一種秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，該育種新方法的步驟如下：（1）選取待改良粳稻品種/系和抗紋枯病秈稻抗源；（2）對選取的待改良粳稻品種/系進行粗毒素耐性濃度的鑒定；（3）雜交育種獲得三交F1雜交種；（4）對三交F1雜交種進行排秈培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)；（5）大田種植花培苗，單株收種獲得紋枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系進一步大田播種，以待改良粳稻品種/系親本為對照，篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且紋枯病抗性得到改良的粳稻新品系。本發(fā)明的育種新方法能夠?qū)⒍i稻抗紋枯病基因特定而高效地滲入粳稻，3年左右即可完成抗紋枯病育種，顯著縮短常規(guī)秈粳交抗紋枯病育種周期，具有較大的育種應用價值。
【專利說明】一種秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是指一種特定而高效地將秈稻紋枯病抗性基 因滲入粳稻的水稻育種方法，具體地說是一種秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻紋枯?。╮ice sheath blight),俗稱爛腳癌、花桿、下腳枯等，是水稻生產(chǎn)上 的重要病害之一，是遍及全球的水稻病害。該病1905年在日本被首次發(fā)現(xiàn)，1934年在我國 有發(fā)病報道，其后迅速擴散并蔓延至非洲、歐洲和美洲等地。目前該病已在亞、非、歐、美各 洲水稻種植國家普遍發(fā)生，一般減產(chǎn)10%?30%，嚴重時可達50%，對水稻生產(chǎn)威脅很大。 該病主要危害葉鞘和葉片，嚴重時也能危害到頂葉及穗部。一般葉鞘先發(fā)病，然后是葉片。 先在近水面出現(xiàn)水澤壯斑塊，后擴大成云紋壯大斑，并長出許多像蛛絲的白色菌絲。輕的葉 片枯黃，抽穗困難，出米率下降，嚴重時常導致稻株倒伏或枯死，使水稻嚴重減產(chǎn)。近些年， 隨著矮桿、多蘗、高產(chǎn)品種的推廣和施肥、栽培方式的不斷提高，稻田病原物的累積增多，病 害漸趨普遍和嚴重，我國南方一些稻區(qū)紋枯病已高居水稻三大病害之首。
[0003] 水稻紋枯病是種真菌性病害，它的致病菌為水稻紋枯病菌，具有強腐生性和較寬 的寄主范圍。紋枯病菌在生長代謝過程中會產(chǎn)生真菌毒素，在植物病害的發(fā)生、發(fā)展過程中 真菌毒素具有明顯的致病、致毒作用，對植物組織也有明顯的損害作用。研究表明，水稻紋 枯病菌粗毒素不僅能引起紋枯病的相似病斑，而且抑制胚根生長，致使幼苗萎蔫，這顯示毒 素在病菌致病過程中起非常重要的作用。
[0004] 長期以來，對水稻紋枯病的防治主要依賴于化學藥劑和栽培措施，但防治效果不 甚理想?，F(xiàn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中采取綜合防治技術(shù)預防紋枯病的發(fā)生，主要手段是采取一些預防 性措施，如選用抗病品種、栽培上采用抗菌消毒手段和施用農(nóng)藥進行藥物治療，并建立紋枯 病預報預測系統(tǒng)，長期的生產(chǎn)實踐證明，水稻紋枯病抗性品種的選育和應用是防治紋枯病 最經(jīng)濟有效的措施。
[0005] 秈粳稻深刻分化與顯著差異，使它們在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性等方面各具特色，其雜 種F1，無論在營養(yǎng)器官還是在產(chǎn)量性狀上均具有強大的雜種優(yōu)勢。袁隆平首次提出了秈粳 亞種間雜種優(yōu)勢利用的設(shè)想，認為直接利用亞種間雜種優(yōu)勢是產(chǎn)量突破中最有希望且能在 較短時期內(nèi)取得成效的途徑，提出了應用廣親和基因與光溫敏核不育基因?qū)崿F(xiàn)亞種間雜種 優(yōu)勢直接利用的戰(zhàn)略設(shè)想。秈粳稻雜交育種將打破亞種內(nèi)育種的界限，從亞種內(nèi)育種走向 亞種間育種。秈粳雜交為亞遠緣雜交，雜交后代易產(chǎn)生巨大變異和超親優(yōu)勢，蘊藏著巨大的 遺傳潛力。秈粳稻雜交常規(guī)育種和秈粳亞種間雜種優(yōu)勢利用已成為當今水稻超高產(chǎn)育種研 究的重要手段和方法。我國的育種實踐也證明，利用秈粳稻雜交是創(chuàng)造新株型優(yōu)異種質(zhì)行 之有效的方法。目前秈粳交育成的品種有浙江的矮粳23、T209和城特232等，遼寧的遼粳 5號、遼粳326、沈農(nóng)1033,江蘇的紫金粳，北京的中作系統(tǒng)，湖北的鄂育晚5號等。這些品 種（系）表現(xiàn)出高產(chǎn)、抗病和優(yōu)質(zhì)的優(yōu)良特性，但有的秈粳亞種間雜交后代表現(xiàn)出一些缺點， 如"千重浪"的不抗稻瘟病，"南粳35"的易于穗發(fā)芽等。
