本發(fā)明屬于藻類培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白核小球藻的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)屬于綠藻門、色球藻目、小球藻屬，是該屬植物中唯一具有蛋白核的種類。蛋白核小球藻細(xì)胞中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸、膳食纖維、維生素和微量元素等，具有很高的營養(yǎng)價值，是人類優(yōu)良的保健食品和水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料。已被中華人民共和國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品。蛋白核小球藻作為一類可再生能源生物質(zhì)可以在光自養(yǎng)和異養(yǎng)的培養(yǎng)條件下積累油脂，能有效利用太陽能和有機(jī)能進(jìn)行快速生長和積累油脂，蛋白核小球藻的油脂可以作為再生能源，用于制作生物柴油，生物柴油在替代化石燃料柴油上具有非常大的潛力。但目前蛋白核小球藻規(guī)模化培養(yǎng)存在著生長緩慢，生物量低，油脂含量低的問題，不利于大規(guī)模培養(yǎng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利于提高蛋白核小球藻生長速率、增大細(xì)胞密度，促進(jìn)油脂積累的培養(yǎng)方法，從而提高培養(yǎng)效率，特別適于規(guī)?；囵B(yǎng)的蛋白核小球藻培養(yǎng)方法。

本發(fā)明所提供的蛋白核小球藻的培養(yǎng)方法，是在培養(yǎng)蛋白核小球藻的培養(yǎng)基中添加了滅活的紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)和紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)細(xì)菌的發(fā)酵菌液；

所述的紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)，其實施例的一種優(yōu)選為莢膜紅細(xì)菌(rhodobactercapsulatus)；

所述的紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)細(xì)菌，其實施例的一種優(yōu)選為沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)；

所述的發(fā)酵菌液的培養(yǎng)基，具體組成如下：nh4cl1g/l、k2hpo40.5g/l、mgcl20.2g/l、酵母粉0.5g/l、醋酸鈉4g/l。發(fā)酵溫度為30℃，24小時持續(xù)光照，強(qiáng)度為10000lux，發(fā)酵時間為3天，每種細(xì)菌接種濃度1×10⁷個/ml。

所使用的蛋白核小球藻培養(yǎng)基，具體的組成如下：蛋白胨300-500mg/l，k2hpo416-21mg/l，mgso4·7h2o60-90mg/l，cacl2·2h2o30-42mg/l，檸檬酸鐵銨8-16mg/l，nahco310-30mg/l，微量元素溶液0.5-1.5ml/l。

上述的培養(yǎng)基中還可以添加植物生長素和維生素溶液。

所述的植物生長素為吲哚乙酸，維生素溶液為維生素b2溶液。

更具體的，所述的培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)時選用的溫度為30℃，24小時持續(xù)光照，強(qiáng)度為10000lux。

本發(fā)明的方法能夠使藻細(xì)胞快速生長，培養(yǎng)出的蛋白核小球藻細(xì)胞密度大，特別是由于添加了混合菌液，從而促進(jìn)藻細(xì)胞快速增殖，使得藻細(xì)胞濃度增大，油脂含量明顯增加，適于大批量規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1不同培養(yǎng)基濃度及其菌群對蛋白核小球藻油脂含量的影響圖。

