本發(fā)明涉及到微生物菌種發(fā)酵領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種乳酸菌凍干保護(hù)劑及其制備方法和使用方法。

背景技術(shù)：

乳酸菌具有多種生理功能，包括治療乳糖不耐癥；促進(jìn)蛋白質(zhì)、單糖及鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；分泌維生素b；改善人體腸道功能，抑制腐敗菌的繁殖，降血脂、降血壓；免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤、預(yù)防癌癥作用等。隨著我國(guó)乳制品產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，市場(chǎng)對(duì)乳酸菌產(chǎn)品的需求增大。乳酸菌發(fā)酵劑的質(zhì)量受到研究人員的關(guān)注。乳酸菌的保藏和乳酸菌發(fā)酵劑的制備是乳酸菌諸多功能得以利用。

目前乳酸菌發(fā)酵劑可采用真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等方法制備。許多研究者發(fā)現(xiàn)冷凍干燥具有其他方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，是制備和保存生物材料最有效的方法，并得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。乳酸菌細(xì)胞在凍干過(guò)程中會(huì)受到一定的損傷，包括機(jī)械損傷、溶質(zhì)損傷、細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)作用損傷，從而造成細(xì)胞死亡。

研究發(fā)現(xiàn)，在凍干前加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，可以改變菌體冷凍干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復(fù)水對(duì)細(xì)胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性，從而提高細(xì)胞的存活率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種乳酸菌凍干保護(hù)劑及其制備方法和使用方法，本發(fā)明的方法冷凍干燥效果好，而且在乳酸菌的冷凍干燥中，能夠大大提高菌體的存活率以及在貯藏過(guò)程中的活菌存活率。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的所采用的技術(shù)方案為：一種乳酸菌凍干保護(hù)劑，按照質(zhì)量份數(shù)，其有效成分由10-18份的海藻糖、10-18份的脫脂奶粉、2-6份的復(fù)合添加組分和1.2-6份的滲透穩(wěn)定組分組成，其中，復(fù)合添加組分為甘油和山梨醇以1-6:1的重量比混合，滲透穩(wěn)定組分由l-半胱氨酸、維生素c和乙酸鈉以1-6:1-2:1-2的重量比混合。

本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還含有甘油重量10-12%的聚乙烯吡咯烷酮。

本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還含有甘油重量8-12%的甘露醇。

本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為，所述滲透穩(wěn)定組分中還含有l(wèi)-半胱氨酸重量4-8%的硫酸錳和l-半胱氨酸重量10-15%的天門(mén)冬氨酸。

上述乳酸菌凍干保護(hù)劑的制備方法，按照上述的比例分別稱量各組分，然后將海藻糖、脫脂奶粉、復(fù)合添加組分溶于52-74份的水中，并在105℃的條件下滅菌20min，最后加入稱量好的滲透穩(wěn)定組分，混合均勻即制得產(chǎn)品。

利用上述乳酸菌凍干保護(hù)劑制備乳酸菌凍干發(fā)酵劑的方法為，將乳酸菌活化、培養(yǎng)，而后離心富集得到發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入與其等體積的上述制備的凍干保護(hù)劑后，在無(wú)菌條件下混合均勻，并在0-5℃的無(wú)菌環(huán)境中靜置10-15h以增強(qiáng)菌體細(xì)胞的抗凍性，最后將上述混合液凍干即制得產(chǎn)品。

所述混合液凍干是指，將經(jīng)過(guò)低溫靜置的混合液在-50℃、真空度為0.2mbar的條件下真空冷凍干燥為固態(tài)。

所述乳酸菌活化、培養(yǎng)是指，在mrs瓊脂培養(yǎng)基中接種乳酸菌，再利用液體mrs培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后收離心菌體，所得菌體用ph為7.4的pbs洗兩遍得到發(fā)酵液。