[0006] 國外對秈粳雜交常規(guī)育種技術(shù)亦給予高度重視。自60年代中后期起，韓國的秈粳 雜交常規(guī)育種取得了舉世矚目的成就，育成了統(tǒng)一、水原、密陽等高產(chǎn)矮桿系統(tǒng)，這些品種 一般比傳統(tǒng)粳型品種增產(chǎn)20%?40%。日本引進中國和韓國等地的高產(chǎn)秈稻品種，與當?shù)?粳稻品種雜交，增加雜種后代的穎花數(shù)，同時提高雜交后代的抗逆性和穩(wěn)產(chǎn)性，先后育成了 52個有希望的新品系和5個新品種，如中國91、北陸125、北陸142、關(guān)東146、星豐、秋力等， 比對照品種增產(chǎn)20%?36%。日本育種家認為，在第三階段要實現(xiàn)增產(chǎn)50%的指標必須依靠 雜交稻，特別是在水稻廣親和基因理論提出后，主要依靠秈粳亞種間雜種優(yōu)勢利用途徑來 達到。
[0007] 但是，由于秈、粳屬兩個亞種，F(xiàn)1盡管營養(yǎng)優(yōu)勢很強。但一般都存在部分生殖障 礙，秈粳亞種間雜種F1代的株高偏高，生育期超親晚熟，以及花粉部分敗育、結(jié)實率偏低等 問題，是秈粳交育種面臨的三大障礙，嚴重限制了這種優(yōu)勢在生產(chǎn)上的直接利用。秈粳交利 用無論是常規(guī)稻品種選育還是恢復系選育，基本上是建立在隨機配組和大量選擇的基礎(chǔ)上 的，需要耗費多年的時間和巨大的勞動量。
[0008] 研究發(fā)現(xiàn)，典型的秈秈交和粳粳交由于基因交流少，F(xiàn)1優(yōu)勢弱，而過度的秈粳基因 交流也不利于F1在營養(yǎng)生長與生殖生長上的協(xié)調(diào)，同樣難以表現(xiàn)出產(chǎn)量優(yōu)勢，這就涉及到 秈粳基因漸滲的程度問題。育種事實表明，秈粳基因漸滲在超級雜交稻育種中發(fā)揮了重要 作用，通過分子檢測，很多超級雜交稻的親本均通過秈粳基因漸滲獲得。然而，基因漸滲在 超級稻育種中，還是通過多次代的雜交、回交篩選來實現(xiàn)，育種周期長，工作量巨大。
[0009] 秈粳稻深刻分化與顯著差異，使它們在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性等方面各具特色，其中 一個就是在紋枯病病菌的抗性表現(xiàn)差異非常顯著，秈稻品種多對紋枯病有較高的抗性水 平，而粳稻對紋枯病的抗性較差，表明秈稻基因組內(nèi)含有大量粳稻所沒有的抗紋枯病基因 存在。如能將秈稻內(nèi)的抗紋枯病基因通過精確高效的手段轉(zhuǎn)移進粳稻基因組培養(yǎng)抗紋枯病 粳稻品種，在生產(chǎn)上具有極高的價值。
[0010] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，除常規(guī)雜交育種外又出現(xiàn)了許多新的育種手段，這賦予了 水稻抗紋枯病育種新途徑，一種是利用紋枯病培養(yǎng)液提取粗毒素作為選擇壓，在細胞水平 上進行篩選突變體，并與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合培育新的抗病品種，但是通過粗毒素人工誘變 的頻率低，篩選量大；第二種就是以轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子標記輔助選擇育種技術(shù)為代表的分 子育種技術(shù)。分子育種技術(shù)的出現(xiàn)，對水稻抗紋枯病育種和秈粳交育種難關(guān)本來是一種可 行的解決方案，目前，轉(zhuǎn)基因育種與分子標記輔助選擇等分子技術(shù)育種是目前農(nóng)業(yè)發(fā)展的 新道路，被科學界公認為第三次農(nóng)業(yè)綠色革命的出現(xiàn)。但是，對特定優(yōu)良主栽品種進行抗紋 枯病基因和其他優(yōu)良基因的轉(zhuǎn)基因育種，本來可以精確實現(xiàn)秈粳交的改良，但由于目前轉(zhuǎn) 基因育種被抵制，而分子標記輔助選擇育種首先需要基因定位，同樣需要大田多世代的雜 交回交，不能解決秈粳交的問題，另外，分子技術(shù)育種，都存在費用高、技術(shù)門檻高的問題， 難以被一般育種者所掌握。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有秈粳交常規(guī)育種所面臨的雜種F1株高偏高、生育期超 親晚熟、花粉部分敗育結(jié)實率偏低的障礙，提供一種將秈稻紋枯病抗性基因特定而高效地 滲入粳稻從而改良粳稻品種的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法。