具體實施方式

為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，但不能理解為對本發(fā)明的可實施范圍的限定。

下面對本發(fā)明所涉及的原料與方法描述如下：

本發(fā)明所使用的各種營養(yǎng)鹽(除植物生長素和維生素溶液外)可先配成濃度較高的母液，一般情況下母液配置為濃縮1000倍，配制母液(1)-(7)號時，藥品分別配制，分別存放；(8)號微量元素中的藥品按量配制后混合存放。各種母液配完后，分別用棕色玻璃瓶加蓋貯存，貼上標(biāo)簽，注明貯存液名稱、配制倍數(shù)、日期等，保存在冰箱冷藏室中。配制工作液培養(yǎng)基時，先輕輕搖動貯存液，如果發(fā)現(xiàn)有沉淀、懸浮物或被微生物所污染，該貯存液需要重配。最后根據(jù)配制的培養(yǎng)基體積用移液槍從各種貯存液中分別取出所需的用量，加營養(yǎng)鹽的過程中需不斷加水并攪拌，而且各種營養(yǎng)鹽按配方中提供的順序加入，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，加蒸餾水稀釋至所需濃度。配好的培養(yǎng)基用ph計調(diào)節(jié)至7.0，分裝，包扎后以0.103mpa，121℃，高壓蒸氣滅菌20min。

油脂提取及含量測定：稱取干藻粉m1，加入一定體積比為1：2的氯仿：甲醇溶液，振蕩混勻，以超聲波破碎機(jī)進(jìn)行萃取，時間為20-30min；再以3000r/min離心5min，取氯仿層溶液于預(yù)先稱重m2的玻璃離心管中，重復(fù)提取油脂3次后，將收集的氯仿層在氮氣中吹干并在真空干燥器中干燥，稱量至恒重m3，進(jìn)行稱量計算

總脂含量計算如下：總脂(％)＝100×(m3-m2)/m1。

尼羅紅染色法：取一定體積對數(shù)生長期中后期的藻液，8000r/min離心5min，去除上清，藻細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液洗兩次，采用體積分?jǐn)?shù)為20％的二甲基亞砜水溶液重懸藻細(xì)胞，使藻液od540值0.8，40℃水浴20min，按1ml藻液加15μl尼羅紅染料(質(zhì)量濃度為0.1mg/ml丙酮溶液)，混勻染色5min，激發(fā)波長480nm，測定其在575nm波長的熒光強(qiáng)度來篩查藻種總脂含量的大小。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。

實施例1：蛋白核小球藻與混合菌群共生系統(tǒng)的篩選及群落結(jié)構(gòu)鑒定

從哈爾濱市政污水廠生化池活性污泥中提取的水樣，裝入無菌取樣袋帶回實驗室，顯微鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)樣品微生物及藻類細(xì)胞較多，對相應(yīng)微藻以及微藻伴生菌群進(jìn)行富集、分離篩選。將原水樣投放模擬生化池反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)，將反應(yīng)器置于自然光照下，與預(yù)先制備好的模擬城市污水混勻，長時間曝氣處理，含氧量保持在6-8mg/l，32℃培養(yǎng)，ph7.5cod保持在400mg/l左右，tn50mg/l左右，tp10mg/l左右。通過改良的bg11培養(yǎng)基模擬城市污水，其模擬污水組成如下(mg/l)：蛋白胨400，磷酸二氫鉀18.5，七水硫酸鎂75.0，二水氯化鈣36，檸檬酸鐵銨12，碳酸氫鈉20，最后添加微量元素1ml。其中微量元素配方為(mg/l)：h3bo31660，mncl2·4h2o1860，znso4·7h2o220，na2moo4·2h2o21，cuso4·5h2o80，co(no3)2·6h2o50，nicl250，ki30。

