專利名稱：：一種轉錄因子蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種轉錄因子蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：轉錄因子是生物體內與基因啟動子區(qū)順式作用元件相結合、調控該基因表達的蛋白質。它們在生物的生命活動中起著非常重要的作用，不僅參與了生物體的生長、發(fā)育，同時也調控著生物體對外界逆境如干旱、高鹽、低溫、病原物侵染等的應答反應。1994年，Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在對擬南芥逆境應答基因r必劃啟動子區(qū)域的研究中，發(fā)現(xiàn)了一個逆境脅迫應答順式作用元件，即干旱應答元件(DRE，drought-responsiveelement)。1998年，劉強等運用酵母單雜交方法(yeastone-hybridmethod)克隆出與該DRE元件結合的反式作用因子編碼基因，艮卩干旱應答元件結合蛋白(DREB，drought—responsiveelementbindingprotein)基因。該DREB基因表達的產物與順式作用元件DRE結合后，可激活一系列與植物抗性相關基因的表達。自從對DREB類轉錄因子的研究工作開展以來，對其結構和功能的研究及其在植物遺傳改良上的應用研究已成為生物化學及分子生物學等領域研究的熱點。目前已發(fā)現(xiàn)植物中許多逆境應答基因啟動子區(qū)域含有DRE元件；DREB類轉錄因子在植物中普遍存在，是植物中特有的調控對外界干旱、高鹽、低溫等逆境的應答反應的轉錄因子，具有巨大的潛在應用價值。.在水資源日益短缺的當今世界，大量培育耐旱節(jié)水高產優(yōu)質的農作物新品種是解決糧食危機、實現(xiàn)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的最有效方式。小麥是世界上的重要糧食作物，是我國第三大糧食作物，對我國糧食安全、民生和可持續(xù)發(fā)展有著至關重要的意義。在我國由干旱引起的小麥減產常年達到15%以上，干旱是首要的減產因子。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種轉錄因子蛋白及其編碼基因，該蛋白能與DRE元件特異結合。本發(fā)明所提供的蛋白，來源于歐山羊草"e^7oAs/^/"cisJA)，是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白質。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標簽。表l標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。所述蛋白的編碼基因為如下l)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2中自5'末端第1-768位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；3)在嚴格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；所述嚴格條件可為在0.1xSSPE(或O.lxSSC)，0.P/。SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。4)與l)或2)限定的DNA序列具有95X以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。序列表中SEQIDNq:2所示的DNA長度為945bp，其中，自其5，端的第1-768位核苷酸為編碼序列(開放閱讀框架)，自5'端第127到第300位核苷酸為EREBP/AP2保守結構域的編碼序列，編碼58個氨基酸，其3'端的非翻譯區(qū)長度為177bp;該基因的蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQIDNs:l所示，由255個氨基酸殘基組成，該蛋白具有DREB蛋白家族的特征，其中自N端第43-100位為EREBP/AP2保守結構域。將歐山羊草的DREB基因命名為^e/^處X編碼蛋白命名為AebDREB。擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對具體可為如下1)、2)或3)所示的引物對-1)一條引物的序列如序列表中序列3所示，另一條引物的序列如序列表中序列4所示；此引物對可用于擴增基因的全長；2)—條引物的序列如序列表中序列3所示，另一條引物的序列如序列表中序列5所示；此引物對可用于擴增基因的編碼區(qū)；3)—條引物的序列如序列表中序列6所示，另一條引物的序列如序列表中序列7所示；此引物對可用于擴增基因的3'末端區(qū)。