[0012] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的： 一種秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：該育種新方法的步驟如下： (1) 選取待改良粳稻品種/系和抗紋枯病秈稻抗源：選取農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/ 系并對選取的粳稻品種/系進行排秈培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng)，最終選定花藥愈傷組織誘導率高 于25%的粳稻品種/系作為待改良粳稻品種/系，選取農(nóng)藝性狀良好且含有紋枯病高抗基 因的秈稻品種/系作為抗紋枯病秈稻抗源； (2) 對選取的待改良粳稻品種/系進行粗毒素耐性濃度的鑒定：分別在分化培養(yǎng)基中 加入一定梯度濃度的粗毒素提取液，對步驟（1)中選定的待改良粳稻品種/系的花藥愈傷 組織進行分化培養(yǎng)，并選擇合適篩選壓力水平濃度的粗毒素提取液作為粳稻花藥培養(yǎng)粗毒 素選擇壓； (3) 雜交育種獲得三交F1雜交種：將大田種植篩選的抗紋枯病秈稻抗源與廣親和材料 秈粳架橋獲得雜交種F1，選取雜交種F1的花藥再與待改良粳稻品種/系雜交獲取雜交種三 交F1 ; (4) 對三交F1雜交種進行排秈培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)：三交F1雜交種正季播種，選取健壯主 穗花藥進行排秈培養(yǎng)基花藥誘導培養(yǎng)，獲得花藥愈傷組織，并挑選直徑〇. 4?0. 8cm的花藥 愈傷組織接種于添加了選擇壓濃度粗毒素的分化培養(yǎng)基，在溫度27?29°C、光14h/暗10h 的條件下培養(yǎng)，獲得花培幼苗，待花培苗長至2cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，待 花培苗長至8cm后移栽至周轉(zhuǎn)箱壯苗，10?15天后移栽入大田； (5 )花培苗單株收種獲得花培家系，進一步農(nóng)藝性狀、紋枯病抗性篩選獲得改良的粳稻 新品系：大田種植花培苗，單株收種獲得紋枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家 系進一步大田播種，以待改良粳稻品種/系親本為對照，篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且紋枯病 抗性得到改良的粳稻新品系。
[0013]所述步驟（1)中的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系是指產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、紋枯病抗 性有待改良以及株高不宜過高、生育期早熟或中熟的粳稻品種/系；抗紋枯病秈稻抗源是 指廣量商、米質(zhì)優(yōu)良、商抗紋枯病的軸稻品種/系。
[0014]所述步驟（1)中選取的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系進行排秈培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng) 的過程如下： (1.1)取材與預處理：將選取的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系大田常規(guī)栽培，取葉枕距 為5?7cm、穗色呈淡黃綠色、花藥淡黃色且長度約為穎殼的1/3?1/2、孕穗不裂開的健壯 主穗為供試材料，保留2?3張葉片，75%酒精擦拭表面后，用濕毛巾包裹且外套塑料袋，置 4°C下低溫預處理3天； (1. 2)接種：預處理后，將含主穗的稻苞剪下，然后將該稻苞浸泡于75%的酒精中處理 3?4min，接著將該稻苞轉(zhuǎn)移于超凈工作臺中剝離主穗，進一步剝?nèi)⌒∷霝榇笮【鶆虻男?支梗，接下來用消毒過的紗布包裹小支梗后用濃度為〇. 1%的升汞滅菌l〇min，無菌水漂洗 3?4次，打開紗布晾干，最后用消毒過的剪刀剪開花藥上部，抖藥法接種花藥于排秈培養(yǎng) 基； (1. 3)誘導培養(yǎng)：將排秈培養(yǎng)基置于24?26°C的黑暗環(huán)境中誘導愈傷組織，30?40天 后在花藥的邊緣出現(xiàn)白-淡黃色的無定型細胞團，并在花藥接種培養(yǎng)50天后統(tǒng)計花藥愈傷 組織誘導率，選定花藥愈傷組織誘導率高于25%的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系作為待改 良梗稻品種/系。
[0015] 所述步驟（1. 2)中的稻苞是指稻苞頂枕距為7cm至穗下節(jié)間上部0. 5cm的區(qū)域內(nèi) 剪材獲得的部分，且剝?nèi)〉男≈ЧＩ匣ㄋ帞?shù)量為15?25粒。
[0016] 所述步驟（1. 2)中的排秈培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+N6微量元素+N6有機質(zhì) +2mg/L2, 4-D+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0? 8%植物凝膠，排秈培養(yǎng)基的pH值 為 5. 8。
