專利名稱：：一種提高小麥紋枯病抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及小麥育種和分子生物學領(lǐng)域，通過采用基因工程方法將天麻的抗真菌蛋白基因和防御素基因?qū)氤Ｒ?guī)小麥并表達，增加小麥的紋枯病抗性。
背景技術(shù)：
：小麥紋枯病，又稱麥尖眼點病(Wheatsharpeyespot)，是由禾谷絲核菌(RhizoctoniacerealisVanderhoeven)禾口立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)弓l起的一種重要的世界性土傳真菌病害，早在1934年國外即有報道。1973年，我國也發(fā)現(xiàn)此病。20世紀80年代以來，隨著施肥水平的不斷提高，耕作制度的改變和感病品種的大面積推廣，紋枯病已成為我國長江流域麥區(qū)的主要病害，并逐漸蔓延到黃淮麥區(qū)，近年來以魯、豫、陜、蘇、皖等麥區(qū)發(fā)生較為嚴重(姚金保等，2007)。小麥紋枯病一般病田病株率為10-20%，重病田塊可達60-80%以上，由此造成的產(chǎn)量損失嚴重，輕的減產(chǎn)5-10%，重的減產(chǎn)40%，甚至顆粒無收，并且小麥紋枯病發(fā)病越早，損失越重(張會云等，2007)。目前，我國小麥紋枯病的防治依然以化學防治為主，化學防治不僅增加農(nóng)本，而且會造成環(huán)境污染，化防的效果還直接受到施藥的時期、天氣等諸多環(huán)境因素的影響。培育并推廣小麥紋枯病抗病品種無疑是控制該病害最經(jīng)濟和最有效的途徑。但多年的種質(zhì)材料鑒定研究也發(fā)現(xiàn)，在已經(jīng)篩選的近千份材料中，沒有發(fā)現(xiàn)對該病害免疫的小麥品種(系)，高抗的材料也較少。對主要紋枯病抗源的抗性遺傳和抗病QTL(數(shù)量性狀位點)分析結(jié)果表明，小麥紋枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的數(shù)量性狀，并且存在復雜的基因互作(湯顳等，2004;吳紀中等，2005;張小村等，2005;任麗娟等，2007)。由于遺傳方式的復雜，給常規(guī)育種帶來諸多困難，如周期性強、預(yù)見性差等，直接影響了小麥紋枯病抗性改良的進度。近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)由于周期短、可用的抗性基因多、針對性強等優(yōu)點，已經(jīng)成為提高作物抗病能力的新手段。采用這一方法，來自于小麥近緣種中間偃麥草的乙烯反應(yīng)因子(ERF)基因已經(jīng)被導入小麥并獲得紋枯病抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因小麥植株(ChenLiang等，2008)。天麻抗真菌蛋白(Gastrodiaantifungalprotien，GAFP)位于天麻次生土央莖的表皮和皮層，對天麻次生塊莖阻抑蜜環(huán)菌侵染有關(guān)，離體抑菌實驗表明天麻抗真菌蛋白對多種真菌均有抑菌活性(胡忠等，1988)，該基因已經(jīng)被克隆(http:〃麗w.ncbi.nlm.nih.gov/;GenBank:AF225410)。防御素是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，其作用機理特殊帶正電荷的防御素分子與帶負電荷的靶細胞膜接觸后，通過靶細胞膜產(chǎn)生的電動勢將形成疏水面的防御素二聚體注入細胞膜，多個二聚體可形成跨膜離子通道，擾亂細胞膜通透性及細胞能量狀態(tài)，導致細胞膜去極化，呼吸作用受抑制以及細胞ATP含量下降，最終使靶細胞死亡；防御素抗病毒作用則是通過與病毒外殼蛋白結(jié)合而導致病毒失去生物活性(童青春等，1999;龍晶等，2007)。防御素的抗菌譜廣，不但對細菌、真菌、和被膜病毒有廣譜的毒殺效應(yīng)，對某些惡性腫瘤細胞也有毒殺作用。來自于兔的防御素NP-l已進行氨基酸序列測定(GenBank:AAB21588)。本發(fā)明采用基因工程方法將天麻抗真菌蛋白基因以及兔防御素NP-l基因?qū)肫胀ㄐ←湥岣吡诵←湹募y枯病抗性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于針對目前小麥紋枯病抗性種質(zhì)資源貧乏狀況，采用轉(zhuǎn)基因方法將抗小麥紋枯病病原菌的天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因?qū)敫屑y枯病的小麥品種，從而提高小麥的紋枯病抗性。本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的構(gòu)建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體；采用基因槍方法將構(gòu)建的表達載體導入受體小麥幼胚細胞；通過組織培養(yǎng)過程篩選，獲得轉(zhuǎn)基因待選植株；對待選植株進行PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))分析，獲得整合并表達天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的轉(zhuǎn)基因植株；對純合的轉(zhuǎn)基因植株后代株系進行紋枯病抗性鑒定，篩選并獲得紋枯病抗性提高的小麥轉(zhuǎn)基因株系。