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野生稻的一個(gè)抗旱基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):3575589閱讀:192來源:國(guó)知局
專利名稱:野生稻的一個(gè)抗旱基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物中與抗脅迫相關(guān)的基因及其編碼蛋白與應(yīng)用,特別涉及野生稻中的一個(gè)抗旱基因及其編碼蛋白與其在培育抗旱能力提高植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
植物的生長(zhǎng)受到環(huán)境中多種非生物因素的影響,其中水分脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一。研究表明大量逆境應(yīng)答基因的表達(dá)為植物獲得抗逆性所必需(Gonget al.,PNAS,9911507-11512)。在多數(shù)干旱、高鹽或凍害等水分脅迫應(yīng)答基因的啟動(dòng)子區(qū)都含有一個(gè)或多個(gè)脫水反應(yīng)元件或叫C重復(fù)(Dehydration-responsiveelement/C-repeat,即DRE/CRT),該元件的核心序列為G/ACCGAC(Shinozaki et al.,Curr.Opin.Plant Biol.,3217-223)。DREB1/CBF(Dehydration-responsiveelement binding protein/C-repeat binding factor)轉(zhuǎn)錄因子家族通過和該順式作用元件結(jié)合來激活下游基因的表達(dá)(Liu et al.,Plant Cell,101391-1406)。近年來,在對(duì)模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)組成型表達(dá)的bHLH(basicHelix-Loop-Helix)類轉(zhuǎn)錄因子ICE1(inducer of CBF expressionl,ICE1)能夠和CBF3基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的MYC識(shí)別序列結(jié)合并調(diào)節(jié)DREB1/CBF基因的轉(zhuǎn)錄。ICE1可被修飾(或與配體結(jié)合)后激活,引起CBF及其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而提高植物的抗逆性(Chinnusamy et al.,Genes Dev 171043-1054)。
我國(guó)江西省東鄉(xiāng)普通野生稻(O.rufipogon)是分布在世界上最北端的野生稻品種,蘊(yùn)含豐富的抗病蟲基因和耐冷基因,具有優(yōu)良的耐冷性、耐旱性、耐瘠性和抗病性等,而且蛋白質(zhì)含量較高,可利用價(jià)值巨大。因此充分利用東鄉(xiāng)野生稻的一系列有益基因,在植物育種研究中具有重大價(jià)值。此外,擬南芥和水稻基因組測(cè)序工作的完成,為利用這些模式植物進(jìn)行基因功能的研究提供了便利條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供野生稻中的一個(gè)抗旱基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的抗旱基因,名稱為OrICLa,來源于普通野生稻(O.rufipogon),它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列;2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.101%SDS的溶液中,65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1706個(gè)堿基組成,其編碼序列為自5’端第41-1615位堿基,編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明抗旱基因所編碼的蛋白(OrICLa),具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1;2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗旱性的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由524個(gè)氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增OrICLa中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
利用植物表達(dá)載體,將本發(fā)明的抗旱基因?qū)胫参锛?xì)胞,可獲得對(duì)干旱耐受力增強(qiáng)的的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域,即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端,如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用OrICLa構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí),在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、根部特異表達(dá)啟動(dòng)子等,它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用;此外,使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí),還可使用增強(qiáng)子,包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子,這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等,但必需與編碼序列的閱讀框相同,以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選,可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工,如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮,可不加任何選擇性標(biāo)記基因,直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明OrICLa的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織,并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、玉米等單子葉植物,也可以是擬南芥等雙子葉植物。