[0017] 所述步驟（2)中的粗毒素耐性濃度鑒定過程如下： (2. 1)粗毒素的制備：將混合紋枯病菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，27°C下培養(yǎng) 至菌絲長滿平板，從平板菌落邊緣取直徑為5mm的5塊菌絲塊至50mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，27°C 暗培養(yǎng)15d，每天人工振蕩2次，15天后將培養(yǎng)濾液加熱，產(chǎn)生的白色沉淀用濾紙過濾，在 濾液中加入30g活性炭，4°C靜置吸附12h，然后8500r/min離心15min，再將活性炭沉淀用 等體積甲醇洗脫，洗脫液60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，獲得的黃色漿狀物即為水稻紋枯病菌粗毒 素； (2. 2)對選取的待改良粳稻品種/系進行粗毒素耐力濃度鑒定：分別在分化培養(yǎng)基中 加入一定梯度濃度的粗毒素提取液，然后將步驟（1)中選定的待改良粳稻品種/系誘導培 養(yǎng)的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移進分化培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)30?40天后統(tǒng)計愈傷組織分化率，并選擇 合適篩選壓力水平濃度的粗毒素提取液作為三交F1雜交種花藥培養(yǎng)粗毒素選擇壓濃度。
[0018] 所述步驟（2. 2)中的合適篩選壓力水平濃度是指選定的待改良粳稻品種/系誘導 培養(yǎng)的花藥愈傷組織在含有粗毒素的分化培養(yǎng)基中的分化率為〇. 8%?1. 2%時的粗毒素濃 度。
[0019] 所述步驟（2. 1)中的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g/L+葡 萄糖20g/L+瓊脂粉12g/L，pH值自然；產(chǎn)毒培養(yǎng)基配方為：KN0 310g/L+KH2P045g/ L+MgS04 ? 7H202. 5g/L+Fe2(S04)30. 02g/L+蔗糖 45g/L，pH 值為 6. 5 ;所述步驟（2. 2)中的分 化培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基+2mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA+梯度濃度粗毒素提取液，分化培 養(yǎng)基的pH值為6.0。
[0020] 所述步驟（4)中的三交F1雜交種的花藥愈傷組織誘導率低于3%時，需將三交F1 雜交種與粳稻親本回交獲得BC1F1雜交種，BC1F1雜交種正季播種，選取健壯主穗重新進 行排秈培養(yǎng)基花藥誘導培養(yǎng)，直至獲得誘導率不低于3%的花藥愈傷組織，挑選直徑0. 4? 0. 8cm的花藥愈傷組織接種于添加粗毒素選擇壓的分化培養(yǎng)基，在溫度27?29°C、光14h/ 暗l〇h的條件下培養(yǎng)，獲得花培幼苗，待花培苗長至2cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進行繼代培 養(yǎng)，待花培苗長至8cm后移栽至周轉(zhuǎn)箱壯苗，10?15天后移栽入大田。
[0021] 所述步驟（4)中的排秈培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+N6微量元素+N6有機質(zhì)+2mg/ L2, 4-D+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0? 8%植物凝膠，排秈培養(yǎng)基的pH值為 5. 8 ;分化培養(yǎng)基配方為：MS無機鹽+MS有機物+蔗糖3%+瓊脂0. 7%+KT2. 0mg/L+NAA0. 5mg/ L+水解蛋白lg/L+合適篩選壓力水平濃度的粗毒素提取液，分化培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;生 根培養(yǎng)基配方為：l/2Ms大量+Ms微量+Ms有機物+蔗糖3%+瓊脂0. 8%，生根培養(yǎng)基的pH 值為5.8。
[0022] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點： 本發(fā)明的育種新方法與常規(guī)育種方法相比，能夠?qū)⒍i稻抗紋枯病基因特定而高效地滲 入粳稻，大大減少了篩選工作量，3年左右即可完成育種，顯著縮短常規(guī)秈粳交抗紋枯病育 種周期；與分子技術(shù)育種相比，又具有操作門檻相對較低、花費較少且育種周期縮短的優(yōu) 點，具有較大的育種應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 附圖1為本發(fā)明的育種新方法技術(shù)路線圖。

【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖1與實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0025] 如圖1的技術(shù)路線圖所示：一種秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，該育種新 方法的步驟如下： (1)選取待改良梗稻品種/系和抗紋枯病軸稻抗源： 選取農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系，因為秈粳交雜種F1代通常具有株高偏高、生育期 超親晚熟的特點，故該農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系是指產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、紋枯病抗性有 待改良的以及株高不宜過高、生育期早熟或中熟的粳稻品種/系；然后對選取的粳稻品種/ 系進行排秈培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng)，以檢驗該粳稻品種/系是否適用于排秈培養(yǎng)基中進行花藥 誘導愈傷組織，誘導培養(yǎng)的過程如下：（1. 