一種玉米核因子基因ZmNF-YA3在改變植物抗逆性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改變植物抗逆性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NF-Y(nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一種轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，由3個 不同的亞基（NF-YA/CBF-B/HAP2、NF-YB/CBF-A/HAP3 和 NF-YC/CBF-C/HAP5)組成，并通過作 用于其他調(diào)控因子的啟動子來調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。NF-YA是DNA序列特異性的亞基，結(jié)合 到基因啟動子區(qū)的核心五聚體核苷酸CCAAT基序（motif)上。NF-YB和NF-YC是分別在結(jié) 構(gòu)上類似組蛋白H2A和H2B的亞基。完整的NF-Y轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與靶基因啟動子中的CCAAT 基序結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-Y復(fù)合體能夠作為一個轉(zhuǎn)錄激活因子或阻遏因子起作用， 其與DNA的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性也受到其它轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，后者通過與NF-Y亞基相互作用 起作用。植物NF-Y可分為NF-YA、NF-YB和NF-YC三個家族，每家族有8~39名成員，出現(xiàn) 了結(jié)構(gòu)和功能的多樣化，形成復(fù)雜的基因家族，且每個家族不同成員參與了不同調(diào)控。已有 的植物NF-Y基因功能分析揭示，三個家族的基因均有成員參與了植株生長發(fā)育調(diào)控或植 物與微生物相互作用，以及對逆境脅迫的響應(yīng)。在進(jìn)化過程中一些亞家族成員形成了參與 不同發(fā)育途徑和代謝過程的特殊功能，如胚胎發(fā)育調(diào)控、根系發(fā)育和開花時間控制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng)激調(diào)節(jié)、干旱脅迫響應(yīng)、微生物感染及固氮根瘤形成等。一些植物NF-Y家族成員在抗旱、 耐鹽性狀上也有重要作用，過表達(dá)AtNF-YBl和ZmNF-YB2能夠增強(qiáng)植物抗旱性。AtNF-YA5 被證明在干旱脅迫和響應(yīng)脫落酸（ΑΒΑ)的擬南芥根和葉中表達(dá)上調(diào)。
[0003] 玉米NF-Y家族基因數(shù)量大，檢索玉米基因組序列，發(fā)現(xiàn)玉米CCAAT-HAP2/NF-YA家 族成員 36 個、CCAAT-HAP3/NF-YB 成員 28 個、CCAAT-HAP5/NF-YC 成員 25 個。這些 NF-Y 家 族基因的功能研究尚處起步階段，只見到玉米ZmNF-YB2基因過表達(dá)提高了玉米植株耐旱 性的研究報道和孟山都公司申請的專利。有關(guān)玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改變植物抗逆 性中的應(yīng)用未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明要解決的問題是提供一種玉米核因子基因 ZmNF_YA3 在改變植物抗逆性中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改變植物抗逆性中的應(yīng)用。
[0006] 其中：所述玉米核因子基因 ZmNF-YA3的cDNA序列如SEQ ID No. 1所示，其編碼的 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述植物是指栽培的草本作物，或玉米，或棉花；所述改 變植物抗逆性是指改變植物的抗旱性和/或耐熱性。
[0007] 上述應(yīng)用中：所述玉米核因子基因 ZmNF-YA3基因有cDNA形式或該ZmNF-YA3基因 以正義形式、反義形式或其RNAi結(jié)構(gòu)形式。
[0008] 本發(fā)明所述玉米核因子基因 ZmNF_YA3在改變植物抗逆性中的應(yīng)用方法是：從玉 米cDNA或基因組中克隆ZmNF-YA3基因序列，以基因全長形式或該基因以正義或反義形式、 或RNAi結(jié)構(gòu)形式重組到植物表達(dá)載體中，形成融合基因，然后采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將融合基因 導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株；其中，所述ZmNF-YA3基因以正義形式、反義形式或其RNAi 結(jié)構(gòu)形式與啟動子融合，該啟動子有脅迫誘導(dǎo)型和/或組成型的。通過檢測轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng) 度和對植株進(jìn)行性狀鑒定，從中篩選出生長和抗逆性發(fā)生明顯改變的轉(zhuǎn)基因植株及其后 代，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用價值的植物新種質(zhì)。具體的：
