一種能提高蛹蟲草感染寄主昆蟲能力的蛹蟲草工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能提高蛹蟲草感染寄主昆蟲能力的蛹蟲草工程菌。它其是轉(zhuǎn)有冬蟲夏草絲氨酸水解酶基因csp1或csp2，并能表達(dá)絲氨酸水解酶Csp1或Csp2的蛹蟲草，所述的絲氨酸水解酶基因csp1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述的絲氨酸水解酶基因csp2，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。轉(zhuǎn)外源絲氨酸水解酶基因確實提高了蛹蟲草感染大蠟螟的能力，本發(fā)明為提高蛹蟲草侵染昆蟲能力提供技術(shù)參考。
【專利說明】一種能提高蛹蟲草感染寄主昆蟲能力的蛹蟲草工程菌

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能提高蛹蟲草感染寄主昆 蟲能力的蛹蟲草工程菌。

【背景技術(shù)】：
[0002] 昆蟲致病真菌的絲氨酸蛋白水解酶一般都有降解昆蟲表皮的功能（Joshi et al.，1995)，它是一類具有相同催化機制的蛋白酶家族，作用于大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使 之成為小分子蛋白質(zhì)。絲氨酸蛋白水解酶催化激活是通過活性中心一組氨基酸殘基變化 實現(xiàn)的。在酵母體系中表達(dá)的蛋白酶具有一定的翻譯后加工能力，使收獲的外源蛋白有一 定程度上的折疊加工和糖基化修飾，因此酵母體系表達(dá)的蛋白有一定的功能（王世華等， 2007)。來源于冬蟲夏草的cspl和csp2基因是兩個絲氨酸蛋白酶，可以水解昆蟲角質(zhì)層， 屬于蛋白酶S8A亞家族成員；研究表明在酵母細(xì)胞中表達(dá)的冬蟲夏草絲氨酸蛋白酶有降解 昆蟲體壁的能力（Zhang et al·，2008b)。
[0003] 蛹蟲草感染昆蟲的能力是評價蛹蟲草性狀的一個重要指標(biāo)。提高真菌感染寄主 能力的研究常見于生物防治真菌如白僵菌、綠僵菌中，主要是通過轉(zhuǎn)一個相關(guān)基因到真菌 細(xì)胞中以提商其感染寄主昆蟲能力。例如轉(zhuǎn)Bt毒力基因、絲氣酸蛋白類基因、凝集素基因 (Callaghan et al.，2005 ;Lu et al.，2008 ;Fang et al.，2010)等有利于真菌加速入侵昆 蟲體壁。本研究通過ATMT方法整合冬蟲夏草的絲氨酸水解酶基因到蛹蟲草基因組DNA中， 以期提高蛹蟲草JM4菌株侵染大蠟螟的能力。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種能提高蛹蟲草感染寄主昆蟲能力的蛹蟲草工程菌。
[0005] 本發(fā)明的能提高蛹蟲草感染寄主昆蟲能力的蛹蟲草工程菌，是轉(zhuǎn)有冬蟲夏草絲氨 酸水解酶基因 cspl或csp2,并能表達(dá)絲氨酸水解酶Cspl或Csp2的蛹蟲草，所述的絲氨酸 水解酶基因 cspl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的絲氨酸水解酶基因 csp2,其核 苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0006] 本研究利用ATMT方法構(gòu)建了轉(zhuǎn)冬蟲夏草絲氨酸水解酶基因（cspl，csp2以及兩者 融合的基因 c0c2)蛹蟲草JM4,獲得的突變子可通過綠色熒光鑒定。通過RT-PCR、Southern blot、Western bolt和子實體培養(yǎng)等方法篩選到一批生長特征正常的突變子，進行大錯螟 末齡幼蟲感染實驗。大錯螟末齡幼蟲感染實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)cspl、csp2、c0c2的突變菌株對錯螟 末齡幼蟲的致死能力顯著提高，但是c〇c2(融合cspl和csp2兩個基因）蛹蟲草突變菌株 的昆蟲感染能力并沒有比單個基因（cspl或csp2)的突變菌株高。
[0007] 總之，轉(zhuǎn)外源絲氨酸水解酶基因確實提高了蛹蟲草感染大蠟螟的能力，本發(fā)明為 提1?蛹蟲草侵染昆蟲能力提供技術(shù)參考。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0008] 圖 1 是 pKHt-gfp 載體圖；
[0009] 圖 2 是擴增 cspl、csp2、c0c2 基因片段；M :DL2000DNA Markerl :空白對照；2-5 : 分別是cspl、csp2、c0和c2的PCR產(chǎn)物；6-7 :PCR融合產(chǎn)物c0c2圖3是大腸桿菌DH5 α / pKgc0c2 的菌落 PCR 鑒定，M :DL2000DNA Marker ;1-6 :以 cspl-F 和 csp2-R 引物對擴增 pKgc0c2菌落的PCR產(chǎn)物；
