小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因TaGBF及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因，是小麥體細胞雜種漸滲系山融3號堿性亮氨酸拉鏈蛋白基因TaGBF，該基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還公開了含有所述基因的植物表達載體pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF。本發(fā)明還公開了基因TaGBF及含有該基因的植物表達載體在培育耐鹽或耐旱植物中的應(yīng)用。實驗證明，本發(fā)明中的RNAi干擾系轉(zhuǎn)基因小麥的抗非生物脅迫能力明顯提高。
【專利說明】小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因 TaGBF及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小麥鹽、旱調(diào)控基因及其應(yīng)用，尤其涉及小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫 調(diào)控基因 TaGBF及其應(yīng)用，屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥是一種重要的糧食作物，中國小麥每年播種面積也達4. 3億畝以上，它的生 產(chǎn)狀況直接關(guān)系到中國經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，但是干旱、鹽漬等非生物逆境 嚴重影響其生長發(fā)育和產(chǎn)量，因此選育耐逆的小麥新品種，進而開發(fā)利用鹽漬化土壤，擴大 小麥類種植面積，提高單位產(chǎn)量，已成為當前一個十分迫切的任務(wù)。
[0003] 除了傳統(tǒng)育種方法外，利用基因工程和細胞工程等新技術(shù)可以快速穩(wěn)定地獲得具 有優(yōu)良抗逆能力的小麥新品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將新的抗逆相關(guān)功能基因轉(zhuǎn)入到小麥中， 以此高效開發(fā)抗逆轉(zhuǎn)基因小麥新品種，用于在干旱或鹽漬化地區(qū)種植是一項具有廣闊應(yīng)用 前景的技術(shù)。其前提是，必須較系統(tǒng)地了解小麥抗逆機制，分離高效的與抗逆相關(guān)的基因。
[0004] 多年來，有關(guān)植物抗逆機制方面的研宄已取得了較大的進展，克隆了與植物脅迫 相關(guān)基因，為進一步闡明植物抗旱的分子機制提供了理論線索和依據(jù)。一些實驗表明，將植 物本身以及其他生物中與抗逆相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入植物中，其異源轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物可以使轉(zhuǎn)基 因植物的抗逆能力發(fā)生改變。用于轉(zhuǎn)化的功能基因包括兩類：一類為與植物抗逆相關(guān)的功 能基因，通過過表達或者基因敲出的方法直接提高植物的抗逆能力；另一類是與植物抗逆 信號通路相關(guān)的調(diào)控基因，將這類基因在植物中表達同樣可以提高植物耐逆性，而且效果 可能更加明顯。
[0005] 目前，已發(fā)現(xiàn)了一些能顯著改變植物抗逆能力的基因，其中轉(zhuǎn)錄因子作為植物抗 逆信號通路中的樞紐，被越來越多的人所關(guān)注。研宄表明，將這些基因轉(zhuǎn)化到植物中，可以 明顯改變植物的抗性。
[0006] bZIP家族蛋白是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長，發(fā)育以及代謝過程中 均起到較為重要的作用，近年來已有試驗表明，許多bZIP蛋白參與植物對多種非生物脅迫 的響應(yīng)過程，調(diào)控與脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。但是有關(guān)bZIP家族G亞族的轉(zhuǎn)錄因子在鹽、旱 非生物脅迫響應(yīng)中的作用尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種小麥漸滲系bZIP基因即小麥漸 滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因 TaGBF及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所述的小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因 TaGBF，其特征在于：所述基 因為小麥體細胞雜種漸滲系山融3號堿性亮氨酸拉鏈蛋白基因 TaGBF，該基因 cDNA的核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了含有上述小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因 TaGBF的植物 表達載體，其特征在于：所述植物表達載體是pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或 pGA3426-RNAi-hph/TaGBF〇