在本發(fā)明中所述的構(gòu)建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體是這樣實現(xiàn)的，以pAHC25(附圖一)為基礎(chǔ)質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶XbaI和Bgl1I對pAHC25質(zhì)粒DNA進行部分酶切，切除質(zhì)粒含有的bar基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA后分別添加XbaI和BglII酶切位點的兔防御素NP-l基因(由GenBank:AAB21588氨基酸序列推導的DNA堿基序列添加ATG起始密碼子和終止密碼子TGA，完整DNA序列見Seql)DNA片段，采用T4DNA連接酶16。C連接過夜(25ul反應(yīng)體系含1XT4DNA連接酶緩沖液，質(zhì)粒大片段0.3pmo1，兔防御素NP_1基因片段0.03pmol，350uT4DNA連接酶，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，P55-56頁，科學出版社，1992)，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5a細胞懸液涂布含100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質(zhì)粒命名為pAHC-NP;pAHC-NP質(zhì)粒DNA采用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI完全酶切，切除質(zhì)粒含有的GUS基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，再與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA后分別添加SmaI和SacI酶切位點的天麻抗真菌蛋白基因(GenBank:AF225410添加起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，完整DNA序列見seq2)DNA片段采用T4DNA連接酶按上文連接條件進行連接，連接產(chǎn)物按上文方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對抗100mg/L氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質(zhì)粒命名為pAHC-NP-GAFP即為天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體(見附圖二)。采用基因槍轉(zhuǎn)基因方法將構(gòu)建的表達載體導入受體小麥幼胚細胞，通過愈傷誘導、植株再生獲得轉(zhuǎn)基因待選植株(參照周淼平等，小麥基因槍法轉(zhuǎn)化技術(shù)的改進，江蘇農(nóng)業(yè)學報，1999，15(1):62-64);所述的受體小麥是指六倍體常規(guī)小麥；所述的幼胚是指開花后12-14天的幼胚。在本發(fā)明的應(yīng)用中對待選植株進行分子檢測，獲得整合并表達天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的陽性轉(zhuǎn)基因植株，陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉(zhuǎn)基因純合株系；對T5代轉(zhuǎn)基因純合株系后代系進行紋枯病抗性篩選，獲得紋枯病抗性提高的轉(zhuǎn)基因植株。所述的分子檢測為PCR分析方法。PCR分析是指提取待選轉(zhuǎn)基因小麥及其后代的基因組DNA(脫氧核糖核酸)，以此為模板對天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因片段進行PCR擴增，能擴增出相應(yīng)基因片段的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。天麻抗真菌蛋白基因的PCR檢測引物為5'CTAGCACAAGGCGGCTACCTATTC3'和5'GCAGTGATTTCAGCATTTCCAACG3'，擴增條件95。C3分鐘；94。C1分鐘，62。C45秒，72。C30秒，共30個循環(huán)；最后72。C延伸5分鐘。擴增片段大小為305bp，檢測電泳圖見附圖3。兔防御素基因的PCR檢測引物為5，ATGGTTGTTTGTGCATGTAG3，禾P5，CAACGACGACAACAAAGTGG3'，擴增條件95。C3分鐘；94。C1分鐘，60。C45秒，72。C30秒，共35個循環(huán)；最后72。C延伸5分鐘。擴增片段大小為104bp，檢測電泳圖見附圖4。紋枯病抗性鑒定是指采用具有較強致病力的紋枯病病原菌進行牙簽嵌入法接種(具體鑒定方法參照蔡士賓等，小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL定位的初步研究，中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39(5):928-934)，根據(jù)病情指數(shù)判定其紋枯病抗性。具體做法如下將長1.OcM左右的牙簽水浸30分鐘后，鋪于燒杯底部，加入適量PDA培養(yǎng)基，經(jīng)高溫濕熱滅菌后，接種具有較強致病力的紋枯菌菌絲塊，25t:恒溫培養(yǎng)30天，待菌絲密集布滿短牙簽表面。小麥拔節(jié)期將經(jīng)上述方法處理的牙簽嵌入到小麥植株貼近地面的基部第12葉鞘之間，每株系接種15個莖稈，噴霧保濕7天。于小麥乳熟期調(diào)查紋枯病發(fā)病情況，計算病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)判定小麥植株的紋枯病抗性。