根據(jù)檢測結(jié)果，當(dāng)培養(yǎng)體系中的cod降低至300mg/l時，添加100mg/l葡萄糖作為補(bǔ)充碳源。曝氣池中設(shè)置循環(huán)裝置，1.5l/min，折合5h可以循環(huán)一次水樣以利于水體回流和混勻，連續(xù)曝氣池培養(yǎng)超過20d后，得到一個活性穩(wěn)定，可以耐受一定有機(jī)濃度的活性菌藻共生系統(tǒng)(如下所述)，活菌數(shù)量維持在10⁹個/ml以上，微藻數(shù)量維持在10⁷個/ml。在廢水的處理過程中，水樣起始cod為100mg/l，生化處理采用逐步提高廢水比例的方法，使功能菌群逐步適應(yīng)高濃度市政污水環(huán)境。第一代馴化體系添加1/4的模擬廢水，補(bǔ)充3/4的蒸餾水，接種菌群，接種量20％(v/v)，30℃搖床，160rpm振蕩培養(yǎng)。2d后cod降解率為40.25％，繼續(xù)培養(yǎng)cod保持穩(wěn)定不再下降。轉(zhuǎn)接至第二代馴化培養(yǎng)基中，提高廢水比例。50％體積的模擬廢水加入50％體積的蒸餾水，接種量20％，30℃搖床培養(yǎng)。2d后檢測cod從初始的210.5mg/l降低至68.75mg/l，降解率為67.34％，如此往復(fù)，到第四代馴化體系中，培養(yǎng)基全部為模擬市政污水，活性微藻共生菌群對廢水的生化處理效果如表1所示。污水中cod降至37.53mg/l左右且保持活性穩(wěn)定，cod去除率為91.00％，與原污水廠生化池出水水質(zhì)相近，說明得到了一組穩(wěn)定菌藻共生系統(tǒng)，其在降低體系中的cod方面具有顯著效果。

表1菌藻共生系統(tǒng)馴化處理污水效果表

采用菌體部分回流法對富集得到的混合微藻菌群進(jìn)行篩選、鑒定和分離，并利用形態(tài)及分子手段對該菌藻共生系統(tǒng)進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌群中主要存在以下成員：紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)、類芽孢桿菌屬(paenibacillussp.)、腸桿菌(enterobactersp.)、色鹽桿菌(chromohalobactersp.)、金黃桿菌(chryseobacteriumsp.)，總數(shù)到80％以上。其中紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)和紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)比例最高，分別達(dá)到21％和19％，其次是類芽孢桿菌屬(paenibacillussp.)和腸桿菌(enterobactersp.)比例均為11％，色鹽桿菌(chromohalobactersp.)和金黃桿菌(chryseobacteriumsp.)分別占10％和9％?；钚约?xì)菌微生物群落中，紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)和類芽孢桿菌屬(paenibacillussp.)廣泛存在于自然界及各大污水處理廠生化池中，自養(yǎng)或者異氧條件下均可生長，參與碳、氮及磷元素等物質(zhì)轉(zhuǎn)化及循環(huán)。腸桿菌(enterobacter)以及色鹽桿菌(chromohalobacter)具有一定嗜鹽性，具有一定降解有機(jī)物功能，在各類污水中廣泛存在的微生物。金黃桿菌(chryseobacterium)存在市政及化工廢水處理的功能菌群中，同時可以降解芳烴類及苯類等有機(jī)物。

通過上述方法及手段，發(fā)現(xiàn)微藻主要種類包括兩種微藻：小球藻(chlorellasp.)及柵藻(scenedesmussp.)，其中小球藻占到總數(shù)的90％。通過尼羅紅染色法對兩株微藻進(jìn)行油脂含量測定，發(fā)現(xiàn)小球藻油脂含量達(dá)到21.25％，總脂產(chǎn)率達(dá)到113.8mg/(l·d)，柵藻油脂含量達(dá)到18.76％，總脂產(chǎn)率達(dá)到87.8mg/(l·d)。本發(fā)明通過16srrna等分子生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定，確定本發(fā)明方法中的富油微藻小球藻(chlorellasp.)為蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)。