[0010] 圖 4 是大腸桿菌 DH5 a /pKgcspl 和 pKgcsp2 的菌落 PCR 鑒定，M :DL2000DNA Marker ;1_6 :以cspl引物擴增pKgcspl菌落的PCR產(chǎn)物，7-12 :以csp2引物擴增pKgcsp2 菌落的PCR產(chǎn)物
[0011] 圖 5 是 pKgcspl 和 pKgcsp2 質(zhì)粒的 Hind III和 kpn I 雙酶切鑒定，M :Wide Range DNA Marker (100-6000bp)，1-3 :pKgcspl 質(zhì)粒的 Hind III和 Κρη I 雙酶切結(jié)果，4-6 :pKgcsp2 質(zhì)粒的Hind III和Kpn I雙酶切結(jié)果；
[0012] 圖 6 是 pKgc0c2 質(zhì)粒的 Hind III和 Kpn I 雙酶切鑒定，Μ : λ-Hind III digest DNA Marker ; 1-3 :pKgc0c2 質(zhì)粒的 Hind III和 Kpn I 雙酶切結(jié)果；
[0013] 圖7是野生型蛹蟲草JIM及幾個突變子的總RNA，M :DL2000DNA Marker，1-11 :野 生型JM4及幾個突變子的總RNA ;
[0014] 圖8是3種蛹蟲草轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定，M :DL2000DNA Marker，l-4 :PCR擴增pKg突 變子中l(wèi)ac-gfp基因，5-11 :PCR擴增pKgcspl突變子中cspl基因12-16 :PCR擴增pKgcsp2 突變子中csp2基因；
[0015] 圖9是蛹蟲草pKgc0c2轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定，M :DL2000DNA Marker，1、6 :分別擴增 野生型JM4的cspl和csp2基因的PCR產(chǎn)物，2-5 :擴增pKgc0c2突變子中cspl基因的PCR 產(chǎn)物；7-10 :擴增pKgc0c2突變子中csp2基因的PCR產(chǎn)物；
[0016] 圖10是蛹蟲草突變子的綠色熒光檢測，CK:野生型JM4, Al-A3:pKg突變子， B1-B3 :pKgcspl 突變子，C1-C3 :pKgcsp2 突變子，D1-D3 :pKgc0c2 突變子；
[0017] 圖11是轉(zhuǎn)絲氨酸水解酶基因的蛹蟲草子實體，CK :野生型JM4子實體A，B :轉(zhuǎn)絲氨 酸水解酶基因突變子的子實體；
[0018] 圖 12 是蛹蟲草 JM4 基因組 DNA 提取，M. : λ-Hind III digest DNA marker，1 :野 生型JM4基因組DNA，2-4.轉(zhuǎn)絲氨酸水解基因的蛹蟲草突變子基因組DNA;圖13是3個基 因的 PCR 純化產(chǎn)物，M :DL2000DNA Marker，1 :gfp PCR 純化產(chǎn)物，2 :csplPCR 純化產(chǎn)物，3 : csp2PCR純化產(chǎn)物；
[0019] 圖14是探針靈敏性鑒定，1 :gfp探針，2 :cspl探針，3 :csp2探針；
[0020] 圖15是蛹蟲草轉(zhuǎn)化子的southern blot鑒定（Hind III消化）；探針：DIG-標(biāo)記的 gfp 片段；M :DNA Molecular-Weight Marker II DIG-LabeldeO. 12-23. 1Kb ;C :JM4 基因組 DNA 酶切產(chǎn)物；Cl :pMD-19+gfp+gpd 片段；C2 :pMD-19+gfp+cspl 片段，C3 :pMD-19+gfp+csp2 片段；1-3 :三個pKg轉(zhuǎn)化子的基因組DNA酶切產(chǎn)物；4-6 :三個pKgcspl轉(zhuǎn)化子的基因組DNA 酶切產(chǎn)物；7-9 :三個pKgcsp2轉(zhuǎn)化子的基因組DNA酶切產(chǎn)物；10-12 :三個pKgc0c2轉(zhuǎn)化子 的基因組DNA酶切產(chǎn)物。
[0021] 圖16是Tail-PCR擴增部分轉(zhuǎn)化子的側(cè)翼序列；M :DL2000DNA Markerl-3:不同轉(zhuǎn) 化子的第一、二、三輪Tail-PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0022] 圖 17是pET-28a_cspl 和pET-28a_scsp2重組質(zhì)粒的酶切鑒定；M :Wide Range DNA Marker(100-6000bp);l-2:pET-28a-cspl重組質(zhì)粒Hindm和BamHI的酶切結(jié)果 ；3-4: pET_28a_scsp2重組質(zhì)粒Hind III和BamH I的酶切結(jié)果；