本發(fā)明中，多糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖醇等可以作為乳酸菌的凍干保護(hù)劑的組合成分，其中研究認(rèn)為海藻糖的保護(hù)效果尤為明顯。海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，由于具有多個(gè)羥基，可以與菌體表面自由基聯(lián)結(jié)起來(lái)，避免菌體暴露在介質(zhì)中，還可與蛋白質(zhì)形成氫鍵以取代水，保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；另一方面在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，減少了游離水的含量并增加了溶液的黏性，從而減緩晶核的生長(zhǎng)過(guò)程，使形成的冰晶較細(xì)小，以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的；

脫脂奶粉是大多數(shù)乳品企業(yè)常用的凍干保護(hù)劑之一，因?yàn)樗軌蚍€(wěn)定細(xì)胞膜的成分，有利于再水化并且形成一層細(xì)胞保護(hù)膜，補(bǔ)充了額外的凍干保護(hù)劑的脫脂奶粉可提高其內(nèi)在的保護(hù)作用；

本發(fā)明的創(chuàng)造點(diǎn)之一在于，將甘油和山梨醇以及甘露醇復(fù)合作為添加組分，由于甘油和山梨醇以及甘露醇具有多個(gè)羥基，在凍干過(guò)程中可取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，從而保護(hù)了細(xì)胞膜和蛋白及結(jié)構(gòu)與功能的完整性；

本發(fā)明的另一創(chuàng)造點(diǎn)在于，以l-半胱氨酸、維生素c和乙酸鈉混合作為滲透穩(wěn)定組分加入到凍干保護(hù)劑中，這三種成分能夠滲入到細(xì)胞內(nèi)部，在體系中結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使體系的粘性增加，進(jìn)而使凍干過(guò)程中體系的冰晶增長(zhǎng)速度減緩，降低了水轉(zhuǎn)化成冰的比例；同時(shí)，保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，提高了細(xì)胞內(nèi)部壓力，降低了細(xì)胞外結(jié)冰引起的細(xì)胞脫水程度和速度，抑制了細(xì)胞內(nèi)冰晶的生長(zhǎng)，從而減少對(duì)細(xì)胞的傷害；而額外加入的硫酸錳和天門(mén)冬氨酸以及原有的l-半胱氨酸，均能夠起到延長(zhǎng)菌粉貯存穩(wěn)定期的作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1）本發(fā)明將甘油和山梨醇以及甘露醇復(fù)合作為添加組分，由于甘油和山梨醇以及甘露醇具有多個(gè)羥基，在凍干過(guò)程中可取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，從而保護(hù)了細(xì)胞膜和蛋白及結(jié)構(gòu)與功能的完整性，提高了乳酸菌的存活率；

2）本發(fā)明以l-半胱氨酸、維生素c和乙酸鈉混合作為滲透穩(wěn)定組分加入到凍干保護(hù)劑中，這三種成分能夠滲入到細(xì)胞內(nèi)部，在體系中結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使體系的粘性增加，進(jìn)而使凍干過(guò)程中體系的冰晶增長(zhǎng)速度減緩，降低了水轉(zhuǎn)化成冰的比例；同時(shí)，保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，提高了細(xì)胞內(nèi)部壓力，降低了細(xì)胞外結(jié)冰引起的細(xì)胞脫水程度和速度，抑制了細(xì)胞內(nèi)冰晶的生長(zhǎng)，從而減少對(duì)細(xì)胞的傷害；而額外加入的硫酸錳和天門(mén)冬氨酸以及原有的l-半胱氨酸，均能夠起到延長(zhǎng)菌粉貯存穩(wěn)定期的作用；

3）利用本發(fā)明的凍干保護(hù)劑來(lái)制備乳酸菌凍干發(fā)酵劑時(shí)，采用低溫靜置處理，能夠大幅度增強(qiáng)乳酸菌菌體細(xì)胞的抗凍性，從而增強(qiáng)乳酸菌在凍干過(guò)程中的存活率，凍干后得到的發(fā)酵劑常溫下可保存30天，活菌存活率達(dá)到75％以上，在保藏期內(nèi)性能穩(wěn)定。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的以及有益效果易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種乳酸菌凍干保護(hù)劑，按照質(zhì)量份數(shù)，其有效成分由18份的海藻糖、18份的脫脂奶粉、6份的復(fù)合添加組分和6份的滲透穩(wěn)定組分組成，其中，復(fù)合添加組分為甘油和山梨醇以1:1的重量比混合，滲透穩(wěn)定組分由l-半胱氨酸、維生素c和乙酸鈉以1:2:2的重量比混合；