本發(fā)明的抗旱基因OrICLa為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ),將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物(特別是水稻)中發(fā)揮重要的作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增的OrICLa的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為OrICLa超表達(dá)載體pSNICLa的物理圖譜圖3為OrICLa轉(zhuǎn)基因擬南芥外源基因的PCR鑒定結(jié)果圖4為OrICLa轉(zhuǎn)基因擬南芥外源基因的RT-PCR鑒定結(jié)果圖5為OrICLa超表達(dá)擬南芥經(jīng)水分脅迫處理后的表型圖6為OrICLa超表達(dá)擬南芥經(jīng)水分脅迫處理后根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、OrICLa的克隆根據(jù)ICE1 bHLH結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列“GKKKGMPAKNLMAERRRRKKLNDRLYMLRSVVPKISKMDRASILGDAIDYLKELLQRINDLHNELES”,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索(blastp),在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)同源性較高的全長(zhǎng)cDNA序列,根據(jù)其中一個(gè)基因(OrICLa)的核苷酸序列設(shè)計(jì)以下引物5’端引物CGCGGATCCCATCTCCTTCCCCACCCC(帶下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn));3’端引物CGGGGTACCGCCCTGAGCAGGTCTAAAACTA(帶下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶Kpn I識(shí)別位點(diǎn))。以東鄉(xiāng)野生稻(O.rufipogon)幼苗經(jīng)4℃處理30分鐘的總RNA為模板,在上述引物對(duì)的引導(dǎo)下,RT-PCR擴(kuò)增OrICLa的cDNA序列,具體方法包括以下步驟1、總RNA的提取把在不含激素的1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周的東鄉(xiāng)野生稻幼苗放在低溫培養(yǎng)箱中4℃處理30分鐘,用Trizol法(所用試劑購(gòu)自Invitrogen公司)提取幼苗總RNA,具體方法為收集經(jīng)4℃低溫處理的水稻材料100mg,立即置于液氮中研磨,加入1mL Trizol試劑,充分混勻后,室溫放置5分鐘;加入0.2mL氯仿,劇烈振搖15秒,室溫溫育3分鐘;4℃,12000g離心15分鐘;將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL離心管中,加入0.5mL異丙醇沉淀RNA;最后將RNA沉淀用1mL 75%乙醇洗滌后溶于適量經(jīng)DEPC處理過的水中,-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、第一鏈cDNA的合成用SuperscriptTMII RT試劑盒(Invitrogen)并按試劑盒說明書進(jìn)行操作取1-5μg步驟1獲得的水稻總RNA放入滅活了RNase的PCR管中,加入Oligo(dT)12-18(500mg/mL)1μL和dNTP Mix(10mM each)1μL,用DEPC處理后的雙蒸水補(bǔ)充至12μL,混勻后在65℃下加熱5分鐘,然后迅速置于冰上,1分鐘。短暫離心后再加入5×第一鏈合成緩沖液4μL、0.1M DTT 2μL和RNaseOutTM(40unit/μL)1μL,輕輕混勻后,42℃溫育2分鐘,然后加入SuperscriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶(200unit/μL)1μL,混勻,42℃溫育50分鐘,70℃加熱15分鐘使酶失活,得到第一鏈cDNA。
3、OrICLa cDNA的合成取1μL步驟2獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,在5’端引物和3’端引物的引導(dǎo)下,用PCR的方法合成OrICLa的cDNA,PCR反應(yīng)體系為L(zhǎng)A Taq(TaKaRa公司)0.5μL、2×GC緩沖液(TaKaRa公司)25μL、dNTP 1μL、5’端引物(10μM/L)1μL、3’端引物(10μM/L)1μL、模板1μL、加雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 4分鐘;再94℃ 45秒,62℃ 45秒,72℃ 2分鐘,共35個(gè)循環(huán);最后72℃ 10分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道M為Marker,泳道1為OrICLa的RT-PCR產(chǎn)物),得到分子量約為1.8kb的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天為時(shí)代公司)回收該片段,然后將該回收片段與載體pGEM-T Easy(Promega)進(jìn)行連接,連接體系為T4DNA連接酶(3u/μL)、2×連接酶緩沖液5μL、pGEM-T Easy(50ng/μL)0.5μL和回收PCR產(chǎn)物3.5μL,4℃反應(yīng)12-24小時(shí)。參照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci,692110),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆,得到含有回收片段的重組質(zhì)粒,命名為pTE-OrICLa。以該質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果表明OrICLa具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列,由1706個(gè)堿基組成,其其開放閱讀框(ORF)為自5’端第41-1615位堿基,編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì);自5’端第1022-1222位堿基為ICE1 bHLH保守結(jié)構(gòu)域的編碼序列,編碼67個(gè)氨基酸。與ICE1進(jìn)行同源性比較,核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為42%和40%。