[0023] 圖 18 是 Cspl 和 Scsp2 蛋白的原核表達(dá)；M :Prestained Protein Ladder ;1, 3 :未誘導(dǎo)和已誘導(dǎo)的Transetta(DE3)/pET_28a_scsp2重組菌；2,4 :未誘導(dǎo)和已誘導(dǎo)的 Transetta(DE3)/pET-28a_cspl 重組菌；
[0024] 圖 19 是純化的 Cspl 和 Scsp2 蛋白濃度分析；M :Prestained Protein Ladder ; 1- 3 :分別是 1 μ g，2 μ g，3 μ g 的 BSA ;4-6 :分別是 0. 5 μ L，1 μ L，2 μ L 的 Cspl 蛋白；7-9 :分 別是 0· 5 μ L，1 μ L，2 μ L 的 Scsp2 蛋白；
[0025] 圖20是蛹蟲草轉(zhuǎn)化子的全蛋白；M :Prestained Protein Ladderl :野生型JM4 ; 2- 4 :pKg 轉(zhuǎn)化子的 2、34、35 號 5-7 :pKgcspl 轉(zhuǎn)化子的 10、31、41 號；8-10 :pKgcsp2 轉(zhuǎn)化子 的 18、29、33 號 11-13 :pKgc0c2 轉(zhuǎn)化子的 3、17、21 號；
[0026] 圖 21 是 Western blot 檢測突變子中 Cspl 蛋白的表達(dá)；M :Prestained Protein Ladder C :陽性對照；1 :野生型 JM42 :pKg轉(zhuǎn)化子；3-5 :pKgcspl 轉(zhuǎn)化子（10、31、41 號）6-8 : pKgc0c2 轉(zhuǎn)化子（3、17、21 號）；
[0027] 圖 22 是 Western blot 檢測突變子中 Csp2 蛋白的表達(dá)；M :Prestained Protein Ladder C :陽性對照；1 :野生型 JM42 :pKg轉(zhuǎn)化子；3-5 :pKgcsp2轉(zhuǎn)化子（18、29、33 號）6-8 : pKgc0c2 轉(zhuǎn)化子（3、17、21 號）；
[0028] 圖23是不同濃度的轉(zhuǎn)絲氨酸水解酶基因蛹蟲草分生孢子感染大蠟螟幼蟲的7天 死亡率，CK :無菌水；JM4 :野生型蛹蟲草；
[0029] 圖24是不同濃度的轉(zhuǎn)絲氨酸水解酶基因蛹蟲草分生孢子感染大蠟螟幼蟲的14天 死亡率，CK :無菌水；JM4 :野生型蛹蟲草；
[0030] 圖25是不同濃度的轉(zhuǎn)絲氨酸水解酶基因蛹蟲草分生孢子感染大蠟螟幼蟲的21天 死亡率，CK :無菌水；JM4 :野生型蛹蟲草。

【具體實施方式】：
[0031] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0032] 實施例1 :
[0033] 3. 3實驗方法
[0034] 3. 3. 1轉(zhuǎn)菌絲cspl、csp2、c0c2基因的JM4突變子庫構(gòu)建
[0035] 3. 3. 1. lpKgcspl、pKgcsp2、pKgc0c2 的載體構(gòu)建
[0036] 以適合于真菌ATMT法的載體pKHt-gfp (簡稱pKg)為基礎(chǔ)，進行絲氨酸水解酶基 因的質(zhì)粒構(gòu)建。pKHt-gfp載體的邊界內(nèi)從右到左包括如下元件：gpd啟動子、MCS多克隆位 點、trpC終止子、cam抗性基因、ori復(fù)制子、hyg潮霉素抗性基因和gfp綠色突光蛋白基 因，其中hph+ptrpC命名為phyg。所有絲氨酸水解酶基因都是插入到MCS(限制性內(nèi)切酶 Xba I -Κρη I )中，形成相應(yīng)的載體。
[0037] 具體構(gòu)建方法為：
[0038] 以pKHt載體為基本骨架進行改造，載體是kana抗性（Mullins et al.，2001)。
[0039] pKHt-gfp 載體：
[0040] 1、EcoR I單酶切pKHt載體，Qiangen公司的DNA回收試劑盒回收純化并經(jīng) CIAP(TaKaRa)處理以防載體自連。經(jīng)相同EcoR I單酶切的lacZ+gfp片段，回收純化。
[0041] 2、處理過的pKHt載體0· 5 μ L和lacZ+gfp片段1 μ L連接，加入2X ligase buffer (promega) 2 μ L，最后補水 0· 5 μ L，16°C連接反應(yīng) 2 小時。
[0042] 3、將4μ L連接產(chǎn)物與50μ L的E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴30min。 42°C水浴熱激動反應(yīng)45s，然后冰上放置3min。加入LB培養(yǎng)基500 μ L，在37°C下250rpm 震搖45min。