[0009] 本發(fā)明中，首先以耐旱自交系齊319和干旱敏感自交系65232為材料，采用芯片雜 交技術(shù)比較苗期滲透脅迫處理（用18% PEG溶液澆灌沙培的3葉期玉米幼苗，分別在處理 后12h、24h、48h和恢復(fù)澆水后24h)對不同基因型轉(zhuǎn)錄組影響，選出了差異表達(dá)的在不同 基因型中變化趨勢不同的轉(zhuǎn)錄因子。然后，采用定量RT-PCR技術(shù)對它們進(jìn)行表達(dá)譜分析， 從中選出ZmNF-YA3/GRMZM5G857944基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。在正常生長條件下ZmNF-YA3/ GRMZM5G857944基因在玉米根中的表達(dá)豐度大于葉中；在根中耐旱自交系齊319的表達(dá)豐 度是干旱敏感自交系65232的2. 5倍；在葉中齊319的表達(dá)量只有65232的1/2。滲透脅 迫處理24h時，在耐旱自交系齊319的葉片中表達(dá)豐度略有上升，而在根中大幅度下降，約 為處理前的1/9;在旱敏感自交系65232的葉和根中均顯著下降，下降幅度約為30%。在滲 透脅迫處理48h，齊319的葉、根中ZmNF-YA3表達(dá)豐度變化不大，而在65232根和葉中表達(dá) 豐度有一定上升。復(fù)水24h后，在齊319的根中ZmNF-YA3表達(dá)迅速上升，在65232的根中 卻明顯下降；而在葉中ZmNF-YA3的表達(dá)豐度恢復(fù)到接近脅迫處理前的水平。即該基因表達(dá) 受滲透脅迫的調(diào)節(jié)，且在不同基因型中表達(dá)變化有差異，在根中是滲透脅迫抑制的，在葉中 對滲透脅迫反應(yīng)因基因型不同而差異明顯，推測它與玉米的根系生長發(fā)育及抗旱性有關(guān)。
[0010] 本發(fā)明中，將ZmNF-YB3基因編碼框分別與脅迫誘導(dǎo)型的啟動子如Prd29B、Prd29A 等融合，重組到植物表達(dá)載體中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍轟擊法將融合基因轉(zhuǎn)入植物， 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系。如在轉(zhuǎn)基因玉米、棉花的產(chǎn)生中，構(gòu)建出載體pCambial300-Prd29B: :ZmN F-YA3(+)-PCaMV35S: :bar 和 pCambial300-Prd29B: :ZmNF-YA3(-)-PCaMV35S: :bar，采用農(nóng) 桿菌介導(dǎo)法或基因槍轟擊法將目標(biāo)質(zhì)粒的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系或棉花優(yōu)良品種 中，轉(zhuǎn)化苗移栽成活后自交，收獲種子。通過除草劑抗性篩選和分子生物學(xué)檢測方法（PCR、 Southern blotting、RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化植株后代，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系。繼而通過連續(xù)3代 的自交和分子鑒定，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因純合株系。另外，依據(jù)ZmNF-YA3基因特異序列，構(gòu)建出 尺熟丨結(jié)構(gòu)并重組到植物表達(dá)載體？?605941中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化質(zhì)粒？?605941^^(1298::2111即-￥八3 RNAi-PCaMV35S: :bar進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)玉米植株。
[0011] 本發(fā)明中，通過連續(xù)自交繼代得到轉(zhuǎn)基因純合植株。首先，在正常栽培條件下確 定轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育是否正常，進(jìn)而分析轉(zhuǎn)基因植株和對照植株（轉(zhuǎn)基因受體基因型植 株）在脅迫條件下的抗性差異。在正常栽培條件下轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)和生長發(fā)育正常，由于 啟動子的特性，轉(zhuǎn)基因 ZmNF-YA3或其反義結(jié)構(gòu)或RNAi結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)脅迫誘導(dǎo)型表達(dá)。在轉(zhuǎn)基 因玉米中，部分過表達(dá)株系在干旱或低溫條件下ZmNF-YA3表達(dá)強(qiáng)度顯著高于未轉(zhuǎn)基因植 株的，而部分轉(zhuǎn)反義基因或RNAi結(jié)構(gòu)的玉米株系，內(nèi)源ZmNF-YA3的表達(dá)受到明顯抑制，即 ZmNF-YA3表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)基因植株的。以下以轉(zhuǎn)基因玉米株系為例簡述本發(fā)明中抗 逆檢測試驗的基本步驟和方法。
[0012] 在抗旱性實驗中，將轉(zhuǎn)ZmNF_YA3基因或它的RNAi結(jié)構(gòu)的純合株系的種子分別播 種在塑料盤中，置于適宜條件下生長。植株4葉期時停止?jié)菜珊堤幚?-10天（由環(huán)境 溫度和相對濕度決定），觀察植株萎蔫程度的差異，當(dāng)絕大多數(shù)植株基部變軟倒伏后，恢復(fù) 澆水，觀測植株恢復(fù)生長狀況和成活率，確定植株的抗旱性。結(jié)果表明，ZmNF-YA3基因過表 達(dá)增強(qiáng)了苗期植株的抗旱性，而ZmNF-YA3基因下調(diào)表達(dá)降低了植株的苗期抗旱性。
[0013] 同時，將轉(zhuǎn)ZmNF-YA3基因和其RNAi結(jié)構(gòu)的玉米種子及受體基因型種子同期播種 在的花盆或/和大田，分別在雌雄穗分化期（9~13葉期）、開花授粉期和灌漿期進(jìn)行干旱 脅迫處理，即通過控制澆水和避免雨淋，保持土壤相對含水量在55-65%，持續(xù)時間15天左 右，觀察轉(zhuǎn)基因植株性狀和生長發(fā)育狀態(tài)，檢測相關(guān)的生理指標(biāo)。一般開放授粉，收獲果穗 并進(jìn)行考種。結(jié)果表明，部分ZmNF-YA3過表達(dá)株系的抗旱性顯著高于受體基因型的，單株 產(chǎn)量