上述乳酸菌凍干保護(hù)劑的制備方法，按照上述的比例分別稱量各組分，然后將海藻糖、脫脂奶粉、復(fù)合添加組分溶于52份的水中，并在105℃的條件下滅菌20min，最后加入稱量好的滲透穩(wěn)定組分，混合均勻即制得產(chǎn)品；

利用上述乳酸菌凍干保護(hù)劑制備乳酸菌凍干發(fā)酵劑的方法為，將乳酸菌活化、培養(yǎng)，而后離心富集得到發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入與其等體積的上述制備的凍干保護(hù)劑后，在無(wú)菌條件下混合均勻，并在0℃的無(wú)菌環(huán)境中靜置10h以增強(qiáng)菌體細(xì)胞的抗凍性，最后將上述混合液凍干即制得產(chǎn)品。

以上為本發(fā)明的基本實(shí)施方式，可在以上基礎(chǔ)上做進(jìn)一步的改進(jìn)、優(yōu)化和限定：

本實(shí)施例的一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還額外含有甘油重量10%的聚乙烯吡咯烷酮；

本實(shí)施例的另一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還可以額外含有甘油重量8%的甘露醇；

本實(shí)施例的再一種優(yōu)選方案為，所述滲透穩(wěn)定組分中還含有l(wèi)-半胱氨酸重量4%的硫酸錳和l-半胱氨酸重量10%的天門(mén)冬氨酸；

本實(shí)施例中所述混合液凍干是指，將經(jīng)過(guò)低溫靜置的混合液在-50℃、真空度為0.2mbar的條件下真空冷凍干燥為固態(tài)；

本實(shí)施例中所述乳酸菌活化、培養(yǎng)是指，在mrs瓊脂培養(yǎng)基中接種乳酸菌，再利用液體mrs培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后收離心菌體，所得菌體用ph為7.4的pbs洗兩遍得到發(fā)酵液。

實(shí)施例2

一種乳酸菌凍干保護(hù)劑，按照質(zhì)量份數(shù)，其有效成分由10份的海藻糖、10份的脫脂奶粉、2份的復(fù)合添加組分和1.2份的滲透穩(wěn)定組分組成，其中，復(fù)合添加組分為甘油和山梨醇以6:1的重量比混合，滲透穩(wěn)定組分由l-半胱氨酸、維生素c和乙酸鈉以6:1:1.5的重量比混合；

上述乳酸菌凍干保護(hù)劑的制備方法，按照上述的比例分別稱量各組分，然后將海藻糖、脫脂奶粉、復(fù)合添加組分溶于74份的水中，并在105℃的條件下滅菌20min，最后加入稱量好的滲透穩(wěn)定組分，混合均勻即制得產(chǎn)品；

利用上述乳酸菌凍干保護(hù)劑制備乳酸菌凍干發(fā)酵劑的方法為，將乳酸菌活化、培養(yǎng)，而后離心富集得到發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入與其等體積的上述制備的凍干保護(hù)劑后，在無(wú)菌條件下混合均勻，并在5℃的無(wú)菌環(huán)境中靜置15h以增強(qiáng)菌體細(xì)胞的抗凍性，最后將上述混合液凍干即制得產(chǎn)品。

以上為本發(fā)明的基本實(shí)施方式，可在以上基礎(chǔ)上做進(jìn)一步的改進(jìn)、優(yōu)化和限定：

本實(shí)施例的一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還額外含有甘油重量12%的聚乙烯吡咯烷酮；

本實(shí)施例的另一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還可以額外含有甘油重量12%的甘露醇；

本實(shí)施例的再一種優(yōu)選方案為，所述滲透穩(wěn)定組分中還含有l(wèi)-半胱氨酸重量8%的硫酸錳和l-半胱氨酸重量15%的天門(mén)冬氨酸；