病情嚴重度判定標準如下0級無病癥；1級葉鞘有典型的紋枯病病斑，但不侵莖；2級病菌侵人莖稈，病斑寬度環(huán)莖不超過莖稈周長的1/2;3級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑環(huán)莖寬度在1/2-3/4莖稈周長之間；4級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑繞莖稈3/4以上，或莖稈已軟腐；5級枯孕穗或枯白穗。病情指數(shù)按以下公式計算病情指數(shù)=[(E各級病株數(shù)X各級代表值)/(總株數(shù)X最高級代表值)]X100紋枯病抗性判定標準病情指數(shù)《20為"高抗"；20<病情指數(shù)《50為"抗病"；50<病情指數(shù)《80為"感病"；80<病情指數(shù)《100為"高感"。本發(fā)明的優(yōu)點在于與常規(guī)的種質(zhì)培育方法相比，選取的目的基因?qū)y枯病病原菌的生長有抑制作用，針對性強；由轉(zhuǎn)化植株到純合的轉(zhuǎn)基因株系時間短并且對受體親本的重要農(nóng)藝性狀影響小，培育的周期短、減少對重要農(nóng)藝性狀選育所需的人工經(jīng)驗的依賴性。圖lpAHC25的示意圖圖2天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP的示意圖圖3部分轉(zhuǎn)基因待選植株天麻抗真菌蛋白基因的PCR檢測的電泳圖，其中1:未轉(zhuǎn)基因揚麥158對照。2:質(zhì)粒pAHC-NP-GAFP。12:DNA分子量標準，條帶從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。3-11，13-24:轉(zhuǎn)基因待選植株。其中4-6，8-11，13-18，20-24為轉(zhuǎn)天麻抗真菌蛋白基因的陽性植株。圖4為部分轉(zhuǎn)基因待選植株兔防御素基因的PCR檢測的電泳圖，其中CK+:質(zhì)粒pAHC-NP-GAFP。CK—:未轉(zhuǎn)基因揚麥158對照。1-16:轉(zhuǎn)基因待選植株。其中1，3-6，10-15為轉(zhuǎn)兔防御素基因的陽性植株。具體實施方式實施例1:以pAHC25為基礎(chǔ)質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶XbaI和BglII對pAHC25質(zhì)粒DNA進行部分酶切，切除質(zhì)粒含有的bar基因，O.8%瓊脂糖電泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA后分別添加XbaI和BglII酶切位點的兔防御素NP-1基因(由GenBank:AAB21588氨基酸序列推導的DNA堿基序列添加ATG起始密碼子和終止密碼子TGA，完整DNA序列見seql)DNA片段，采用T4DNA連接酶16。C連接過夜(25ul反應(yīng)體系含lXiy)NA連接酶緩沖液，質(zhì)粒大片段O.3pmol，兔防御素NP-l基因片段0.03pmol，35uT4DNA連接酶，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，P55-56頁，科學出版社，1992)，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5a細胞懸液涂布含100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質(zhì)粒命名為pAHC-NP;pAHC-NP質(zhì)粒DNA采用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI完全酶切，切除質(zhì)粒含有的GUS基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，再與起始密碼子ATG前和終止密碼子TGA后分別添加SmaI和SacI酶切位點的天麻抗真菌蛋白基因(GenBank:AF225410添加起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，完整DNA序列見seq2)DNA片段采用T4DNA連接酶按上文連接條件進行連接，連接產(chǎn)物按上文方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對抗100mg/L氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質(zhì)粒命名為pAHC-NP-GAFP即為天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體(見附圖二)。以揚麥158為受體，采用基因槍法，將天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因同時導入揚麥158幼胚細胞，通過愈傷誘導、植株再生獲得轉(zhuǎn)基因待選植株(參照周淼平等，小麥基因槍法轉(zhuǎn)化技術(shù)的改進，江蘇農(nóng)業(yè)學報，1999，15(1):62-64)，對待選植株進行PCR篩選，天麻抗真菌蛋白基因的PCR檢測引物為5'CTAGCACAAGGCGGCTACCTATTC3'和5'GCAGTGATTTCAGCATTTCCAACG3'，擴增條件95°C3分鐘；94°C1分鐘，62。C45秒，72°C30秒，共30個循環(huán)；最后72t:延伸5分鐘。擴增片段大小為305bp，檢測電泳圖見附圖3。兔防御素基因的PCR檢測引物為5'ATGGTTGTTTGTGCATGTAG3'禾P5'CAACGACGACAACAAAGTGG3，，擴增條件95。C3分鐘；94。