專利名稱：從人造血干細(xì)胞分化的CD8α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人造血干細(xì)胞分化的淋巴樹突細(xì)胞，從人造血干細(xì)胞分化淋巴樹突細(xì)胞的方法和用于免疫治療，含有作為活性成分的淋巴樹突細(xì)胞的藥物組合物。
背景技術(shù)：
樹突細(xì)胞(DC)是強(qiáng)有力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，其協(xié)調(diào)針對(duì)特定抗原的各種免疫反應(yīng)，并且通過除去潛在自身反應(yīng)性的T細(xì)胞同時(shí)抑制自身免疫反應(yīng)。
鼠DC基于它們的解剖學(xué)定位，移植實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞表面表型可以細(xì)分為至少兩種獨(dú)特的亞型，髓樣DS和淋巴DC。具有CD11c+，MHCII+，CD4+，CD8α-細(xì)胞表面表型的DC被稱為CD8α-髓樣DC，它能夠由骨髓前體細(xì)胞獲得，而具有CD11c+，MHCII+，CD4-，CD8α+細(xì)胞表面表型的DC被稱為CD8α+淋巴DC，它們存在于胸腺或脾臟中。
已經(jīng)報(bào)道鼠CD8α+淋巴DC對(duì)類似IL-12的NK細(xì)胞(天然殺傷細(xì)胞)和T細(xì)胞反應(yīng)也產(chǎn)生IFN-γ(Toshiaki等.，Brief Definitive Report，189(12)，1981-1986(1999))，而且，當(dāng)將淋巴DC如鼠朗氏細(xì)胞注射入CD8α-小鼠中時(shí)，它們被轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)并分化成為CD8α+DC，并且分化了的CD8α+DC能產(chǎn)生IFN-γ(Miriam等.，Blood，96(5)，1865-1872(2000))。
此淋巴DC不僅誘導(dǎo)免疫耐受，而且行使強(qiáng)有力免疫原性的APC的職責(zé)抵抗各種同種異型抗原，通過合成IL-12和IFN-γ激活輔助性T細(xì)胞I型反應(yīng)。
DC實(shí)際上存在于身體的所有組織中，但濃度很低，因此對(duì)于來自體內(nèi)的操作，要獲得足夠數(shù)量的DC是困難的和麻煩的。
因此，使用例如幾種細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-4(IL-4)，腫瘤壞死因子(TNF-α)和干細(xì)胞因子(SCF)，已經(jīng)進(jìn)行各種努力從HSC或單核細(xì)胞大規(guī)模地產(chǎn)生來自體內(nèi)的DC。通過使用GM-CSF產(chǎn)生了表達(dá)CD1a+，CD4+，CD11c+，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，I+類HLA，II+類HLA，CD3-，CD8-和CD14-的DC(Williams等.，Int.Rev.Cytol.，153412(1994)；Santiago-Schwarz等.，Nature，360258(1993)；和Rosenzwajg等.，Blood，87535(1996))。
然而，尚沒有過報(bào)道CD8α+免疫表型的DC(CD8α+DC)在人體內(nèi)存在，或者CD8α+DC能夠從人造血干細(xì)胞(HSC)分化而來。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的首要目的是提供一種CD8α+免疫表型的淋巴樹突細(xì)胞，其是從人造血干細(xì)胞分化而來。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種從人造血干細(xì)胞分化淋巴樹突細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于免疫治療的包含淋巴樹突細(xì)胞的藥物組合物。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種在哺乳動(dòng)物中治療免疫相關(guān)疾病的方法。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了CD8α+免疫表型的淋巴樹突細(xì)胞，其是從人造血干細(xì)胞分化而來。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種分化淋巴樹突細(xì)胞的方法，該方法包括分兩步培養(yǎng)人造血干細(xì)胞，第一步在含有GM-CSF的第一種培養(yǎng)基中，接著在含有IFN-γ的第二種培養(yǎng)基中。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于免疫治療的藥物組合物，其包括治療有效量的樹突細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種在哺乳動(dòng)物中治療免疫相關(guān)疾病的方法，它包括以對(duì)治療該疾病有效的量將淋巴樹突細(xì)胞對(duì)需要其的受試者給藥。