[0010] 本發(fā)明所述的小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因 TaGBF在培育耐鹽或耐旱 植物中的應(yīng)用。進一步的，本發(fā)明所述含有基因 TaGBF的植物表達載體pSTART/TaGBF、 pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF在培育耐鹽或耐旱植物中的應(yīng)用。其 中，所述植物優(yōu)選是普通小麥或擬南芥。
[0011] 具體的，本發(fā)明從小麥體細胞雜種漸滲系山融3號中分離得到了一種小麥bZIP家 族G亞族基因 TaGBF (該基因 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示），以常規(guī)方法構(gòu)建 雙子葉植物表達載體pSTART/TaGBF轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，鑒定基因的功能，并進一步構(gòu)建 單子葉植物表達載體pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF轉(zhuǎn)化普通小麥 (揚麥20)，鑒定此基因在小麥抗逆中的作用。
[0012] 實驗證實，將本發(fā)明所述基因 TaGBF導(dǎo)入植物細胞，使其在植物中表達量降低就 可以使轉(zhuǎn)基因植物獲得耐鹽能力。進一步明確了所述基因 TaGBF在培育耐鹽植物中的應(yīng) 用。預(yù)示本發(fā)明成果可廣泛用于培育抗逆農(nóng)作物新品種，并為深入闡明植物抗逆機制提供 理論依據(jù)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了小 麥漸滲系山融3號應(yīng)答非生物脅迫新基因 TaGBF，并通過小麥生長點轉(zhuǎn)化法將該基因轉(zhuǎn)入 小麥，經(jīng)過比較分析證明，RNAi干擾系的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力明顯增強。有望為創(chuàng)造新 型耐鹽植物，提高植物耐鹽能力，改良作物品種提供有力的幫助。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖ITaGBF基因全長cDNA序列的擴增結(jié)果。
[0015] 圖2TaGBF在光、氯化鈉、聚乙二醇、脫落酸處理下山融3號中的實時定量qRT-PCR 分析。
[0016] 其中：Light是在光處理下的結(jié)果圖；NaCl是在氯化鈉處理下的結(jié)果圖；PEG是在 聚乙二醇處理下的結(jié)果圖；ABA是在脫落酸處理下的結(jié)果圖。
[0017] 圖3TaGBF轉(zhuǎn)基因擬南芥植株基因表達量的qRT-PCR鑒定。
[0018] 其中：WT :野生型對照；OX-17, OX-18, 0X-22 :過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥（下同）。
[0019] 圖4TaGBF轉(zhuǎn)基因擬南芥在含有NaCl、Mannitol (甘露醇）、ABA培養(yǎng)基上的萌發(fā)情 況。
[0020] 圖5TaGBF轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗1/2MS及在含有NaCl、Mannitol (甘露醇）、ABA培養(yǎng) 基上的生長情況。
[0021] 其中：A為在1/2MS培養(yǎng)基上的生長狀況，B為在含有NaCl的培養(yǎng)基上的生長狀 況，C為在含有甘露醇的培養(yǎng)基上的生長狀況，D為在含有ABA的培養(yǎng)基上的生長狀況。
[0022] 圖6TaGBF轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗逆相關(guān)Marker基因分析
[0023] 其中：ABAl, ABA2, NCED3均為ABA合成相關(guān)的Marker基因，ABI5為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 相關(guān)的Marker基因。
[0024] 圖7TaGBF轉(zhuǎn)基因小麥植株的qRT-PCR鑒定。
[0025] 其中：YangMai :揚麥；OE :小麥過表達系；RNA :小麥RNAi干擾系（下同）。
[0026] A圖是小麥過表達系的基因表達量檢測結(jié)果，B圖是小麥RNAi干擾系的基因表達 量檢測結(jié)果。
[0027] 圖8TaGBF轉(zhuǎn)基因小麥植株在200mM NaCl培養(yǎng)基上的生長情況。
[0028] 其中：YangMai :揚麥；OE :小麥過表達系；RNA :小麥RNAi干擾系。