1)取材與預處理：將選取的農(nóng)藝性狀良好的粳稻 品種/系大田常規(guī)栽培，取葉枕距為5?7cm、穗色呈淡黃綠色、花藥淡黃色且長度約為穎殼 的1/3?1/2、孕穗不裂開的健壯主穗為供試材料，保留2?3張葉片，75%酒精擦拭表面后， 用濕毛巾包裹且外套塑料袋，置4°C下低溫預處理3天；（1. 2)接種：預處理后，將含主穗的 稻苞剪下，稻苞是指稻苞頂枕距為7cm至穗下節(jié)間上部0. 5cm的區(qū)域內(nèi)剪材獲得的部分，然 后將該稻苞浸泡于75%的酒精中處理3?4min，接著將該稻苞轉(zhuǎn)移于超凈工作臺中剝離主 穗，進一步剝?nèi)⌒∷霝榇笮【鶆虻男≈Ч＃總€小支梗上花藥數(shù)量限制為15?25粒，接下 來用消毒過的紗布包裹小支梗后用濃度為0. 1%的升汞滅菌不低于lOmin，無菌水漂洗3? 4次，打開紗布晾干，最后用消毒過的剪刀剪開花藥上部，抖藥法接種花藥于排秈培養(yǎng)基，排 秈培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+N6微量元素+N6有機質(zhì)+2mg/L2, 4-D+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L 水解蛋白+5%蔗糖+0. 8%植物凝膠，該排秈培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;(1. 3)誘導培養(yǎng)：將排秈 培養(yǎng)基置于24?26°C的黑暗環(huán)境中誘導愈傷組織，30?40天后在花藥的邊緣出現(xiàn)白-淡 黃色的無定型細胞團，并在花藥接種培養(yǎng)50天后統(tǒng)計花藥愈傷組織誘導率，選定花藥愈傷 組織誘導率高于25%的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系作為待改良粳稻品種/系。同時選取 農(nóng)藝性狀良好且含有紋枯病高抗基因的秈稻品種/系作為抗紋枯病秈稻抗源，抗紋枯病秈 稻抗源是指產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、高抗紋枯病的秈稻品種/系，確保該秈稻抗源含有紋枯病高 抗基因。
[0026] (2)對選取的待改良粳稻品種/系進行粗毒素耐性濃度的鑒定： 粗毒素耐性濃度鑒定過程如下：（2. 1)粗毒素的制備：將混合紋枯病菌接種于馬鈴薯 葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，27°C下培養(yǎng)至菌絲長滿平板，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為：馬鈴 薯200g/L+葡萄糖20g/L+瓊脂粉12g/L，pH值自然，從平板菌落邊緣取直徑為5mm的5塊 菌絲塊至50mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，產(chǎn)毒培養(yǎng)基配方為：KN0 310g/L+KH2P045g/L+MgS04 *711202. 5g/ L+Fe2 (S04) 30. 02g/L+蔗糖45g/L，pH值為6. 5, 27 °C暗培養(yǎng)15d，每天人工振蕩2次，15天 后將培養(yǎng)濾液加熱，產(chǎn)生的白色沉淀用濾紙過濾，在濾液中加入30g活性炭，4°C靜置吸附 12h，然后8500r/min離心15min，再將活性炭沉淀用等體積甲醇洗脫，洗脫液60°C下旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)濃縮，獲得的黃色漿狀物即為水稻紋枯病菌粗毒素；（2. 2)對選取的待改良粳稻品種/系 進行粗毒素耐力濃度鑒定：分別在分化培養(yǎng)基中加入一定梯度濃度的粗毒素提取液，然后 將步驟（1)中選定的待改良粳稻品種/系誘導培養(yǎng)的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移進分化培養(yǎng)基，分 化培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基+2mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA+梯度濃度粗毒素提取液且分化 培養(yǎng)基的pH值為6. 0,誘導培養(yǎng)30?40天后統(tǒng)計愈傷組織分化率，并選擇達到合適篩選壓 力水平濃度的粗毒素提取液作為三交F1雜交種花藥培養(yǎng)粗毒素選擇壓濃度，其中合適篩 選壓力水平濃度是指選定的待改良粳稻品種/系誘導培養(yǎng)的花藥愈傷組織在含有粗毒素 的分化培養(yǎng)基中的分化率為〇. 8%?1. 2%時的粗毒素濃度。