實施例2：復(fù)配菌群及活性驗證

模擬實施例1中光合細(xì)菌微生物群落紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)和紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)的組成比例，和蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)進(jìn)行復(fù)配。其中紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)選用具體種莢膜紅細(xì)菌(rhodobactercapsulatus)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)選用具體種為澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)。其中單菌(藻)分別用lb培養(yǎng)基活化，活化后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，而蛋白核小球藻添加濃度大于兩種光合細(xì)菌濃度兩個數(shù)量級，復(fù)配得到的微生物菌藻系統(tǒng)按照具體實施方式所述油脂含量檢測方法，分析復(fù)配菌群對蛋白核小球藻油脂含量的影響。培養(yǎng)結(jié)束后蛋白核小球藻油脂含量為35.43％，且生長穩(wěn)定，藻細(xì)胞密度達(dá)到5×10⁷個/ml，總脂產(chǎn)率達(dá)到133.9mg/(l·d)。上述結(jié)果表明配制的復(fù)合菌群驗證了實施例1中功能菌群對蛋白核小球藻產(chǎn)油脂的促進(jìn)作用，同時說明兩種單菌復(fù)配得到的菌群對于藻生長密度以及油脂含量以及污水cod去除效率的影響優(yōu)于實施例1中篩選的菌藻共生系統(tǒng)，分別提高了400％，66.73％和7.79％。

實施例3：不同培養(yǎng)基濃度及其菌群濃度對蛋白核小球藻生長及油脂含量的優(yōu)化

用無菌水配置如下配方的蛋白核小球藻優(yōu)化后培養(yǎng)基：蛋白胨300mg/l，kh2po416mg/l，mgso4·7h2o60mg/l，cacl2·2h2o30mg/l，檸檬酸鐵銨8mg/l，nahco310mg/l，微量元素溶液0.5ml/l；還包括植物生長素吲哚乙酸1.0mg/l和維生素b2溶液0.5mg/l。包括莢膜紅細(xì)菌(rhodobactercapsulatus)、紅澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)的混合菌群發(fā)酵液10ml，其中兩種菌種接種配比為1:1。其混合菌群發(fā)酵液具體組成如下：nh4cl1g/l、k2hpo40.5g/l、mgcl20.2g/l、酵母粉0.5g/l、醋酸鈉4g/l。發(fā)酵溫度為30℃，24小時持續(xù)光照，強(qiáng)度為10000lux，發(fā)酵時間為3天，接種比例1：1，每種細(xì)菌接種濃度1×10⁷個/ml。取對數(shù)生長期的蛋白核小球藻接種到該培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時持續(xù)光照，強(qiáng)度約為10000lux，培養(yǎng)溫度控制30攝氏度左右，每天手動搖動兩次，防止沉淀貼壁，定期記錄培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的細(xì)胞濃度。另外使用bg-11培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，不外加混合菌群發(fā)酵液以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)作為對照實驗組。在對數(shù)生長期中后期測量各實驗組藻密度值，詳見表2；同時對蛋白核小球藻油脂含量進(jìn)行測定，詳見圖1。

表2不同菌群配比濃度及營養(yǎng)濃度對蛋白核小球藻生長影響對比表

實施例4：不同培養(yǎng)基濃度及其菌群濃度對蛋白核小球藻生長及油脂含量的優(yōu)化

用無菌水配置如下配方的蛋白核小球藻優(yōu)化后培養(yǎng)基：蛋白胨300mg/l，kh2po416mg/l，mgso4·7h2o60mg/l，cacl2·2h2o30mg/l，檸檬酸鐵銨8mg/l，nahco310mg/l，微量元素溶液0.5ml/l；還包括植物生長素吲哚乙酸1.0mg/l和維生素b2溶液0.5mg/l。包括紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)和紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)混合菌群發(fā)酵液30ml，混合菌群發(fā)酵液組成、發(fā)酵條件及菌藻接種比例同實施例3。取對數(shù)生長期的蛋白核小球藻接種到該培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時持續(xù)光照，強(qiáng)度約為10000lux，培養(yǎng)溫度控制30攝氏度左右，每天手動搖動兩次，防止沉淀貼壁，定期記錄培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的細(xì)胞濃度。另外使用bg-11培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，不外加混合菌群發(fā)酵液以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)作為對照實驗組。在對數(shù)生長期中后期測量各實驗組藻密度值，詳見表3；同時對蛋白核小球藻油脂含量進(jìn)行測定，詳見圖1。