含有上述任一所述基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體可為在載體YEpGAP112的多克隆位點插入序列表中序列2中自5'末端起第1-768位所示核苷酸序列得到的重組載體；所述重組菌是可以通過將上述任一種重組載體導入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母得到的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗逆性植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗逆性植物的方法，是將上述任一所述基因導入植物中，培養(yǎng)得到抗逆性植物。所述基因可以通過重組載體導入植物。所述抗逆性可為抗低溫和/或抗干旱。所述植物具體可為歐山羊草"ew7oASZ;iw7ci3hs)。本發(fā)明的轉錄因子具有DREB類轉錄因子家族共有的特征具有一個含有58個氨基酸的EREBP/AP2保守區(qū)。酵母單雜交實驗證明該轉錄因子具有轉錄激活功能。此外實驗還表明^eZ^A^^基因明顯受干旱和低溫的誘導表達。所以該轉錄因子，可與多個逆境應答基因啟動子共有的DRE調控元件特異結合，調控這些基因的表達，從而激活植物體內的多種抗逆機制，提高抗逆能力。本發(fā)明的轉錄因子AebDREB可同時激活一系列抗性相關基因的表達，克服了傳統(tǒng)植物抗逆基因工程中用單個功能基因提高抗逆性的局限性，使植物抗逆特性的大幅度提高成為可能。因此本發(fā)明轉錄因子為基因工程改良植物耐逆性提供了一條新的技術途徑，尤其在小麥等農作物抗逆性的綜合改良過程中具有廣泛的應用前景和巨大的經濟價值。圖1為不同脅迫處理下歐山羊草總RNA的瓊脂糖凝膠檢測結果。圖2為不同脅迫處理下歐山羊草Je6"必WRT-PCR產物的瓊脂糖凝膠檢測結果。圖3為不同脅迫處理下歐山羊草^;/wA7RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠檢測結果。圖4為0mM3-AT條件下，歐山羊草^WZW^^酵母單雜交功能鑒定結果。圖5為40mM3-AT條件下，歐山羊草JeZ;/MXS酵母單雜交功能鑒定結果。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從生物公司購買。實施例l、蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)1、歐山羊草Je/;/yffi^基因的分離，具體包括如下步驟1)將歐山羊草"e^7op5&'朋"^/50種子(購自中國農業(yè)科學院)浸泡于1%次氯酸鈉溶液中消毒20分鐘后，用無菌水洗三遍，播于1/2MS固體培養(yǎng)基(pH5.8)中，在22'C、16小時/8小時(光/暗)的條件下培養(yǎng)14天后，取幼苗洗凈，將其置于超凈工作臺上自然風干4小時，隨后用液氮速凍，保存于-8(TC冰箱用于總RNA的提取。2)用Trizol法(Trizol購于天根公司)提取步驟1)保存的受脫水脅迫4小時的歐山羊草植株的總RNA，經DNA酶I處理后備用。3)用oligo(dT)引物和麗LV反轉錄酶(Promega公司產品)將步驟2)的總RNA反轉錄成cDNA。oligo(dT)引物序列為5'-ACTCTATGAGAATTCGATGAGCGATCTGtttttttttttttttttt—3'。反應體系及參數(shù)為(RNaseFreeH20l扭l5XMMLVbuffer5l4dNTP(lOraMeach)1.{核糖核酸酶抑制劑(40U/W)lri亂V(200UM)Moligo(dT)(IO幽)kTotalRNA(2^g/W)反應條件為42°C90分鐘，75°C10分鐘。反轉錄產物存于-2(TC待用。4)根據(jù)已報道的DREB基因的AP2/EREBP保守區(qū)序列設計一個兼并引物，引物序列為引物l(正向引物):5'-G(C/a)CGC(C/t/g)TGCCTCAACTTC-3';以步驟3)中的cDNA為模板，在引物l和oligo(dT)(反向引物)的引導下，用PCR方法擴增得到歐山羊草DREB基因的3'-末端；其中，,SteriledistilledH2013.則10XPCRBuffer2.5)4dNTP(2mMeach)2.乂Taq0.引物1(2MM)2.oligo(dT)(2幽)2.5^1(cDNA反應體系及參數(shù)94°C5分鐘；反應條件94°C30秒，62°C30秒，72°C60秒，進行35個循環(huán)；、72°C10分鐘。PCR產物經純化回收后克隆到T載體(Promega公司產品)中，挑陽性克隆送到諾賽公司測序，得到歐山羊草DREB基因的3，-末端cDNA序列。