本實(shí)施例中所述混合液凍干是指，將經(jīng)過(guò)低溫靜置的混合液在-50℃、真空度為0.2mbar的條件下真空冷凍干燥成固態(tài)；

本實(shí)施例中所述乳酸菌活化、培養(yǎng)是指，在mrs瓊脂培養(yǎng)基中接種乳酸菌，再利用液體mrs培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后收離心菌體，所得菌體用ph為7.4的pbs洗兩遍得到發(fā)酵液。

實(shí)施例3

一種乳酸菌凍干保護(hù)劑，按照質(zhì)量份數(shù)，其有效成分由14份的海藻糖、14份的脫脂奶粉、4份的復(fù)合添加組分和3.6份的滲透穩(wěn)定組分組成，其中，復(fù)合添加組分為甘油和山梨醇以3.5:1的重量比混合，滲透穩(wěn)定組分由l-半胱氨酸、維生素c和乙酸鈉以3.5:1.5:1的重量比混合；

上述乳酸菌凍干保護(hù)劑的制備方法，按照上述的比例分別稱量各組分，然后將海藻糖、脫脂奶粉、復(fù)合添加組分溶于63份的水中，并在105℃的條件下滅菌20min，最后加入稱量好的滲透穩(wěn)定組分，混合均勻即制得產(chǎn)品；

利用上述乳酸菌凍干保護(hù)劑制備乳酸菌凍干發(fā)酵劑的方法為，將乳酸菌活化、培養(yǎng)，而后離心富集得到發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入與其等體積的上述制備的凍干保護(hù)劑后，在無(wú)菌條件下混合均勻，并在3℃的無(wú)菌環(huán)境中靜置13h以增強(qiáng)菌體細(xì)胞的抗凍性，最后將上述混合液凍干即制得產(chǎn)品。

以上為本發(fā)明的基本實(shí)施方式，可在以上基礎(chǔ)上做進(jìn)一步的改進(jìn)、優(yōu)化和限定：

本實(shí)施例的一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還額外含有甘油重量11%的聚乙烯吡咯烷酮；

本實(shí)施例的另一種優(yōu)選方案為，所述復(fù)合添加組分中還可以額外含有甘油重量10%的甘露醇；

本實(shí)施例的再一種優(yōu)選方案為，所述滲透穩(wěn)定組分中還含有l(wèi)-半胱氨酸重量6%的硫酸錳和l-半胱氨酸重量12.5%的天門(mén)冬氨酸；

本實(shí)施例中所述混合液凍干是指，將經(jīng)過(guò)低溫靜置的混合液在-50℃、真空度為0.2mbar的條件下真空冷凍干燥成固態(tài)；

本實(shí)施例中所述乳酸菌活化、培養(yǎng)是指，在mrs瓊脂培養(yǎng)基中接種乳酸菌，再利用液體mrs培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后收離心菌體，所得菌體用ph為7.4的pbs洗兩遍得到發(fā)酵液。

為了驗(yàn)證本發(fā)明凍干保護(hù)劑的效果，特作以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較驗(yàn)證：

實(shí)驗(yàn)材料1：以上實(shí)施例3制備的乳酸菌凍干保護(hù)劑作為保護(hù)劑a；

實(shí)驗(yàn)材料2：常規(guī)的凍干保護(hù)劑作為保護(hù)劑b，其成分為：12份脫脂奶粉，12份蔗糖，1.5份谷氨酸鈉，0.3份甘油，0.2份維生素c；

實(shí)驗(yàn)材料3：將實(shí)施例3中的凍干保護(hù)劑去除復(fù)合添加組分后的剩余成分作為保護(hù)劑c；

實(shí)驗(yàn)材料4：將實(shí)施例3中的凍干保護(hù)劑去除滲透穩(wěn)定組分后的剩余成分作為保護(hù)劑d；

實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基：mrs培養(yǎng)基，mrs瓊脂培養(yǎng)基；

實(shí)驗(yàn)用主要儀器：德國(guó)christ真空冷凍干燥機(jī)，spx-250bs-ⅱ型生化培養(yǎng)箱；sw-cj-ifd型單人單面凈化工作臺(tái)，gi54dw型高壓滅菌器，高速冷凍離心機(jī)；