附圖簡述本發(fā)明的上述和其它目的和特征從結(jié)合下述附圖的本發(fā)明的下述描述中將變得明顯，其中

圖1A，1B和1C從人造血干細(xì)胞分化的淋巴樹突細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡(A)，掃描電子顯微鏡(B)和透射電子顯微鏡(C)照片；圖2樹突細(xì)胞數(shù)依賴于培養(yǎng)時(shí)間的變化圖3A和3B說明淋巴樹突細(xì)胞免疫表型的柱狀圖(A培養(yǎng)7天后的細(xì)胞；B培養(yǎng)14天后的細(xì)胞；x軸細(xì)胞數(shù)；y軸熒光強(qiáng)度；空心的柱狀圖(open histogram)陰性對(duì)照，填充的柱狀圖對(duì)于細(xì)胞表面抗原陽性的細(xì)胞組)；圖4A和4B說明淋巴樹突細(xì)胞免疫表型的柱狀圖(A僅染色CD3和CD4，B僅染色CD3和CD8α)；圖5A，5B和5C吞噬FITC-標(biāo)記的葡聚糖的能力(A對(duì)照；B培養(yǎng)1周后的細(xì)胞組；C培養(yǎng)2周后的細(xì)胞組；空心的柱狀圖陰性對(duì)照，填充的柱狀圖吞噬FITC-標(biāo)記的葡聚糖的細(xì)胞組)；圖6刺激T細(xì)胞增殖的能力(◆培養(yǎng)1周后的細(xì)胞組，■培養(yǎng)2周后的細(xì)胞組)；圖7A和7BELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)結(jié)果說明CD的IL-12(A)和IFN-γ(B)的合成能力(1用GM-CSF培養(yǎng)1周后產(chǎn)生的蛋白量；2用GM-CSF培養(yǎng)1周后，接著用IFN-γ培養(yǎng)一周后產(chǎn)生的蛋白量；3用GM-CSF培養(yǎng)1周并用IFN-δ培養(yǎng)一周，接著與添加的離子霉素培養(yǎng)1天后產(chǎn)生的蛋白量)發(fā)明詳述本發(fā)明的CD8α+淋巴樹突細(xì)胞具有CD1a-，CD3-，CD4-，CD8+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+的免疫表型。
CD8α+淋巴樹突細(xì)胞可以通過兩步培養(yǎng)造血干細(xì)胞來制備，第一步在含有GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的第一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)合適的一段時(shí)間例如3-9天，接著在含有IFN-γ(干擾素-γ)的第二種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，例如3-9天。
在本發(fā)明的方法中，可將GM-CSF和IFN-γ每2-4天，優(yōu)選3天，加入到培養(yǎng)基中，加入量分別為1-1,000ng/ml和1-1,000U/ml，優(yōu)選分別為20-200ng/ml和50-500U/ml。
為了增強(qiáng)成熟DC的分化，優(yōu)選在第二階段培養(yǎng)的較后部分向第二種培養(yǎng)基中加入離子霉素，脂多糖(LPS)或血藍(lán)蛋白(KLH)，加入量為0.1-10μg/ml，優(yōu)選1μg/ml，并培養(yǎng)直至第二培養(yǎng)時(shí)期結(jié)束，優(yōu)選1天。
本發(fā)明的CD8α+淋巴樹突細(xì)胞具有優(yōu)勢(shì)在于可以高產(chǎn)率生產(chǎn)白介素-12和IFN-γ；可刺激T細(xì)胞增殖；并且可以通過活化輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的CD8α+淋巴樹突細(xì)胞可以作為免疫治療免疫相關(guān)疾病的藥物組合物的活性成分使用?？梢酝ㄟ^使用本發(fā)明的CD8α+淋巴樹突細(xì)胞治療的免疫相關(guān)疾病的非限制實(shí)施例，包括任何種類的惡性疾病，結(jié)核感染，HIV感染和自身免疫疾病。
預(yù)防或治療免疫相關(guān)疾病的藥物組合物可以通過將本發(fā)明的CD8α+淋巴樹突細(xì)胞與藥用賦形劑或載體混合來制備，或按照任何常規(guī)程序通過將其用藥用稀釋劑稀釋來制備。合適的載體，賦形劑和稀釋劑的實(shí)例是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，水和礦物油。制劑可另外包括填料，抗凝集劑，防腐劑等。可通過使用本領(lǐng)域熟知的任何程序來配制本發(fā)明的藥物組合物，以便在將它們對(duì)哺乳動(dòng)物給藥后，提供活性成分的迅速，持續(xù)或延遲的釋放。因此，制劑可以是無菌的可注射溶液，混懸液，乳劑，溶液等形式，其中無菌可注射溶液是優(yōu)選的。