實(shí)施例2、OrICLa超表達(dá)載體pSNICLa的構(gòu)建1、玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro)的獲得1)玉米基因組DNA的提取剪取約0.2g玉米幼苗,置于液氮中研磨;然后加入800μL新配制的提取緩沖液(含0.1M Tris-HCl pH8.0,50mM EDTA,0.5M NaCl,1%SDS和1%β-巰基乙醇),劇烈振蕩使其全部懸??;65℃水浴30分鐘,每5分鐘顛倒混勻一次;然后加入250μL預(yù)冷的5M乙酸鉀,立即顛倒混勻,冰浴5分鐘;加入等量酚/氯仿,抽提一次,12000rpm離心5分鐘;收集上清,加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA,室溫放置40分鐘;4℃ 12000rpm離心15分鐘,棄上清;沉淀用70%、100%乙醇各洗一次;干燥后,溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH2O中,得到玉米基因組DNA。
2)PCR擴(kuò)增玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro)取2μL步驟1)獲得的玉米基因組DNA溶液作為模板,在帶有HindIII識(shí)別位點(diǎn)的5′引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和帶有BamHI識(shí)別位點(diǎn)的3′引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為先94℃ 3分鐘;再94℃ 45秒,62℃ 45秒,72℃ 2分鐘,共35個(gè)循環(huán),最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),表明得到長(zhǎng)度約為2kb的擴(kuò)增片段,與預(yù)期結(jié)果相符,回收該目的片段,用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I雙酶切后回收,得到帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro),備用。
2、用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoR I將Noster poly A終止序列從質(zhì)粒載體pBI 221(Clontech公司)上切下,連接到載體pUC19(TaKaRa公司)的相應(yīng)位點(diǎn)中,得到重組載體,命名為pUC19-Noster。再用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切pUC19-Noster,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,回收線性化的載體大片段,并將該回收片段與步驟1獲得的帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro)相連,得到重組載體,命名為pUN19。
3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切從步驟2購(gòu)建的重組載體pUN19切下包含UbiPro和Noster的長(zhǎng)度約為2.3kb的片段,將該片段克隆入質(zhì)粒載體pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture,www.cambia.org)多克隆位點(diǎn)的EcoR I和HindIII位點(diǎn)處,得到重組載體,命名為pUN1301。
4、用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI對(duì)質(zhì)粒載體pBI221進(jìn)行雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收長(zhǎng)度約為0.8kb的35S啟動(dòng)子片段,將其與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒載體pUN1301進(jìn)行連接,得到含有35S啟動(dòng)子片段的重組載體,命名為pSN1301。
5、對(duì)重組質(zhì)粒載體pTE-OrICLa和pSN1301分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI進(jìn)行雙酶切,酶切體系為質(zhì)粒5μL、10×酶切緩沖液2.5μL、KpnI 1μL、BamHI 0.8μL,加ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μL,37℃酶切8小時(shí)。用瓊脂糖電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離,回收1.7Kb的OsICLa片段和13Kb的載體pSN1301大片段,分別溶解于45μL ddH2O中。再按以下反應(yīng)體系將兩者進(jìn)行連接T4DNA連接酶2μL、10×連接酶緩沖液2μL、回收的OsICla 10μL、pSN130 16μL,16℃連接16小時(shí)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)Kan+平板篩選得到陽(yáng)性菌株,將該重組質(zhì)粒命名為pSNICLa,其物理圖譜如圖2所示。在該質(zhì)粒中采用CaMV 35S強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因OrICLa在植物中超表達(dá),轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法見下述實(shí)施例。
實(shí)施例3、OrICLa超表達(dá)擬南芥的獲得及其鑒定含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌浸泡轉(zhuǎn)化的植株所結(jié)種子以及由該種子長(zhǎng)成的植株用T0代表,T1代表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株,T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。