[0043] 4、取200μ L的LB培養(yǎng)基細(xì)菌液，涂布kana抗性LB培養(yǎng)板上，在37°C下培養(yǎng) 16-20小時。黑暗下挑取呈綠色的陽性單克隆，提取質(zhì)粒，進行測序分析。正確的克隆載體 命名為pKHtl。
[0044] 5、以 Expression vector (PAN2-4) DNA, 5760bp (GenBank: Z32750. 1)質(zhì)粒為模板， trpC 引物（pst I kpn I -trpC-F:
[0045] GGGCTGCAGGGTACCGATCCACTTAACGTTACTGAAAT ；pst I -trpC - R ：GGGCTGCAGACTAG AAAGAAGGATTACCTCTA)，Pfu DNA polymerase、dNTP 和 PCR 反應(yīng)液，擴增獲得 trpC(729bp)。 pst I單酶切pKHtl載體，Qiangen公司的DNA回收試劑盒回收純化并經(jīng)CIAP(TaKaRa)處 理以防載體自連。經(jīng)相同pst I單酶切的trpC片段，回收純化，再與pst I單酶切pKHtl 載體連接，然后轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中?？寺『蜋z測按3、4步驟進行。在pKHtl 插入trpC并且在上游帶入一個kpn I的酶切位點。trpC的正確插入方向是kpn I位點靠 近pKHt載體右邊界。正確的質(zhì)粒命名為pKHt2。
[0046] 6、以 Expression vector(PAN2-4)DNA, 5760bp (GenBank:Z32750. 1)質(zhì)粒為 模板，gpd 弓丨物（Hind III -gpd-F ：GGGAAGCTTCAATTCCCTTGTATCTCTACAC ；Xba I -gpd-R ： GGGTCTAGAGGTGATGTCTGCTCAAGCG), Pfu DNA polymerase、dNTP 和 PCR 反應(yīng)液，擴增獲得 gpd(2.3kb)。其 PCR 反應(yīng)體系：10XPCR buffer5y 1，上游（Forward)和下游（Reverse)引 物各 1 y l，Expression vectorlOOng為模板，lOmM dNTPsl μ l，Pfu_Taq(lU/y 1)，最后補水 至50 μ 1。PCR反應(yīng)條件：94°C熱變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，共 進行30次循環(huán)；最后72°C延伸10min，得到gpd產(chǎn)物。
[0047] 7、Qiangen公司的DNA回收試劑盒回收純化gpd產(chǎn)物，HindΠI和XbaI雙酶切g(shù)pd 后再次回收2·3kb的片段。pMD19-gfp(gfp基因插入載體pMD19中）載體經(jīng)Hindm和XbaI 雙酶切后回收2692bp的載體片段。與Hind III和Xba I雙酶切的gpd產(chǎn)物連接，再轉(zhuǎn)化進 入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中、克隆和檢驗按3、4步驟進行，pMD19-T抗性是ampicillin。 測序正確的載體命名為19T-gpd。
[0048] 8、19T-gpd和pKHt2經(jīng)Hind III和kpn I酶切后，分別回收純化2. 3kb的gpd片段 和pKHt2載體。再將兩者連接、轉(zhuǎn)化、克隆和檢驗按2、3、4步驟進行。正確的載體命名為 pKHt-gfpjKHt-gfp載體中引入多克隆位點包括：Xba I，BamH I，Sma I，Xma I 和Kpn I。 pKHt-gfp載體圖如圖1所示。
[0049] 9:所有絲氨酸水解酶基因都是插入到MCS(限制性內(nèi)切酶Xba I -Kpn I )中，形 成相應(yīng)的載體。
[0050] 1) cspl、csp2、c0c2 基因引物
[0051] 表 1
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種能提高蛹蟲草感染寄主昆蟲能力的蛹蟲草工程菌，其特征在于，其是轉(zhuǎn)有冬蟲 夏草絲氨酸水解酶基因 cspl或csp2,并能表達(dá)絲氨酸水解酶Cspl或Csp2的蛹蟲草，所述 的絲氨酸水解酶基因 cspl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的絲氨酸水解酶基因 csp2,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
【文檔編號】C12N1/15GK104195058SQ201410218655
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】江克清, 韓日疇 申請人:廣東省昆蟲研究所