因此，本發(fā)明還提供一種在哺乳動(dòng)物中治療免疫相關(guān)疾病的方法，其包括以對(duì)治療疾病有效的量對(duì)需要其的受試者給藥本發(fā)明的CD8α+淋巴樹突細(xì)胞。
可用常規(guī)免疫治療方法對(duì)患者給藥本發(fā)明的CD8α+淋巴樹突細(xì)胞。具體地，從患者身上取得自身細(xì)胞并培養(yǎng)以獲得具有免疫增強(qiáng)作用的DC，并且用靶抗原脈沖(pulse)DC。在這個(gè)過程中，為了提高DC的免疫增強(qiáng)作用，可存在放射物或紫外處理過的癌細(xì)胞、通過冷凍-熔化或細(xì)胞毒性藥物殺死的癌細(xì)胞裂解物的條件下脈沖DC。另一個(gè)方法是使用DNA，RNA，蛋白或多肽作為抗原脈沖DC。用特定抗原脈沖的DC可直接注入患者，或可注射由本發(fā)明DC激活的T細(xì)胞。另外，為了增強(qiáng)治療效果，優(yōu)選與IL-2一起注射本發(fā)明的DC。
可通過各種路徑給藥本發(fā)明的細(xì)胞組合物，包括透皮的，皮下的，靜脈內(nèi)的和肌內(nèi)引入，和直接注射入癌癥區(qū)域。
CD8α+淋巴樹突細(xì)胞的典型單位劑量可在1×107-1×109細(xì)胞的范圍內(nèi)變動(dòng)，并且它們可以以每周或每月的形式給藥，給藥6個(gè)月。然而，應(yīng)該了解實(shí)際給藥的活性成分的量應(yīng)該按照各種相關(guān)因素確定，包括治療的疾病，患者癥狀的嚴(yán)重性，選擇的給藥路線，年齡，性別和個(gè)體患者的體重；因此，不應(yīng)以任何方式用上述劑量意圖限制本發(fā)明的范圍。
使用本發(fā)明的藥物組合物的免疫治療是有利的，因?yàn)橛捎谑褂脧幕颊咴煅杉?xì)胞分化的樹突細(xì)胞，不發(fā)生免疫排斥，還因?yàn)樽⑸溥M(jìn)身體的樹突細(xì)胞能不斷產(chǎn)生細(xì)胞因子。
發(fā)明的藥物組合物誘導(dǎo)針對(duì)由特定抗原引起的疾病的強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫-反應(yīng)，刺激T細(xì)胞增殖，并且它可以在抗癌和抗病毒治療中被有益地使用。
下述實(shí)施例意圖進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明而不限制其范圍；除非另外聲明，在本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)方法可以按照這下面給出的實(shí)施例實(shí)施。
另外，除非另外特殊說明，下面給出的固體在固體混合物中，液體在液體中和固體在液體中的百分比分別是基于重量/重量，體積/體積和重量/體積。
實(shí)施例1提取造血干細(xì)胞和產(chǎn)生樹突細(xì)胞為了使外周血干細(xì)胞(PBSC)活動(dòng)，將粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF，Lenograstim，chugai，Co.，Tokyo，日本)以300μg/天的劑量分別皮下注射入10位患不同腫瘤疾病(乳腺癌，白血病，淋巴瘤)的患者中。在注射4天后，按照白細(xì)胞提取的方法，使用Cobe Spectra(Cobe BCT，Inc.，Lakewood，CO，美國)細(xì)胞分離器提取外周血干細(xì)胞。使用Ficoll-Hypaque(Histopaque，Sigma Chemical，St.Louis，MO，美國)，按照密度梯度離心的方法，從如此獲得的外周血干細(xì)胞中分離單核細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS，Sigma Chemical)洗滌兩次。在含有5％小牛血清蛋白(BSA)的PBS中用30μm的尼龍網(wǎng)膜過濾該單核細(xì)胞。收集單核細(xì)胞，加入FcR封閉劑，與CD34微球(Miltenyi Biotec GmbH)在4℃反應(yīng)30分鐘，用含BSA的PBS洗滌，讓細(xì)胞通過網(wǎng)孔，并通過高梯度免疫磁性分離法(HGIS；MidiMACS，Mitenyi biotech，美國)分離CD34+單核細(xì)胞。將1×105/ml分離的CD34+外周血干細(xì)胞在X-VIVO 20培養(yǎng)基(Biowhittaker，Walkersville，MD，美國)中培養(yǎng)兩周，所述培養(yǎng)基中含有5％的人血清白蛋白，100U/ml的青霉素，100μg/ml的鏈霉素(Sigma)，100U/ml的L-谷氨酰胺(Sigma)，同時(shí)在第一周每三天加入50ng/ml的GM-CSF(Leucogen，LG Chemical Co.，韓國)，接著在第二周每三天加入200U/ml的IFN-γ(Intermax-γ，LG Chemical Co.，韓國)。在第13天，即第二周結(jié)束的前一天，向培養(yǎng)基中加入1μg/ml的離子霉素(Sigma)并培養(yǎng)1天以使細(xì)胞成熟。