一、轉(zhuǎn)化有OrICLa超表達(dá)質(zhì)粒pSNICLa的擬南芥的獲得1、OrICLa超表達(dá)質(zhì)粒pSNICLa轉(zhuǎn)化擬南芥用EasyJecT Plus電激儀(英國(guó)EquiBio公司)并參照說明書進(jìn)行操作,將質(zhì)粒pSNICLa用電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58,經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到農(nóng)桿菌的陽(yáng)性克??;再參照Clough等的方法(Clough SJ and Bent AF,1998Plant J 16735-43),在上述陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下,將pSNICLa轉(zhuǎn)化擬南芥。
2、轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗的抗菌素篩選將收獲的步驟1獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子用0.2% TritonX-100浸泡10分鐘;再用10%的次氯酸鈉表面消毒,12分鐘;滅菌水洗滌五次,每2分鐘一次;用水將種子鋪在含25mg/L潮霉素的MS平板上,用錫箔紙包裹,在4℃、黑暗條件下放置2天,取出后于23℃的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)3-4天;3-4天后,長(zhǎng)勢(shì)最高的為初篩到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗,在避光條件下取出,光下再培養(yǎng)3天,然后將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗移至花盆中培養(yǎng),得到T1代轉(zhuǎn)基因材料。
二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定GUS染色液100mmol/L磷酸鹽pH 7.0,0.1%Triton X-100,10mmol/L EDTA,0.5mmol/L鐵氰化鉀,X-Gluc 1mg/mL。
Edwards提取緩沖液200mM Tris-Cl pH7.5,250mM NaCl,25mM EDTA,0.5%SDS。
1、擬南芥陽(yáng)性苗的GUS染色鑒定取生長(zhǎng)3周的步驟1篩選的擬南芥陽(yáng)性幼苗葉片尖部2-3mm材料進(jìn)行GUS染色。37℃溫育12小時(shí),再用75%酒精脫色,葉片呈藍(lán)色的為陽(yáng)性植株。
2、轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定1)基因組DNA的提取取一片用步驟1的方法鑒定的擬南芥陽(yáng)性植株的葉片放入1.5mL Eppendorf管中,加入液氮,用組織研磨杵研磨10秒鐘,磨碎;加入400μL Edwards提取緩沖液,輕輕研磨(洗去杵上組織);振蕩5秒鐘,離心1分鐘,轉(zhuǎn)移300μL的上清液到新管中,加入300μL異丙醇,混合,于室溫放置2分鐘;離心、棄上清,風(fēng)干沉淀,溶于100μL水中,得到轉(zhuǎn)基因材料的基因組DNA。
2)轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定以步驟1)獲得的基因組DNA為模板,在引物1(5’端引物)CGCGGATCCCATCTCCTTCCCCACCCC和引物2(3’端引物)CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG的引導(dǎo)下,用PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定,PCR反應(yīng)體系為基因組DNA溶液1μL、LA taq0.5μL、2×GC緩沖液25μL、dNTP 1μL、引物1(10μM/L)和引物2(10μM/L)各1μL、加雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 4分鐘;再94℃ 45秒,62℃ 45秒,72℃ 2分鐘,共35個(gè)循環(huán);最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖3所示(泳道Marker為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量),泳道6、8、10、11和15為不同轉(zhuǎn)基因株系,泳道WT為野生型植株),所有轉(zhuǎn)基因株系都擴(kuò)出了約1.8kb的陽(yáng)性條帶,與預(yù)期大小相符,而野生型則沒有,表明目的基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中。
3、轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定分別提取步驟2所用的WT和五個(gè)轉(zhuǎn)基因株系開花期的總RNA,各取2μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成其cDNA,RNA提取和反轉(zhuǎn)錄方法參照實(shí)施例1中的步驟進(jìn)行。以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,在OrICLa特異引物(5’引物GTGCCCAAGATCAGCAAGATGGACAG,3’引物GGTACCTGTCGAAAATGCCACATGACC)的引導(dǎo)下,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(以Actin為參照),PCR反應(yīng)體系為rTaq 0.2μL、dNTP 2μL、10X PCR緩沖液2μL、(10μM)5’引物0.4μL、(10μM)3’引物0.4μL、20X cDNA 2μL、加ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 4分鐘;再94℃ 45秒,59℃ 45秒,72℃ 90秒,共35個(gè)循環(huán);最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖4所示(泳道6、8、10、11和15為不同轉(zhuǎn)基因株系,泳道WT為野生型植株),所有轉(zhuǎn)基因株系都擴(kuò)出了清晰的OrICLa的片段,而野生型則沒有,表明OrICLa已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中。
實(shí)施例4、水分脅迫處理后的OrICLa轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型將在正常MS無激素培養(yǎng)基上萌發(fā)2天的OrICLa轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到含有300mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行缺水脅迫處理,生長(zhǎng)10天后,觀察表型并對(duì)其根長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì),表型觀察結(jié)果如圖5所示(A無脅迫的野生型植株;B無脅迫的轉(zhuǎn)基因植株;C受缺水脅迫的野生型植株;D受缺水脅迫的轉(zhuǎn)基因植株),對(duì)根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示,上述試驗(yàn)結(jié)果表明OrICLa轉(zhuǎn)基因擬南芥具有明顯的水分脅迫抗性。