[0027] (3)雜交育種獲得三交F1雜交種： 將大田種植篩選的抗紋枯病秈稻抗源與廣親和材料秈粳架橋獲得雜交種F1，選取雜交 種F1的花藥再與待改良粳稻品種/系雜交獲取雜交種三交F1。
[0028] (4)對三交F1雜交種進行排秈培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)： 三交F1雜交種正季播種，選取健壯主穗花藥進行排秈培養(yǎng)基花藥誘導培養(yǎng)獲得花藥 愈傷組織，排秈培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+N6微量元素+N6有機質(zhì)+2mg/L2, 4-D+O. 5mg/ LNAA+0. 5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0. 8%植物凝膠，排秈培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;當三交F1雜 交種的花藥愈傷組織誘導率低于3%時，需將三交F1雜交種與粳稻親本回交獲得BC1F1雜 交種，BC1F1雜交種正季播種，選取健壯主穗重新進行排秈培養(yǎng)基花藥誘導培養(yǎng)，直至獲得 誘導率不低于3%的花藥愈傷組織，挑選直徑0. 4?0. 8cm的花藥愈傷組織接種于添加了選 擇壓濃度粗毒素的分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基配方為：MS無機鹽+MS有機物+蔗糖3%+瓊脂 0. 7%+KT2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+水解蛋白lg/L+選擇壓濃度粗毒素提取液且分化培養(yǎng)基的 pH值為5. 8,在溫度27?29°C、光14h/暗10h的條件下培養(yǎng)，獲得花培幼苗；待花培苗長 至2cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基配方為：l/2Ms大量+Ms微量+Ms 有機物+蔗糖3%+瓊脂0. 8%且生根培養(yǎng)基的pH值為5. 8,待花培苗長至8cm后移栽至周轉(zhuǎn) 箱壯苗，10?15天后移栽入大田。
[0029] (5)花培苗單株收種獲得花培家系，進一步農(nóng)藝性狀、紋枯病抗性篩選獲得改良的 梗稻新品系： 大田種植花培苗，單株收種獲得紋枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家系 進一步大田播種，以待改良粳稻品種/系親本為對照，篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且紋枯病抗 性得到改良的粳稻新品系。 實施例
[0030] (1)分別篩選W09557和特青作為粳稻育種親本和秈稻紋枯病抗源： 多年的育種實踐發(fā)現(xiàn)，育種主干品系W0955具有產(chǎn)量高、米質(zhì)比較優(yōu)良的特點，同時， W0955的株高兩年測定平均只有92. 8cm，全生育期僅有146天，感紋枯病，2011年正季取 W0955花藥接種于排秈培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，實驗發(fā)現(xiàn)W0955愈傷組織的誘導率高達48% (花藥培養(yǎng)操作步驟同前)，非常適合該技術(shù)路線的粳稻育種親本的要求。特青是對多地紋 枯病病區(qū)的多個紋枯病菌系表現(xiàn)高度抗性，是抗紋枯病育種的重要抗原之一。2011年特青 與矮桿廣親和粳稻02428雜交架橋，收獲雜種FI，2012年海南選取F1花藥再與W09557雜 交獲取雜交種三交F1。
[0031] (2)對W09557進行粗毒素耐性濃度的鑒定： 2011年對選取的W09557進行粗毒素耐力濃度鑒定，在分化培養(yǎng)基中加入5%、10%、 15%、20%、25%的粗毒素提取液，配制分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LNAA+梯度濃度粗毒素提取液，pH值6. 0,然后將步驟（1)中誘導培養(yǎng)的花藥 愈傷組織轉(zhuǎn)移進分化培養(yǎng)基，統(tǒng)計愈傷組織分化率。結(jié)果如下表：

【權(quán)利要求】