【具體實施方式】
[0029] 實施例1、小麥山融3號TaGBF的克隆
[0030] I. 1植物材料的處理
[0031] 1)將小麥種子（山融3號）在4°C春化20天
[0032] 2)用70 %酒精處理種子2-3分鐘。
[0033] 3)棄去酒精，用無菌水洗3-5次，每次充分振蕩混勻。
[0034] 4)用無菌水浸泡種子，避光，25°C，40-60rpm/min，搖床孵育過夜。
[0035] 5)將種子正面向上，擺放在用無菌水充分潤濕的濾紙上，避光萌發(fā)。
[0036] 6)3天后將種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)籃中，l/2Hoagland，水培，置于23°C，長日照的培養(yǎng)間 生長至兩葉一心期。
[0037] 1. 2小麥RNA提取
[0038] 1)將超低溫凍結(jié)的30-50mg RNA提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽 中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，如果沒 有研磨徹底會影響RNA的收率和質(zhì)量）。
[0039] 2)將粉末狀RNA提取樣品小心而快速的轉(zhuǎn)移到液氮預(yù)冷的2ml離心管中，加入適 量的I. 5ml RNAiso Reagent，震蕩混勻，此時裂解液呈透明狀，室溫靜置5分鐘。
[0040] 3) 12, OOOg 4°C離心 5 分鐘。
[0041] 4)小心吸取上清液，移入新的2ml離心管中（切勿吸取沉淀）。
[0042] 5)加入氯仿（RNAiso Reagent的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用力震蕩（氯仿沸 點低、易揮發(fā)，振蕩時應(yīng)防止離心管蓋突然彈開）。待充分乳化溶液呈乳白狀（無分相現(xiàn)象） 后，再室溫靜置5分鐘。
[0043] 6) 12, OOOg 4°C離心 15 分鐘。
[0044] 7)從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，S卩：無色的上清液、中間的 白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管中（切忌 吸出白色中間層）。
[0045] 8)向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15?30°C下 靜置10分鐘。
[0046] 9) 12, OOOg 4°C離心10分鐘。一般在離心后，試管底部會出現(xiàn)白色沉淀。
[0047] 10)小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇I ml (切勿觸及沉淀），輕 輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12, OOOg 4°C離心5分鐘后小心棄去乙醇（為了更好地控制 RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇）。
[0048] 11)室溫干燥沉淀2?5分鐘（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解， 有關(guān)RNA溶解可以參考Troubleshooting中的相關(guān)說明），加入適量的RNase-free水溶解 沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后用于后續(xù)試驗或于-80°C保 存。
[0049] 12) RNA質(zhì)量檢測：a)通過測定0D260、0D280、0D230的吸收值計算RNA的含量及 純度；b) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解；c) RNA直接進行PCR檢測是否存在DNA污 染。
[0050] I. 3cDNA第一鏈的快速擴增
[0051] DMicrotube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6 μ 1。
[0052] 模板 RNA (total RNA) 5 μ g
[0053] Oligo (dT) 18primer (50 μ Μ) 1 μ 1
[0054] RNase free dd H2O Up to 13. 5 μ I
[0055] 2) 70°C保溫10分鐘后迅速在冰上急冷2分鐘以上。
[0056] 3)離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物的變性溶液聚集于Microtube管底部。
[0057] 4)在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
[0058] 上述模板RNA/引物變性溶液 13.5μ1 5XM-MLV buficr 4μ1 dNTP Mixturc(^lOnM) Ιμ? RNase inhibitor (4〇υ/μΙ) ().5μ1 Rtasc M-MLV ( RNasc H-) (20〇υ/μ1) Ιμ?