序列表<160>2<210>1<211>524<212>PRT<213>普通野生稻(O.ruffipogon)<400>1Met Leu Pro Arg Phe His Gly Ala Met Trp Met Gln Asp Asp Gly Gly1 5 10 15Gly Asp Gln Glu His Gly Gln Ala Ala Pro Pro Gly Gln Glu Gln His20 25 30His His Asp Gln His Leu Met Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly35 40 45Ala Gly Phe Gly Ala Ala Gln Ala Pro Ala Pro Leu Leu Asp Glu Asp50 55 60Trp Tyr Phe Asp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala His Gly Ser65 70 75 80Met Met Leu Gly Leu Ser Ser Val His Gly Gly Ile Gly Ala Gly Thr85 90 95Ser Gly Gly Gly His Gly Gln Gln Phe Ser Leu Leu Asn Met Gly Ala100 105 110Ala Ala Ala Pro Phe Asp Val Ser Gly Phe Asp Leu Gly Ile Ala Cys115 120 125Gly Gly Val Gly Gly Gly Gly Asp Val Val Ser Phe Leu Gly Gly Gly130 135 140Asn Ala Ser Asn Thr Ala Leu Leu Pro Val Gly Asn Ala Gly Phe Leu145 150 155 160Gly Thr Phe Gly Gly Phe Gly Thr Ala Ala Ser Gln Thr Pro Glu Phe165 170 175
Gly Gly Leu Ala Gly Phe Asp Met Phe Asp Ala Gly Ala Val Asn Thr180 185 190Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala195 200 205Ser Ala His Val Ser Asn Thr Ala Pro Phe Ser Gly Arg Gly Lys Ala210 215 220Ala Val Leu Arg Pro Leu Asp Ile Val Pro Pro Val Gly Ala Gln Pro225 230 235 240Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Leu Arg Arg Asn Ala Gly Glu Asp Asp245 250 255Asp Asp Lys Lys Arg Lys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Leu260 265 270Ser Ala Asp Gly Ala Asp Met Val Leu Asp Asp Gly Asp Asp Asp Gly275 280 285Leu Ser Ile Asp Ala Ser Gly Gly Leu Asn Tyr Asp Ser Glu Asp Ala290 295 300Arg Gly Gly Glu Asp Ser Gly Ala Lys Lys Glu Ser Ash Ala Asn Ser305 310 315 320Thr Val Thr Gly Asp Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly Met Pro Ala Lys325 330 335Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn Asp Arg Leu340 345 350Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met Asp Arg Ala355 360 365Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Leu Gln Lys370 375 380Ile Asn Asp Leu Gln Asn Glu Leu Glu Ser Ser Pro Ala Thr Ser Ser385 390 395 400Leu Pro Pro Thr Pro Thr Ser Phe His Pro Leu Thr Pro Thr Leu Pro405 410 415Thr Leu Pro Ser Arg Ile Lys Glu Glu Ile Cys Pro Ser Ala Leu Pro420 425 430
Ser Pro Thr Gly Gln Gln Pro Arg Val Glu Val Arg Leu Arg Glu Gly435 440 445Arg Ala Val Asn Ile His Met Phe Cys Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu450 455 460Leu Ser Ala Met Arg Ala Val Glu Gly Leu Gly Leu Asp Val Gln Gln465 470 475 480Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Thr Leu Asp Ile Phe Lys Ala485 490 495Glu Gln Cys Lys Asp Gly Pro Gly Leu Leu Pro Glu Glu Ile Lys Ala500 505 510Val Leu Met Gln Ser Ala Gly Leu His Thr Met Ile515 520<210>2<211>1706<212>DNA<213>普通野生稻(O.rufipogon)<400>2ccatctcctt ccccacccca ccgccattgc cgccgcggcg atgctgccgc ggtttcacgg 60cgccatgtgg atgcaggacg acggcggcgg cgaccaagaa cacgggcagg cggcgccgcc120tgggcaggag cagcaccacc acgaccagca tctcatggcg ttggcggccg cggccgcggg180cggcgccggg ttcggcgcgg cgcaggcgcc ggcgccgctg