5)將步驟4)獲得的歐山羊草DREB基因的3，-末端cDNA序列送到基因庫進行blast,與已報道的DREB基因序列進行序列比對，從中找出相似性高的基因序列；以這些序列為基礎，在其5'-末端和3'-末端分別設計基因特異引物，引物序列為引物2(正向引物):5'-ATGGACGTCGCCGACATC-3'，引物3(反向引物):5'-CCCTTTTCCCCAAAACTAGAAACC-3';以步驟3)中的cDNA為模板，在引物2和引物3的引導下，用步驟4)的PCR反應體系及反應條件擴增得到歐山羊草DREB基因的全長cDNA序列。將得到的歐山羊草DREB基因的全長cDNA序列克隆測序，得到如序列表中SEQIDNQ:2所示的核苷酸序列，該序列長度為945bp，3'端的非翻譯區(qū)長度為177bp，其編碼序列(開放閱讀框架)長度為768bp，是自SEQIDN2:2的5'端的第1-768位堿基，其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDN2:l所示，具有255個氨基酸殘基的蛋白質。將歐山羊草的DREB基因命名為力W/M^及編碼的蛋白命名為AebDREB。對AebDREB進行生物信息學分析，結果表明AebDREB具有DREB蛋白家族的特征，其中自N端第43-100位為EREBP/AP2保守結構域。2、冷、干旱和鹽誘導處理下^eMW^9基因的表達模式1)分別對實驗1中培養(yǎng)的歐山羊草幼苗進行冷誘導、干旱誘導和鹽誘導處理，處理方法如下1)冷誘導處理歐山羊草幼苗置于4'C光照培養(yǎng)箱處理,其根部置于蒸餾水中；2)干旱誘導處理歐山羊草幼苗置于超凈工作臺上風干處理，濕度為50%;3)鹽誘導處理歐山羊草幼苗的根部置于250mMNaCl溶液中進行處理；分別于處理后O、1、2、4、8和24小時對經上述不同方法誘導處理的歐山羊草幼苗間隔取樣，然后將樣品立即用液氮速凍，-8(TC保存用于提取總RNA。用Trizol法(Trizol購于天根公司)提取上述不同樣品的總RNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對不同樣品的總RNA進行檢測，檢測結果如圖1A，B，C所示(A為冷處理，B為干旱處理，C為鹽處理；泳道0、1、2、4、8和24分別表示第0、1、2、4、8和24小時采集的樣品的總RNA)。2)用RT-PCR法分析冷、干旱、鹽誘導條件下^eM^ffi^基因的表達模式分別以步驟l)提取的不同樣品的總RNA為模板，在引物2(正向引物)5'-ATGGACGTCGCCGACATC-3'，和引物4(反向引物)5'-GCTAAATTAGTCGAACAAGCAGCTCC-3'的引導下，用One-st印realtimeRT-PCRkit(TaKaRa)進行RT-PCR反應，檢測在冷、干旱和鹽誘導條件下^eZ^yfi^的表達模式，并在引物5(正向引物)5'-ACCGCCAGCTCTTCCACCCT-3'和引物6(反向引物)5'-TCACTGGGGCATAGGAGGAA-3'引導下，用同樣的參數(shù)條件及反應條件下PCR擴增歐山羊草的看家基因微管蛋白tubulin基因(內參)，RT-PCR反應體系為RNaseFreeH2010.5Hl，10XOnest印RNAPCR緩沖液2.5W，dNTP混合物(各10mM)2.5W，MgCl2(25mM)5W，RNaseInhibitor(40U/W)0.5W，M-MLVRTase(25幽)0.5W，TaKaRaExTaqHS(5U/W)0.5(4，引物2和引物4(各IO幽)各1|4，總RNA1Pg;反應條件先50。C30分鐘，94°C2分鐘；再94°C30秒，58°C30秒，72°C60秒，進行22個循環(huán)；最后72°C5分鐘。將PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2A，B，C和圖3A,B，C所示。(圖2和圖3中，A表示受冷誘導處理的歐山羊草，B表示受干旱誘導處理的歐山羊草，C表示受鹽誘導處理的歐山羊草，泳道0、1、2、4、8和24分別表示第0、1、2、4、8和24小時采集的樣品的RT-PCR產物，圖2示目的條帶，圖3示tubulin基因)結果表明基因JeZ^y^S受低溫和干旱誘導表達。