(rèn)本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌有特異性增加。實(shí)施例6(向攝取了難消化性糖類(lèi)的小鼠的YIT12355的單次經(jīng)口投予試驗(yàn))1)試驗(yàn)設(shè)計(jì)表11中示出組構(gòu)成和試驗(yàn)日程。小鼠是在1周的F2飼料馴化飼養(yǎng)后，以使各組的平均體重幾乎相等的方式分成4組。投予對(duì)照飼料(表12)1周后，對(duì)于對(duì)照組(－/－組)以及AH/－組投予2周的對(duì)照飼料，對(duì)于－/MAL組以及AH/MAL組投予2周的含有麥芽糖醇的精制飼料(MAL含有飼料)。YIT12355的活菌懸濁液是在投予1周的對(duì)照飼料后單次探針投予的。在試驗(yàn)最后日進(jìn)行解剖，回收了盲腸內(nèi)容物。盲腸內(nèi)容物供以進(jìn)行YIT12355的菌數(shù)測(cè)定。＜試驗(yàn)系＞試驗(yàn)材料：麥芽糖醇(5％混合飼料投予)投予菌株：YIT12355動(dòng)物種：小鼠C57BL/6J(4周齡：日本CLEA)組構(gòu)成：7只×4組－/－組，對(duì)照AH/－組，YIT12355單獨(dú)投予－/MAL組，麥芽糖醇單獨(dú)投予AH/MAL組，YIT12355和麥芽糖醇共同投予(參照表11)試驗(yàn)期間：3周(對(duì)照飼料1周+MAL含有飼料或?qū)φ诊暳?周)菌投予法：活菌的生理鹽水懸濁液的單次探針投予飼料組成：以AIN－93G作為基底的精制固體飼料(表12)測(cè)定項(xiàng)目：盲腸內(nèi)菌群(投予菌的菌數(shù)以及占有率)[表11][表12]飼料組成2)投予菌(YIT12355)的制備以及菌數(shù)測(cè)定作為投予菌的YIT12355的活菌懸濁液與上述實(shí)施例5、2)同樣地進(jìn)行。3)YIT12355的投予將在上述2)制備的菌液(活菌數(shù)3.1×109cfu/mL，總菌數(shù)1.9×1010cells/mL)通過(guò)單次經(jīng)口探針向小鼠投予0.2mL(活菌數(shù)6.2×108cfu/小鼠，總菌數(shù)3.8×109cells/小鼠)。對(duì)照組以及－/MAL組中作為菌液的替代投予了0.2mL的生理鹽水。4)標(biāo)本采集在試驗(yàn)開(kāi)始第3周(菌液的探針投予第二周)，在Somnopentyl麻醉下進(jìn)行開(kāi)腹從下腔靜脈進(jìn)行全采血，使其安樂(lè)死。之后，回收盲腸內(nèi)容物。盲腸內(nèi)容物使用PBS進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)┮蕴崛NA。5)盲腸內(nèi)容物中的YIT12355的菌數(shù)測(cè)定5)－1使用定量PCR法的YIT12355的菌數(shù)測(cè)定從腸道內(nèi)容物的10倍稀釋液中通過(guò)上述實(shí)施例5、4)a)所記載的珠酚法提取DNA。將得到的DNA作為模板，通過(guò)上述實(shí)施例5、4)a)所記載的使用菌種特異性引物的定量PCR法對(duì)YIT12355的菌數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。5)－2相對(duì)于腸內(nèi)的總菌數(shù)的YIT12355的占有率的測(cè)定將腸道內(nèi)容物的10倍稀釋液的一部分使用4％多聚甲醛/PBS溶液固定后，使用DAPI計(jì)數(shù)法對(duì)總菌數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。上述的YIT12355的菌數(shù)除以總菌數(shù)算出占有率(％)。[數(shù)5](YIT12355的占有率)(％)＝(YIT12355的菌數(shù)/總菌數(shù))×100將腸內(nèi)的總菌數(shù)以及YIT12355的菌數(shù)以及YIT12355的占有率的測(cè)定結(jié)果示于表13。從表13可知，即使進(jìn)行單次投予的情況下也與反復(fù)投予同樣地，僅通過(guò)AH，或者僅通過(guò)難消化性糖類(lèi)，菌數(shù)、占有率沒(méi)有大的變化，但通過(guò)將本發(fā)明的丁酸產(chǎn)生菌與難消化性糖類(lèi)組合投予，菌數(shù)、占有率大幅上升。[表13]盲腸內(nèi)的A.hadrusYIT12355菌數(shù)以及在總菌數(shù)中所占的比例實(shí)施例7(關(guān)于YIT12355的菌數(shù)增加與丁酸濃度的對(duì)應(yīng)的試驗(yàn))采集實(shí)施例6的單次投予試驗(yàn)中的從試驗(yàn)開(kāi)始1周后的小鼠新鮮糞便0.8g至樣品管中，在保持低溫·厭氧狀態(tài)下搬入手套箱內(nèi)。使用預(yù)先厭氧置換過(guò)的PBS進(jìn)行稀釋(最終12.5倍稀釋)，添加麥芽糖醇溶液(最終濃度為0.5％)和/或YIT12355的培養(yǎng)菌液(1％接種)后，以37℃進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)后的丁酸濃度利用使用了導(dǎo)電度檢測(cè)器的離子排斥HPLC進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果示于圖8。在體外，如果將本發(fā)明丁酸產(chǎn)生菌與難消化性糖類(lèi)一同使用，則菌數(shù)增加，并且丁酸濃度增加。根據(jù)實(shí)施例5～7的結(jié)果，單獨(dú)添加難消化性糖類(lèi)時(shí)YIT12355的菌數(shù)小于106cells/mL，丁酸濃度也沒(méi)有增加。另一方面，單獨(dú)添加YIT12355時(shí)，A.hadrus的菌數(shù)增加，與此相伴地，丁酸濃度也增加。而且，如果將難消化性糖類(lèi)與YIT12355組合，A.hadrus的菌數(shù)比與單獨(dú)添加YIT12355時(shí)相比增加了100倍左右，伴隨菌數(shù)的增加，丁酸濃度也上升。由此可知，如果將本發(fā)明丁酸產(chǎn)生菌與難消化性糖類(lèi)一同使用，則菌數(shù)增加，并且丁酸濃度也增加。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3