[0059] 5)42。〇保溫1小時。
[0060] 6) 70°C保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA 的合成或者PCR擴增等，PCR擴增時cDNA溶液的使用量建議使用1 μ 1?5 μ 1。
[0061] 1.4TaGBF 的克隆
[0062] 1)根據(jù)基因芯片的檢測結(jié)果，獲得TaGBF的部分序列。
[0063] 設(shè)計兩對基因特異引物（序列如下）：
[0064] TaGBFS :5,ATGGCGCATGATGAAGC 3，
[0065] TaGBFA :5' TCAGTTTGCAGCCACGAC 3'
[0066] 2)以山融3號全長cDNA文庫為模版，利用上述引物克隆獲得TaGBF基因全長序 列。
[0067] I. 5TaGBF 的 PCR 擴增
[0068] 1)引物序列：見1.3部分。
[0069] 2) PCR 反應(yīng)體系（20 μ L):
[0070] IOxbuITcr 2μΙ 模板（第一鏈cDNA產(chǎn)物） 1μ1 dNTPs (2.OrnM each) 0.5μ? Primcrl (5μΜ) Ιμ?. Primcr2 (5μΜ) Ιμ? I'n'ij^Vi-TaqlVj； (STRATAGEN, Cat No： 600380) 0.5μ1 CldH2O 14μ1
[0071] 3)?0?反應(yīng)程序為：94°0預(yù)變性51^11;94°0變性3〇86(3,55°0復(fù)性3〇86(3,72°0延伸 lmin，循環(huán) 35 次；72°C延伸 7min。
[0072] 4)擴增片段的回收后與T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、選取陽性克隆測序。
[0073] 結(jié)果見圖1。
[0074] 實施例2、TaGBF的表達分析
[0075] 2. 1脅迫下RNA的提取
[0076] 山融3號種子正常萌發(fā)，Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)至兩Pi心期時（約3周時間）開 始進行干旱（18% PEG)、鹽脅迫（200mM NaCl)、冷、ABA處理。處理不同時間后，Trizol法 提取幼苗根、葉RNA同上1. 2所述。
[0077] 2. 2逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
[0078] 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA同上1. 3所述。
[0079] 2. 3qRT_PCR 反應(yīng)
[0080] 1)以cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)。引物如下：
[0081] qRTs ：TGAGACAGAGGAATTGGCCACAC
[0082] qRTa ： CAACTGCTGATTTGTCCAGAGGC
[0083] PCR 體系：
[0084] ddH20 12.6μ1 I OxTaq bulTcr ( Mg2+) 2μ1 qRTs (5μΜ) Ιμ? qRTa (5μΜ) Ιμ? dNTP (2mMcach) Ιμ? Taq polymerase C SU/μΙ) 0.2μ1 模板（逆轉(zhuǎn)錄cDNA) Ιμ? Toial Volume 20μ1
[0085] 2) qRT-PCR 程序：
[0086] 95〇C 5min ；40cycles 95〇C 15s,60〇C 15s, 72〇C 20s〇
[0087] 結(jié)果見圖2。
[0088] 實施例3、雙子葉植物表達載體的構(gòu)建
[0089] 植物表達載體pSTART是含有35S啟動子和NPT II基因的雙元載體，在其多克隆位 點上含有限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI的識別位點。據(jù)此在目的基因起始密碼上游和終止密 碼下游設(shè)計含BamHI和SacI識別序列的引物，用高保真Taq酶擴增目的基因，體系同1. 4。
[0090] 用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI對載體pSTART和目的基因擴增產(chǎn)物片斷分別進行 酶切。完全酶切的載體在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經(jīng)膠回收，與酶切的目的基因擴增 片段相連。
[0091] 酶切體系，
[0092] 1)質(zhì)粒或基因擴增產(chǎn)物BamHI和SacI雙酶切
[0093] I OxBuiTcr Ιμ? 質(zhì)?；蚧驍U增產(chǎn)物 1 -2μΙ BamHI 丄 μι Sad Ιμ? 加 ddH20至總體積 20μ1
[0094] 于37°C恒溫水浴鍋酶切2小時以上。將酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。在紫 外透射儀下用潔凈刀片切下PSTART大片段和目的基因條帶，回收。