1. 一種秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：該育種新方法的步驟如 下： (1) 選取待改良粳稻品種/系和抗紋枯病秈稻抗源：選取農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/ 系并對選取的粳稻品種/系進行排秈培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng)，最終選定花藥愈傷組織誘導率高 于25%的粳稻品種/系作為待改良粳稻品種/系，選取農(nóng)藝性狀良好且含有紋枯病高抗基 因的秈稻品種/系作為抗紋枯病秈稻抗源； (2) 對選取的待改良粳稻品種/系進行粗毒素耐性濃度的鑒定：分別在分化培養(yǎng)基中 加入一定梯度濃度的粗毒素提取液，對步驟（1)中選定的待改良粳稻品種/系的花藥愈傷 組織進行分化培養(yǎng)，并選擇合適篩選壓力水平濃度的粗毒素提取液作為粳稻花藥培養(yǎng)粗毒 素選擇壓； (3) 雜交育種獲得三交F1雜交種：將大田種植篩選的抗紋枯病秈稻抗源與廣親和材料 秈粳架橋獲得雜交種F1，選取雜交種F1的花藥再與待改良粳稻品種/系雜交獲取雜交種三 交F1 ; (4) 對三交F1雜交種進行排秈培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)：三交F1雜交種正季播種，選取健壯主 穗花藥進行排秈培養(yǎng)基花藥誘導培養(yǎng)，獲得花藥愈傷組織，并挑選直徑〇. 4?0. 8cm的花藥 愈傷組織接種于添加了選擇壓濃度粗毒素的分化培養(yǎng)基，在溫度27?29°C、光14h/暗10h 的條件下培養(yǎng)，獲得花培幼苗，待花培苗長至2cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，待 花培苗長至8cm后移栽至周轉(zhuǎn)箱壯苗，10?15天后移栽入大田； (5 )花培苗單株收種獲得花培家系，進一步農(nóng)藝性狀、紋枯病抗性篩選獲得改良的粳稻 新品系：大田種植花培苗，單株收種獲得紋枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花培家 系進一步大田播種，以待改良粳稻品種/系親本為對照，篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且紋枯病 抗性得到改良的粳稻新品系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所述步 驟（1)中的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系是指產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、紋枯病抗性有待改良以及 株高不宜過高、生育期早熟或中熟的粳稻品種/系；抗紋枯病秈稻抗源是指產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu) 良、高抗紋枯病的秈稻品種/系。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所述步 驟（1)中選取的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系進行排秈培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng)的過程如下： (1. 1)取材與預處理：將選取的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系大田常規(guī)栽培，取葉枕距 為5?7cm、穗色呈淡黃綠色、花藥淡黃色且長度約為穎殼的1/3?1/2、孕穗不裂開的健壯 主穗為供試材料，保留2?3張葉片，75%酒精擦拭表面后，用濕毛巾包裹且外套塑料袋，置 4°C下低溫預處理3天； (1. 2)接種：預處理后，將含主穗的稻苞剪下，然后將該稻苞浸泡于75%的酒精中處理 3?4min，接著將該稻苞轉(zhuǎn)移于超凈工作臺中剝離主穗，進一步剝?nèi)⌒∷霝榇笮【鶆虻男?支梗，接下來用消毒過的紗布包裹小支梗后用濃度為〇. 1%的升汞滅菌l〇min，無菌水漂洗 3?4次，打開紗布晾干，最后用消毒過的剪刀剪開花藥上部，抖藥法接種花藥于排秈培養(yǎng) 基； (1. 3)誘導培養(yǎng)：將排秈培養(yǎng)基置于24?26°C的黑暗環(huán)境中誘導愈傷組織，30?40天 后在花藥的邊緣出現(xiàn)白-淡黃色的無定型細胞團，并在花藥接種培養(yǎng)50天后統(tǒng)計花藥愈傷 組織誘導率，選定花藥愈傷組織誘導率高于25%的農(nóng)藝性狀良好的粳稻品種/系作為待改 良梗稻品種/系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所述步 驟（1. 2)中的稻苞是指稻苞頂枕距為7cm至穗下節(jié)間上部0. 5cm的區(qū)域內(nèi)剪材獲得的部分， 且剝?nèi)〉男≈ЧＩ匣ㄋ帞?shù)量為15?25粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所 述步驟（1. 2)中的排秈培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+N6微量元素+N6有機質(zhì)+2mg/ L2, 4-D+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0? 8%植物凝膠，排秈培養(yǎng)基的pH值為 5. 8。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所 述步驟（2)中的粗毒素耐性濃度鑒定過程如下： (2. 