表3不同菌群配比濃度及營養(yǎng)濃度對蛋白核小球藻生長影響對比表

實施例5：不同培養(yǎng)基濃度及其菌群濃度對蛋白核小球藻生長及油脂含量的優(yōu)化

用無菌水配置如下配方的蛋白核小球藻優(yōu)化后培養(yǎng)基：蛋白胨500mg/l，kh2po421mg/l，mgso4·7h2o90mg/l，cacl2·2h2o42mg/l，檸檬酸鐵銨16mg/l，nahco330mg/l，微量元素溶液1.5ml/l；還包括植物生長素吲哚乙酸5.0mg/l和維生素b2溶液1.0mg/l。包括紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)和紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)混合菌群發(fā)酵液10ml，混合菌群發(fā)酵液組成、發(fā)酵條件及菌藻接種比例同實施例3。取對數(shù)生長期的蛋白核小球藻接種到該培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時持續(xù)光照，強(qiáng)度約為10000lux，培養(yǎng)溫度控制30攝氏度左右，每天手動搖動兩次，防止沉淀貼壁，定期記錄培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的細(xì)胞濃度。另外使用bg-11培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，不外加混合菌群發(fā)酵液以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)。在對數(shù)生長期中后期測量各實驗組藻密度值，詳見表4；同時對蛋白核小球藻油脂含量進(jìn)行測定，詳見圖1。

表4不同菌群配比濃度及營養(yǎng)濃度對蛋白核小球藻生長影響對比表

實施例6：不同培養(yǎng)基濃度及其菌群濃度對蛋白核小球藻生長及油脂含量的優(yōu)化

用無菌水配置如下配方的蛋白核小球藻優(yōu)化后培養(yǎng)基：蛋白胨500mg/l，kh2po421mg/l，mgso4·7h2o90mg/l，cacl2·2h2o42mg/l，檸檬酸鐵銨16mg/l，nahco330mg/l，微量元素溶液1.5ml/l；還包括植物生長素吲哚乙酸5.0mg/l和維生素b2溶液1.0mg/l。包括紅細(xì)菌屬(rhodobactersp.)和紅假單胞菌屬(rhodopseudomonassp.)混合菌群發(fā)酵液30ml，混合菌群發(fā)酵液組成、發(fā)酵條件及菌藻接種比例同實施例3。取對數(shù)生長期的蛋白核小球藻接種到該培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時持續(xù)光照，強(qiáng)度約為10000lux，培養(yǎng)溫度控制30攝氏度左右，每天手動搖動兩次，防止沉淀貼壁，定期記錄培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的細(xì)胞濃度。另外使用bg-11培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，不外加混合菌群發(fā)酵液以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)。在對數(shù)生長期中后期測量各實驗組藻密度值，詳見表5；同時對蛋白核小球藻油脂含量進(jìn)行測定，詳見圖1。

表5不同菌群配比濃度及營養(yǎng)濃度對蛋白核小球藻生長影響對比表

從以上結(jié)果看出，使用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基比使用單獨bg-11培養(yǎng)基可以快速地使蛋白核小球藻增殖，使蛋白核小球藻提前進(jìn)入對數(shù)增長期，縮短其培養(yǎng)時間。從圖1可以看出，各實施例最優(yōu)培養(yǎng)條件下蛋白核小球藻油脂含量對比對照培養(yǎng)基bg-11有顯著性的提高，由此說明本發(fā)明提供的蛋白核小球藻培養(yǎng)方法具有明顯的培養(yǎng)優(yōu)勢，更利于藻細(xì)胞的快速生長，同時促進(jìn)油脂含量提高。

以上所述僅為本發(fā)明示意性的具體實施方式，并非用以限定本發(fā)明的范圍。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和原則的前提下所作出的等同變化與修改，均應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。