C1分鐘，60°C45秒，72°C30秒，共35個循環(huán)；最后72t:延伸5分鐘。擴增片段大小為104bp，檢測電泳圖見附圖4。獲得整合并表達天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉(zhuǎn)基因純合株系，對轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行紋枯病抗性篩選。紋枯病抗性篩選采用江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供的具較強紋枯病致病力菌株R3010接種，接種采用牙簽接菌法(具體鑒定方法參照蔡士賓等，小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL定位的初步研究，中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39(5):928-934)，將長1.OcM左右的牙簽水浸30分鐘后，鋪于燒杯底部，加入適量PDA培養(yǎng)基，經(jīng)高溫濕熱滅菌后，接種具有較強致病力的紋枯菌菌絲塊，25t:恒溫培養(yǎng)30天，待菌絲密集布滿短牙簽表面。小麥拔節(jié)期將經(jīng)上述方法處理的牙簽嵌入到小麥植株貼近地面的基部第12葉鞘之間，每株系接種15個莖稈，噴霧保濕7天。于小麥乳熟期調(diào)查紋枯病發(fā)病情況，計算株系平均病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)判定小麥植株的紋枯病抗性。病情嚴重度判定標準如下0級無病癥；1級葉鞘有典型的紋枯病病斑，但不侵莖；2級病菌侵人莖稈，病斑寬度環(huán)莖不超過莖稈周長的1/2;3級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑環(huán)莖寬度在1/2-3/4莖稈周長之間；4級病菌侵人莖稈，莖稈上病斑繞莖稈3/4以上，或莖稈已軟腐；5級枯孕穗或枯白穗。病情指數(shù)按以下公式計算病情指數(shù)=[(E各級病株數(shù)X各級代表值)/(總株數(shù)X最高級代表值)]X100紋枯病抗性判定標準病情指數(shù)《20為"高抗"；20<病情指數(shù)《50為"抗病"；50<病情指數(shù)《80為"感病"；80<病情指數(shù)《100為"高感"。紋枯病抗性鑒定結(jié)果見表l，受體對照親本的病情指數(shù)為80.0，屬高感類型，23個導入天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的T5代純合株系的平均病情指數(shù)在21.0-46.0之間，都屬于抗病類型，表明由于雙價基因的導入，可以使轉(zhuǎn)基因植株的紋枯病抗性得到大幅提高。表1揚麥158轉(zhuǎn)基因T5代純合株系的紋枯病抗性鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序列表〈110〉江蘇省農(nóng)業(yè)科學院〈120〉一種提高小麥紋枯病抗性的方法〈130〉〈160>6〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉105〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1atggttgtttgtgcatgtagacgtgcactttgttteccacgtgaacgtcgtgcaggtttt60tgtagaattcgtggtagaattcatccactttgttgtcgtcgttga105〈210>2〈211〉393〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>2atgagggtacggttgaattcgggccacc朋ggctacctattcateateg;aaaacgattgtgtetgggcatcagg朋cc朋cggaaaggccggcaacctccttetttetegcggtegcaggaacggteactactetctgatccttcagaga朋t朋tgcgatttgggc朋cccacacc朋ccacagc朋cggcacagcggcggcgtctggc〈210>3〈211>24〈212>DNA<213>人工序列〈400>3ctagcacaaggcggctecctattc〈210〉4〈211>24〈212>DNA<213>人工序列〈400>4gcagtgatttcagcatttccaacg〈210〉5〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5atggttgtttgtgcatgtag〈210>6〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400>6c朋cgacgac朋c朋3gtggcttgataccgggggctcEigtagc卿aggc60aatcttgtcttetetgateacaacagagcg120tetggctgtgtgctteagatgcag朋tgat180gc朋tetgggc朋gc朋cacc朋tcgcc朋240gatcgteacgtcgtcatetecgataattct300gttgg￡l￡l￡ltgctgaaatcactgccatccca360tgEl39324242020權(quán)利要求一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于以下步驟a、構(gòu)建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP；b、通過基因槍法將天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