如圖1所示，培養(yǎng)的細(xì)胞具有相對(duì)豐富的細(xì)胞質(zhì)，所述細(xì)胞質(zhì)具有多個(gè)樹突(Giemsa-Wright stain)。在培養(yǎng)早期，細(xì)胞集群并且在培養(yǎng)瓶的表面聚結(jié)，但在培養(yǎng)第二周加入IFN-γ時(shí)開始分離并且繁殖。另外，如在掃描和透射電子顯微鏡中可見，細(xì)胞展現(xiàn)了DC的特征核被移至區(qū)域的一邊；在細(xì)胞表面存在多個(gè)樹突；并且豐富的細(xì)胞質(zhì)具有許多顆粒。
另一方面，為了檢驗(yàn)樹突細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)時(shí)間-依賴性的增加，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢驗(yàn)1ml的一周和兩周后的培養(yǎng)溶液的樣品。
如圖2所示，總細(xì)胞量在培養(yǎng)期內(nèi)，特別時(shí)在加入IFN-γ之后連續(xù)增長。在第14天，培養(yǎng)的最后一天，細(xì)胞量約為30×105/ml，比初始細(xì)胞量高約30倍。
實(shí)施例2檢驗(yàn)分化的DC的免疫表型為了證實(shí)培養(yǎng)的DC的免疫表型，在暗室中，在含5％FBS(胎牛血清(fatal bovine serum))的PBS溶液中，于室溫下，將1×105細(xì)胞與熒光素異硫氰酸酯或藻紅蛋白標(biāo)記的特定單克隆抗體反應(yīng)15分鐘，該單克隆抗體是針對(duì)CD1a，CD3，CD4，CD8α，CD11c，CD14，CD80，CD83，CD86，I類HLA(ABC)，II類HLA(DR)(Pharmingen，San diego，CA，美國)，得到的溶液再用PBS洗滌，然后用流式細(xì)胞儀(FACScan，Becton Dickinson)分析。
如圖3A和3B所示，在培養(yǎng)的第7天，細(xì)胞表達(dá)CD1a，CD11c以及CD40，CD54，CD80，CD86和I/II類HLA。然而，CD83+，成熟DC的標(biāo)記，微弱的表達(dá)。離子霉素的加入將CD1a和CD14轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮员硇停⑶褻D83+表型的細(xì)胞增加。另外，如圖4A和4B所示，細(xì)胞展示CD3和CD4的陰性表型，而CD8α表型是陽性的。
這些結(jié)果暗示，從人造血干細(xì)胞分化的淋巴樹突細(xì)胞是表達(dá)CD1a-，CD3-，CD4-，CD8α+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+，以及最令人感興趣的CD8α+的淋巴DC。
實(shí)施例3證實(shí)CD8α+DC的吞噬能力為了確認(rèn)分化DC的吞噬能力，將2×105DC在沒有FBS的情況下與葡聚糖-FITC(Sigma)在37℃混合孵育1小時(shí)。然后，用流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)吞沒葡聚糖的細(xì)胞。
如圖5B和5C所示，CD8α+CD具有高吞噬能力。另外，在培養(yǎng)的第14天，進(jìn)一步增強(qiáng)吞噬能力。在4℃的對(duì)照實(shí)驗(yàn)(5A)顯示觀察到的本發(fā)明的CD8α+CD的吞噬活性是真實(shí)的，不是由測(cè)量條件產(chǎn)生的人為結(jié)果。
實(shí)施例4檢驗(yàn)CD8α+CD在淋巴細(xì)胞增殖中的誘導(dǎo)能力(inductingability)為了檢驗(yàn)DC刺激T細(xì)胞增殖的能力，如下進(jìn)行異源混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。