[0095] 2)經(jīng)酶切的載體片段和目的基因片段以摩爾比1:4的比例進行16°C連接過夜。
[0096] 3)連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化菌在含Kan 50 μ g/ml的 LB固體平板上37°C培養(yǎng)16小時左右。
[0097] 4)重組子的鑒定
[0098] A.載體特異引物的合成
[0099] 為了鑒定目的基因的插入方向，根據(jù)35S啟動子序列設(shè)計一個載體特異引物，序 列如下：GTT GGG GTT TCT ACA GGA CGT [0100] B.重組質(zhì)粒的PCR驗證
[0101] 挑取在kan培養(yǎng)基上的抗性單菌落分別接種于5ml含Kan的LB液體培養(yǎng)基中 37°C振蕩培養(yǎng)過夜，堿變性法提取質(zhì)粒，用載體特異引物和基因的下游引物進行PCR擴增， 體系同1.5。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94°C 5min，35個循環(huán)為：94°C 30sec，55°C 30sec， 72°C lmin，最后，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0102] C.質(zhì)粒酶切鑒定
[0103] 提質(zhì)粒進行BamHI和SacI酶切，酶切體系同上。1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否含 有預(yù)期分子量大小的片段，驗證載體的正確構(gòu)建。
[0104] 實施例4、單子葉植物表達載體的構(gòu)建
[0105] 植物表達載體 pCambia3626-bar/TaGBF 和 pGA3426-RNAi-hph/TaGBF 是含有 ubiquitin啟動子表達載體。
[0106] pCambia3626-bar/TaGBF 的構(gòu)建：在 pCambia3626-bar/TaGBF 多克隆位點上含有 限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI的識別位點。據(jù)此在目的基因起始密碼上游和終止密碼下游設(shè) 計含BamHI和SacI識別序列的引物，用高保真Taq酶擴增目的基因，用限制性內(nèi)切酶BamHI 和SacI對載體pCambia3626-bar/TaGBF和目的基因擴增產(chǎn)物片斷分別進行酶切。完全酶 切的載體在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經(jīng)膠回收，與酶切的目的基因擴增片段相連。轉(zhuǎn) 化大腸桿菌感受態(tài)，用載體上的引物ccctgccttcatacgct和基因下游引物進行PCR鑒定，用 BamHI和SacI進行酶切驗證，相關(guān)方法同實施例3。
[0107] pGA3426-RNAi-hph/TaGBF的構(gòu)建：用末端含有KpnI酶切位點GGGGTACC的引物擴 增基因序列，將擴增獲得的序列及PGA3426用KpnI進行酶切、回收后，連同氨芐抗性基因 (由PGA3720用SmaI進行酶切、回收獲得）在16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，用引 物ccctgccttcatacgct和ggcaactatggatgaacgaaat進行PCR及測序鑒定，相關(guān)方法同實施 例3〇
[0108] 實施例5、農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
[0109] 5. 1農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)的制備
[0110] 1)從YEP平板（含50 μ g/ml利福平）上挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于含50 μ g/ ml 〇
[0111] 2)利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，SOOrpm/min，28°C培養(yǎng)過夜。
[0112] 3)取2ml過夜培養(yǎng)液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中在相同條件 下培養(yǎng)至OD 6tltl達0· 5 〇
[0113] 4)菌液冰浴 30min，4°C，5000rpm 離心 lOmin，收集菌體。
[0114] 5)將菌體重懸于冰浴的IOml 0· 15mol/L的NaCl中，離心收集菌體。
[0115] 6)再懸浮于Iml 20mmol/L冰預(yù)冷的CaC12溶液中，以200 μ 1/管將菌液分裝在 I. 5ml 〇