一、乳酸菌活化與培養(yǎng)方法：

乳酸菌的活化培養(yǎng)：將甘油凍存管中保藏菌種乳酸菌（干酪乳桿菌）用接種針在mrs瓊脂培養(yǎng)基平板中劃線，37℃恒溫培養(yǎng)16h，挑單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，液體傳兩代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

將活化后的干酪乳桿菌以2%接種量接種到液體mrs培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后收離心菌體，所得菌體用ph7.4的pbs洗兩遍，用于后續(xù)試驗(yàn)；

培養(yǎng)干酪乳桿菌所用的mrs液體培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨10.0g/l、牛肉膏8.0g/l、酵母膏4.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐溫801ml/l、磷酸氫二鉀2.0g/l、三水乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、七水硫酸鎂0.2g/l、硫酸錳0.05g/l，ph6.2±0.2；

mrs瓊脂培養(yǎng)基是在mrs液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂15g/l。

二、實(shí)驗(yàn)方法如下：

(1)保護(hù)劑的準(zhǔn)備

將上述的保護(hù)劑a、保護(hù)劑b、保護(hù)劑c和保護(hù)劑d按相同配比濃度用蒸餾水溶解，105℃滅菌20min后備用；

(2)凍干前乳酸菌計(jì)數(shù)

采用菌落平板計(jì)數(shù)法，即在無(wú)菌操作條件下，取lml的菌液，加9ml的滅菌生理鹽水．制成1:10的均勻稀釋液，再依次進(jìn)行10倍遞增稀釋，至適當(dāng)稀釋度10-6、10-7、l0-8后，分別取各稀釋濃度100μl于固體培養(yǎng)皿中，用涂玻棒使菌體分散均勻，倒置，放人37℃恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每毫升原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)，來(lái)表示活菌數(shù)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，重復(fù)3次；

(3)菌體的收集及保護(hù)劑的添加

取30ml菌液于已滅菌且編號(hào)的離心管4000rpm離心20min，去上清，加入30ml的已滅菌的pbs清洗兩遍；再于各管中分別加入已滅菌的30ml保護(hù)劑a、保護(hù)劑b、保護(hù)劑c和保護(hù)劑d重懸，將重懸液以lml分裝于5ml西林瓶中，并對(duì)應(yīng)編號(hào)；

(4)乳酸菌凍干及存活率計(jì)算

將已分裝的凍干保護(hù)劑菌懸液在溫度為4℃的環(huán)境中儲(chǔ)藏12h后，開(kāi)蓋，放入真空冷凍干燥機(jī)，凍干條件為：真空度0.2mbar，冷凍溫度-50℃，凍干時(shí)間24h；將蓋子壓緊，取出，即獲得乳酸菌凍干菌粉。

將凍干菌粉用無(wú)菌生理鹽水還原到凍干前體積，用菌落平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行凍干后乳酸菌計(jì)數(shù)。

細(xì)胞存活率（%）=凍干復(fù)水后1ml樣液的活菌數(shù)（cfu/ml）/凍干前1ml樣液的活菌數(shù)（cfu/ml）×100%。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加入保護(hù)劑a的樣品中細(xì)胞存活率為89.5%；

加入保護(hù)劑b的樣品中細(xì)胞存活率為72.3%；

加入保護(hù)劑c的樣品中細(xì)胞存活率為66.8%；

加入保護(hù)劑d的樣品中細(xì)胞存活率為61.7%；

由此可知，本發(fā)明的凍干保護(hù)劑相比較于市面上常見(jiàn)的保護(hù)劑來(lái)說(shuō)，其效果更好，而且由于保護(hù)劑a的細(xì)胞存活率遠(yuǎn)大于保護(hù)劑c和保護(hù)劑d，也就是說(shuō)，同時(shí)加入復(fù)合添加組分和滲透穩(wěn)定組分能夠起到復(fù)合增效作用，能夠進(jìn)一步的提高細(xì)胞存活率。

以上顯示和描述了本發(fā)明的主要特征、基本原理以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)根據(jù)實(shí)際情況有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。