1)粗毒素的制備：將混合紋枯病菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，27°C下培養(yǎng) 至菌絲長滿平板，從平板菌落邊緣取直徑為5mm的5塊菌絲塊至50mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，27°C 暗培養(yǎng)15d，每天人工振蕩2次，15天后將培養(yǎng)濾液加熱，產(chǎn)生的白色沉淀用濾紙過濾，在 濾液中加入30g活性炭，4°C靜置吸附12h，然后8500r/min離心15min，再將活性炭沉淀用 等體積甲醇洗脫，洗脫液60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，獲得的黃色漿狀物即為水稻紋枯病菌粗毒 素； (2. 2)對選取的待改良粳稻品種/系進行粗毒素耐力濃度鑒定：分別在分化培養(yǎng)基中 加入一定梯度濃度的粗毒素提取液，然后將步驟（1)中選定的待改良粳稻品種/系誘導培 養(yǎng)的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移進分化培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)30?40天后統(tǒng)計愈傷組織分化率，并選擇 合適篩選壓力水平濃度的粗毒素提取液作為三交F1雜交種花藥培養(yǎng)粗毒素選擇壓濃度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所述步 驟（2. 2)中的合適篩選壓力水平濃度是指選定的待改良粳稻品種/系誘導培養(yǎng)的花藥愈傷 組織在含有粗毒素的分化培養(yǎng)基中的分化率為〇. 8%?1. 2%時的粗毒素濃度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所 述步驟（2. 1)中的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g/L+葡萄糖20g/L+瓊 脂粉 12g/L，pH 值自然；產(chǎn)毒培養(yǎng)基配方為：KN0310g/L+KH2P045g/L+MgS0 4 ? 7H202. 5g/ L+Fe2(S04)30. 02g/L+蔗糖45g/L，pH值為6. 5 ;所述步驟（2. 2)中的分化培養(yǎng)基配方為：MS 基本培養(yǎng)基+2mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA+梯度濃度粗毒素提取液，分化培養(yǎng)基的pH值為6. 0。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所述步 驟（4)中的三交F1雜交種的花藥愈傷組織誘導率低于3%時，需將三交F1雜交種與粳稻親 本回交獲得BC1F1雜交種，BC1F1雜交種正季播種，選取健壯主穗重新進行排秈培養(yǎng)基花藥 誘導培養(yǎng)，直至獲得誘導率不低于3%的花藥愈傷組織，挑選直徑0. 4?0. 8cm的花藥愈傷 組織接種于添加粗毒素選擇壓的分化培養(yǎng)基，在溫度27?29°C、光14h/暗10h的條件下培 養(yǎng)，獲得花培幼苗，待花培苗長至2cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，待花培苗長至 8cm后移栽至周轉(zhuǎn)箱壯苗，10?15天后移栽入大田。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的秈粳交基因漸滲抗紋枯病育種新方法，其特征在于：所述步 驟（4)中的排秈培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+N6微量元素+N6有機質(zhì)+2mg/L2, 4-D+O. 5mg/ LNAA+0. 5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0. 8%植物凝膠，排秈培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;分化培養(yǎng)基 配方為：MS無機鹽+MS有機物+蔗糖3%+瓊脂0. 7%+KT2. Omg/L+NAAO. 5mg/L+水解蛋白lg/ L+合適篩選壓力水平濃度的粗毒素提取液，分化培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;生根培養(yǎng)基配方為： l/2Ms大量+Ms微量+Ms有機物+蔗糖3%+瓊脂0. 8%，生根培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
【文檔編號】A01H1/02GK104429932SQ201510000560
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2015年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月4日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:王開