[0116] 7)Eppendorf管中，置液氮中速凍lmin，-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0117] 5. 2凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105
[0118] 1)在室溫下融化兩管農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，分別加入Iyg表達載體質(zhì)粒DNA和 1 μ g空載體，混勾后冰浴30min。
[0119] 2)置液氮速凍lmin，迅速移至37°C溫浴3min。
[0120] 3)加入無抗生素的YEP 800 μ 1，28 °C震蕩培養(yǎng)3hr。
[0121] 4) 7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的YEP平 板上，28°C倒置暗培養(yǎng)2-3天。
[0122] 5. 3菌體PCR鑒定
[0123] 菌體PCR方法及程序同上1. 5所述。
[0124] 實施例6、擬南芥轉(zhuǎn)化及篩選
[0125] 6.1擬南芥種植
[0126] 取擬南芥（哥倫比亞野生型）種子，置于墊有濾紙的平皿內(nèi)，用少量蒸餾水潤濕 濾紙，于4°C冰箱進行春化處理，3-5天后播種于育苗盤內(nèi)，放置于人工氣候箱內(nèi)（16h光照， 22°C /8h黑暗，18°C )，生長6 - 8周后，待抽苔開花時用于轉(zhuǎn)化。
[0127] 6. 2擬南芥轉(zhuǎn)化
[0128] 1)轉(zhuǎn)化前一天，取2ml活化的農(nóng)桿菌加到含相應(yīng)抗生素的200ml YEP培養(yǎng)基中，過 夜培養(yǎng)至 OD6qq= 1.0-1. 2。
[0129] 2)離心收集菌體，并重懸于浸染液（5%蔗糖，0.04% Silwet L-77)中，使OD6tltl = 0· 8〇
[0130] 3)將花序浸入浸染液30秒，其間前后擺動花序，使花序上形成一層膜。
[0131] 4)用保鮮膜覆蓋花序，暗培養(yǎng)一天后揭去保鮮膜，繼續(xù)置人工氣候箱使其生長。
[0132] 5)隔5-7天再用相同的方法浸染一次。
[0133] 6)大約一個月后收獲種子。
[0134] 7)空載體的轉(zhuǎn)化同樣采用6. 2所述方法。
[0135] 6. 3擬南芥轉(zhuǎn)化陽性株系篩選
[0136] 1)收獲的TO代種子消毒后（75%乙醇5min，清潔劑洗滌10-15min，無菌水沖洗 3 - 5次），鋪于含50 μ g/mL Kan的MS篩選培養(yǎng)基上。
[0137] 2) 4°C春化48h，移到培養(yǎng)室（16h光照/8h黑暗，22°C恒溫）生長7-10天。將抗性 綠色小苗移到土中繼續(xù)生長。
[0138] 3)等植物絕大多數(shù)花苞已經(jīng)結(jié)莢時，用小繩將植物單株綁起，以便單株收獲Tl代 種子。
[0139] 4)重復(fù)步驟1) 一 3)，將單株收獲的Tl代種子繼續(xù)在含卡那的MS培養(yǎng)基上進行篩 選，挑選抗性比為3:1的單插入獨立株系移栽，并單株收獲種子得到T2,繼續(xù)重復(fù)步驟1) 一 3)，直至T2代單株種子在卡那抗性培養(yǎng)基上不再分離，至此得到純合的T2代植株用于后續(xù) 的進一步研宄?？蛰d體純合體的篩選同樣采用6. 3所述方法。
[0140] 5)提取空載體對照及不同轉(zhuǎn)基因株系的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0141] 6)PCR擴增：以上述不同材料的第一鏈cDNA為模板，進行qRT-PCR驗證表明， TaGBF在轉(zhuǎn)化植株中正常表達。結(jié)果見圖3。
[0142] 實施例7、轉(zhuǎn)TaGBF擬南芥的抗性分析
[0143] 7. 1萌發(fā)抗性分析
[0144] 將空載體對照、轉(zhuǎn)TaGBF的過表達擬南芥種子經(jīng)消毒（方法同上6. 3. 1所述）后， 鋪入1/2MS及含150mM NaCl, 200mM Mannitol及0· 5 μΜ ABA的MS培養(yǎng)培養(yǎng)基中萌發(fā)，觀 察不同株系的萌發(fā)差異，結(jié)果見圖4 ;
[0145] 7. 2擬南芥幼苗抗性分析
[0146] 1)將空載體對照、轉(zhuǎn)TaGBF的過表達擬南芥種子經(jīng)消毒（方法同上6. 3. 1所述） 后，鋪入1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)；
[0147] 2)將萌發(fā)7 天的幼苗轉(zhuǎn)移至含 150mM NaCl，200mM Mannitol 及 3 μΜ ABA 的 1/2MS 培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng)，觀察幼苗生長差異。以不含任何脅迫成分的MS培養(yǎng)基為對照結(jié)果見圖 5〇
[0148] 7. 3轉(zhuǎn)TaGBF擬南芥幼苗中抗逆相關(guān)Marker基因分析