因表達載體pAHC-NP-GAFP導入受體小麥幼胚細胞；c、對所述的小麥幼胚細胞進行愈傷誘導、植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因待選植株；d、對上述轉(zhuǎn)基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉(zhuǎn)基因純合株系；e、對T5代轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行紋枯病抗性篩選；f、篩選出紋枯病抗性提高的轉(zhuǎn)基因植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于所述的天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP通過以下步驟獲得A、制備質(zhì)粒pAHC-NP:以pAHC25為基礎(chǔ)質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶XbaI和BglII對pAHC25質(zhì)粒DNA進行部分酶切，切除質(zhì)粒含有的bar基因，0.8%瓊脂糖電泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，以T4DNA連接酶與seql連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5a細胞懸液涂布含100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質(zhì)粒命名為pAHC-NP;B、制備pAHC-NP-GAFP表達載體pAHC-NP質(zhì)粒DNA采用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI完全酶切，切除質(zhì)粒含有的GUS基因，O.8%瓊脂糖電泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，以!V)NA連接酶與Seq2連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對抗100mg/L氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質(zhì)粒命名為pAHC-NP-GAFP即為天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于所述的seq1為ATGGTTGTTTGTGCATGTAGACGTGCACTTTGTTTACCACGTGAACGTCGTGCAGGTTTTTGTAGAATTCGTGGTAGAATTCATCCACTTTGTTGTCGTCGTTGA;所述seq2為ATGAGGGTACGGTTGAATTCGGGCCACCAACTTGATACCGGGGGCTCAGTAGCAGAAGGCGGCTACCTATTCATAATAGMAACGATTGTMTCTTGTCTTATATGATAACMCAGAGCGGTATGGGCATCAGGAACCAACGGAAAGGCCTATGGCTGTGTGCTTAAGATGCAGAATGATGGCAACCTCCTTATTTATAGCGGTAGCAGGGCAATATGGGCAAGCAACACCAATCGCCAAAACGGTAACTACTATCTGATCCTTCAGAGAGATCGTAACGTCGTCATATACGATAATTCTAATAATGCGATTTGGGCAACCCACACCAACGTTGGAAATGCTGMATCACTGCCATCCCACACAGCAACGGCACAGCGGCGGCGTCTGGCTGA。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于所述的分子檢測為PCR分析方法。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于抗小麥紋枯病的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體涉及通過采用基因工程方法將天麻的抗真菌蛋白基因和兔防御素基因?qū)氤Ｒ?guī)小麥并表達，增加小麥的紋枯病抗性；一種提高小麥紋枯病抗性的方法，在于以下步驟構(gòu)建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表達載體pAHC-NP-GAFP；通過基因槍法將pAHC-NP-GAFP導入受體小麥幼胚細胞，對小麥幼胚細胞愈傷誘導、植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因待選植株，通過分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T5代轉(zhuǎn)基因純合株系；對T5代轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行紋枯病抗性篩選；篩選出紋枯病抗性提高的轉(zhuǎn)基因植株。其優(yōu)點在于與常規(guī)的種質(zhì)培育方法相比，具有針對性強、培育周期短、對重要農(nóng)藝性狀影響小的特點。文檔編號A01H1/02GK101696420SQ200910210538公開日2010年4月21日申請日期2009年11月9日優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日發(fā)明者任麗娟,余桂紅,周淼平,孫曉波,張旭,張鵬,馬鴻翔申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院;