實施例2、蛋白及其編碼基因的功能1、基因JeZ^^S的制備1)以實施例1中基因Je/^^^的全長cDNA序列為模板，在引物2和引物4的引導下，用高保真PfuDNA聚合酶(Pr咖ega公司)通過PCR法獲得^^^fi^的編碼區(qū)；其中，r10XPfuPCRbufferdNTP(2.5mM)糾PfuDNA聚合酶(2.5,)反應體系及參數(shù)k引物2(10I4O引物4(IO幽)模板DNAU10ngAa)1^1、H20(滅菌超純水)35(4,94°C5分鐘反應條件吣94°C30秒/58°C30秒，/72°C、72°C10分鐘(Promega公司)72°C80秒(30次循環(huán))2)將步驟1)獲得的^eZ^^^的編碼區(qū)片段克隆到載體pGEM-T(Promega公司)上，獲得重組載體，經測序檢測無誤后，用限制性內切酶SacII和PstI從重組載體上切下Je6Zy^"的編碼區(qū)片段，并將其與用相同酶酶切的YEpGAP112(ATCC公司)連接獲得重組載體，命名為/(eZ^/ffi^/YEpGAP112，測序進行驗證，結果表明載體構建正確，插入載體YEpGAP112的SacII和PstI位點間的基因序列為序列表中序列2中自5'末端起第1-768位核苷酸，獲得陽性重組載體。將陽性重組載體加似W朋/YEpGAP112分別轉化到含雙報道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株YM4271(LiuQ，KasugaM,SakumaY,AbeH，MiuraS,Yamaguchi-ShinozakiK,ShinozakiK，PlantCell,1998，10(8):1391-1406，)(中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所)和含突變型DRE元件酵母菌株YM4271(LiuQ,KasugaM,SakumaY,AbeH,MiuraS,Yamaguchi-ShinozakiK,ShinozakiK，PlantCel1,1998，10(8):1391-1406，)(中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所)中，再將轉化有重組載體Je/^A^萬/YEpGAP112的重組酵母菌株涂于含有3-AT(濃度分別為0mM，40raM)的SD-Agar三缺固體培養(yǎng)基(His—，Leu—，Ura—，Clontech公司)上檢測其生長情況。同時以含擬南芥"^aW的重組載體"7^fi57Z/YEpGAPl12(LiuQ，KasugaM,SakumaY,AbeH,MiuraS，Yamaguchi-ShinozakiK,ShinozakiK，PlantCell,1998,10(8):1391-1406，)為對照，將其分別轉化到含雙報道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株YM4271和含突變型DRE元件酵母菌株YM4271中，再將轉化有重組載體"7K^W/YEpGAPl12的重組酵母菌株分別涂于含有3-AT(濃度分別為OmM,40mM)10的SD-Agar三缺固體培養(yǎng)基(His—，Leu—，Ura—，Clontech公司)上檢測其生長情況。結果如圖4-5所示。1為擬南芥"7ffi^X4在含野生型DRE元件酵母中；2為^6/Vffi^基因在含野生型DRE元件酵母中；3為野生型酵母對照；4為擬南芥"vffiSW基因在含突變型DRE元件酵母中；5為^似W^^基因在含突變型DRE元件酵母中；6為突變型酵母對照。結果表明含AebDREB和野生型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培養(yǎng)基上生長良好，而含AebDREB和突變型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培養(yǎng)基上不能生長。說明AebDREB可特異結合DRE元件，從而激活下游目的基因的表達，具有調控歐山羊草抗逆性應答的功能。序列表<160〉7〈210>1<211>255<212>PRT<213>山羊草屬歐山羊草"egz7o;w6/w"c/afc)<400〉1MetAspValAlaAsplieAlaSerProSerAlaGinGinValGinGly151015HisArgThrValSerSerGluProProLysArgProAlaGlyArgThr202530LysPheHisGluThrArgHisProLeuTyrArgGlyValArgArgArg354045GlyArgValGlyGinTrpValCysGluValArgValProGlylieLys505560GlySerArgLeuTrpLeuGlyThrPheAsnThrAlaGluMetAlaAla65707580ArgAlaHisAspAlaAlaValLeuAlaLeuSerGlyArgAlaAlaCys859095LeuAsnPheAlaAspSerAlaTrpArgMetLeuProValLeuAlaAla100105110GlySerPheGlyPheGlySerAlaSerGlulieLysAlaAlaValAla115120125ValAlaValValAlaPheGinArgLysGinlielieProValAlaVal130135140AlaValValAlaLeuGinLysGinGinValProValAlaValAlaVal145150155160ValAlaLeuGinGinLeuLysValProValAlaValAlaValValAla165170175LeuGinGinGinGinlielieLeuProValAlaCysLeuAlaProGlu180185190PheTyrMetSerSerGlyAspLeuLeuGluLeuAspGluGluGinTrp195200205PheGlyGlyMetAspAlaGlyLeuLeuArgGluLeuGlyAlaGlyTyr210215220AlaArgValThrAlaGlyArgGluArgGluAlaGlyGluArgArgAla225230235240GluArgArgProAspThrAlaMetGluLeuLeuValArgLeulie245250255<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>〈400>4cccttttccccaasactaga3scc24〈210〉5〈211〉26<212>DNA<220〉<223〉<400〉5gctaaeittagtcg己acaagcagctcc26<210〉6<211〉46<212〉腿<220〉<223〉<400〉6actctatgagaattcgatgagcgatctgtttttttttttttttttt46<210〉7<211〉18<212>DNA<220〉<221>misc-feature<222>(2，6)<223〉m=c或a，b=c或t或g<400〉7gmcgcbtgcctcaacttc18權利要求1、一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白質。2、權利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2中自5'末端第1-768位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；3)在嚴格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與l)或2)限定的DNA序列具有95X以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。4、擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。5、根據(jù)權利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對為如下l)、2)或3)所示1)一條引物的序列如序列表中序列3所示，另一條引物的序列如序列表中序列4所示；2)—條引物的序列如序列表中序列3所示，另一條引物的序列如序列表中序列5所示；3)—條引物的序列如序列表中序列6所示，另一條引物的序列如序列表中序列7所示。6、含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒。7、根據(jù)權利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在載體YEpGAP112的多克隆位點插入序列表中序列2中自5'末端起第1-768位所示核苷酸序列得到的重組載體。8、一種培育抗逆性植物的方法，是將權利要求2或3中所述的基因導入植物中，培養(yǎng)得到抗逆性植物。9、根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗低溫和/或抗干旱10、根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述植物為歐山羊草全文摘要本發(fā)明公開了一種轉錄因子蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白質。本發(fā)明的轉錄因子具有DREB類轉錄因子家族共有的特征具有一個含有58個氨基酸的EREBP/AP2保守區(qū)。該轉錄因子，可與多個逆境應答基因啟動子共有的DRE調控元件特異結合，調控這些基因的表達，從而激活植物體內的多種抗逆機制，提高抗逆能力。因此本發(fā)明轉錄因子為基因工程改良植物耐逆性提供了一條新的技術途徑，尤其在小麥等農作物抗逆性的綜合改良過程中具有廣泛的應用前景和巨大的經濟價值。文檔編號C07K14/415GK101456908SQ20081024680公開日2009年6月17日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權日2008年12月31日發(fā)明者劉冬成,孫家柱,張愛民,李俊明,陽文龍申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所