[0149] 1)擬南芥種子消毒、萌發(fā)、培養(yǎng)（方法同上6. 3.1所述）；
[0150] 2)將萌發(fā)后3天的對照及轉(zhuǎn)基因株系樣品，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，進行 qRT-PCR分析。方法同實施例2，結(jié)果見圖6。
[0151] 實施例8、小麥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選
[0152] 8. 1小麥種子的萌發(fā)
[0153] 1)取飽滿完好的小麥種子進行滅菌，用70%乙醇浸泡30sec，再用0. 1%取(：12浸 泡15min。浸泡期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底，然后用無菌水沖洗4-5次。
[0154] 2)滅菌后種子放在無菌的培養(yǎng)皿中，加適量無菌水15_35°C黑暗條件下萌發(fā)。
[0155] 8. 2小麥的轉(zhuǎn)化
[0156] 1)轉(zhuǎn)化前一天，取2ml活化的農(nóng)桿菌加到含相應(yīng)抗生素的200ml YEP培養(yǎng)基中，過 夜培養(yǎng)至 OD6qq= 1.0-1. 2。
[0157] 2)離心收集菌體，并重懸于浸染液（含0. 2% AS)中，使OD6qq= 0. 8。
[0158] 3)用刀片剝離備用黃化苗的胚芽鞘及幼葉使之暴露莖尖生長點，并用解剖針尖輕 微挫傷其生長點細胞。
[0159] 4)將配制好的菌體浸染液用Iml注射器緩慢滴加在無菌苗露出的生長點頂端，浸 泡并緩慢滲入。
[0160] 5)黑暗條件下，溫度控制在17-28°C共培養(yǎng)2-4d，至植株頂端重新長出新葉。
[0161] 6)將植株用清水洗掉菌體，移栽到裝有滅菌蛭石的花盆中，保持適宜溫度 (18_23°C )和濕度，最后將存活植株溫室盆栽。
[0162] 8. 3小麥轉(zhuǎn)化陽性株系篩選
[0163] DCTAB法提取小麥的基因組DNA，載體引物和基因下游引物進行PCR擴增檢測
[0164] 2)陽性植株收獲的Tl代種子種植后長出幼苗，繼續(xù)進行基因組PCR檢測，至T2 代。
[0165] 3)提取野生植株和轉(zhuǎn)基因植株的RNA進行real-time PCR檢測，結(jié)果見圖7.
[0166] 實施例9、轉(zhuǎn)TaGBF小麥耐鹽性分析
[0167] 將對照、兩個株系的轉(zhuǎn)TaGBF小麥種子經(jīng)消毒（方法同上6. 3. 1所述）后，萌發(fā)， 之后轉(zhuǎn)移至在Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)10天，方法見I. 1 ;
[0168] 在第 11、12、13、14 天，分別將培養(yǎng)液更換為含有 50mM、100mM、150mM、200mM NaCl 的l/2Hoagland培養(yǎng)液，此后繼續(xù)使用含200mM NaCl的l/2Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)小麥4天， 觀察小麥表型。對照組小麥始終使用l/2Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0169] 結(jié)果見圖8。·
【權(quán)利要求】
1. 一種小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因 TaGBF，其特征在于：所述基因為小麥體 細胞雜種漸滲系山融3號堿性亮氨酸拉鏈蛋白基因 TaGBF，該基因 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
2. 含有權(quán)利要求1所述基因的植物表達載體，其特征在于：所述植物表達載體是 pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF 或 pGA3426-RNAi-hph/TaGBF〇
3. 權(quán)利要求1所述小麥漸滲系應(yīng)答非生物脅迫調(diào)控基因 TaGBF在培育耐鹽或耐旱植物 中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求2所述植物表達載體pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或 pGA3426-RNAi-hph/TaGBF在培育耐鹽或耐旱植物中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物是普通小麥或擬南芥。
【文檔編號】A01H5/00GK104498508SQ201510015952
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月13日
【發(fā)明者】夏光敏, 孫揚, 賈月玢, 徐偉 申請人:山東大學(xué)