ctcgatgagg actggtactt240cgacgcggcg ggtggtggtg gtggtggcgc gcatgggtcc atgatgctgg gtttgtcgtc300cgtccatggc gggattgggg cggggacgtc tggtggtggg catgggcagc agttctcgct360gctcaacatg ggcgccgcgg ccgcgccgtt cgacgtctcc gggttcgacc tcgggatcgc420ctgcggcggc gttggcggcg gcggcgacgt ggtgtcgttt cttggcggcg ggaacgcgtc480gaacaccgcg ctgctccccg tcgggaacgc ggggttcctc ggcacgttcg gcgggttcgg540caccgcggcg tcccaaacgc cggagttcgg cgggctcgcc gggttcgaca tgttcgacgc600gggcgccgtg aacaccgggg gcagctcctc ctcctcgtcg gcggcggcgg cggcggcgtc660cgcctcggcg cacgtgagca acaccgcgcc gttctccggg cgcggcaagg cggcggtgct720gcggccgctg gatatcgtcc cgcccgtggg cgcgcagccg acgctgttcc agaagcgcgc780
gctccgccgc aacgccggcg aggacgacga cgacaagaag cgcaaggccg ccgcgggcgc 840gggcgcgggc gcgctgtccg ccgacggcgc cgacatggtg ctcgacgacg gcgacgacga 900cggcctcagc atcgacgcgt cgggcggcct caactacgac tccgaggacg ccaggggcgg 960cgaggacagc ggcgccaaga aggagtcgaa cgccaacagc acggtcaccg gcgacgggaa1020ggggaagaag aaggggatgc cggccaagaa cctcatggcg gagcgccgcc gccggaagaa1080gctcaacgac cgcctctaca tgctccgctc cgtcgtgccc aagatcagca agatggacag1140ggcttccatt ctcggcgacg cgattgagta cctgaaggag ctgctgcaga agatcaatga1200tcttcagaat gagctcgagt cgtcccccgc gacgtcgtca ttgcctccaa cacccacaag1260cttccatccc ctgacaccga cgctgcccac attgccgtcc cgcatcaagg aagagatctg1320cccaagtgca ttgccaagcc ccactggaca acagccaagg gttgaggtta ggctgaggga1380aggccgggct gtcaatatcc acatgttctg tgctcggagg cccggtctac tgctctctgc1440catgagggcc gtcgaaggcc ttggtctcga tgtccagcaa gctgtaatca gttgcttcaa1500tggctttacg ttggatattt ttaaggctga gcaatgcaag gacggccctg ggctgttgcc1560tgaagaaatc aaggccgttc tgatgcaatc cgccgggctc cataccatga tctaggacag1620gagagctcaa tcaaactcca aaggacagag tagctcagga attgacaaag taccggtgtt1680tcctggtcat gtggcatttt cgacag 170權(quán)利要求
1.野生稻的一個(gè)抗旱基因,具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列;2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗旱基因,其特征在于所述抗旱基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述抗旱基因編碼的蛋白,其特征在于是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1;2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗旱性的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白,其特征在于所述蛋白具有序列表中的SEQ ID №1氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求1所述基因的宿主菌。
8.一種培育抗旱植物的方法,是利用植物表達(dá)載體將權(quán)利要求1所述的抗旱基因?qū)胫参锛?xì)胞,獲得對(duì)干旱耐受力增強(qiáng)的的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于所述被轉(zhuǎn)化的植物宿主為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了野生稻的一個(gè)抗旱基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。該基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列;2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。該基因的編碼蛋白可具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1;2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗旱性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗旱基因?yàn)槿藶榭刂瓶鼓婧湍湍嫦嚓P(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ),將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物(特別是水稻)中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1772899SQ200510068049
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
發(fā)明者種康, 戴曉燕, 徐云遠(yuǎn), 陳大洲, 肖葉青, 許智宏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所
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