使用Ficoll-Hypaque(Histopaque；Sigma Chemical，St.Louis，MO，美國)，按照密度梯度離心方法從正常的志愿者的血液中分離外周單核細(xì)胞(MNC)，并用PBS洗滌。室溫下，將如此獲得的3×108MNC在人T細(xì)胞富集柱(R&D，美國)中孵育10分鐘，用PBS提取T細(xì)胞。然后，將γ-射線照射過的(30Gy)DC和T細(xì)胞(效應(yīng)物∶反應(yīng)者)以1∶1，1∶10，1∶102，1∶103和1∶104的不同比例加入到微量培養(yǎng)板，一式三份，接著37℃孵育3天。向其中加入20μl的BrdU(5-溴-2’-脫氧尿苷)并且再孵育24小時(shí)。向培養(yǎng)板中加入甲醛，并在室溫下反應(yīng)30分鐘以固定細(xì)胞，向培養(yǎng)板中加入100μl抗-BrdU溶液，允許在室溫下反應(yīng)90分鐘。然后，用PBS洗滌培養(yǎng)板，并與顯色底物反應(yīng)30分鐘。向其中加入1N H2SO4以終止反應(yīng)，并用ELSA培養(yǎng)板讀數(shù)器(Molecular device，美國)測(cè)量450nm的吸光度。
如圖6中的結(jié)果顯示，觀察到在1∶104(效應(yīng)物∶反應(yīng)者)的比例下，T細(xì)胞增殖的爆發(fā)。這說明淋巴DC在功能上可以刺激T淋巴(lymphoid)的增殖。
實(shí)施例5確認(rèn)淋巴DC釋放細(xì)胞因子如下通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)測(cè)量細(xì)胞的釋放細(xì)胞因子的能力。
將抗-人IL-12和IFN-γ抗體(Pharmingen)在0.1mol/l的NaHCO3中稀釋至2μg/ml，將50μl獲得的溶液分到ELISA培養(yǎng)板(Corning)，在4℃孵育24小時(shí)。加入含5％FBS的PBS以封閉培養(yǎng)板3小時(shí)。向其中加入50μl的標(biāo)樣和50μl培養(yǎng)7天，13天和14天的每種培養(yǎng)液，并反應(yīng)4小時(shí)。
將2μl/mg的生物素-偶聯(lián)的檢測(cè)抗體加入到培養(yǎng)板中并反應(yīng)3小時(shí)。洗滌培養(yǎng)板，并用鏈霉抗生物素辣根過氧化物酶溶液(稀釋至1∶2000)處理1小時(shí)，再次洗滌，然后用TMB(Zymed，San Francisco，CA，美國)處理，接著用ELISA微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(Molecular device，USA)測(cè)量450nm的吸光度。
如圖7A和7B中的結(jié)果顯示，產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量一直到第13天都非常低，但在加入離子霉素后跳到高水平。
雖然關(guān)于上述具體的實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，但應(yīng)承認(rèn)那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和改變，這些修改和改變也屬于如后附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種CD8α+免疫表型的淋巴樹突細(xì)胞，它是由人造血干細(xì)胞分化而來。
2.權(quán)利要求1的淋巴樹突細(xì)胞，它具有CD1a-，CD3-，CD4-，CD8α+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+的免疫表型。
3.權(quán)利要求1的淋巴樹突細(xì)胞，它能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生白介素-12(IL-12)和干擾素-γ(IFN-γ)。
4.一種分化權(quán)利要求1的淋巴樹突細(xì)胞的方法，該方法包括分兩步培養(yǎng)人造血干細(xì)胞，第一步在含有GM-CSF的第一種培養(yǎng)基中，接著在含有IFN-γ的第二種培養(yǎng)基中。
5.權(quán)利要求4的方法，其中每2-4天分別以1-1,000ng/ml和1-1,000U/ml的量向所述各自的培養(yǎng)基中添加GM-CSF和IFN-γ。
6.權(quán)利要求4的方法，其還包括在所述第二步培養(yǎng)的過程中，向所述第二種培養(yǎng)基中加入0.01-10μg/ml的離子霉素，脂多糖(LPS)或血藍(lán)蛋白(KLH)的步驟。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述淋巴樹突細(xì)胞的免疫表型是CD1a-，CD3-，CD4-，CD8α+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述淋巴樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生白介素-12(IL-12)和干擾素-γ(IFN-γ)。
9.一種用于免疫治療的藥物組合物，它包括治療有效數(shù)量的、權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的樹突細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述免疫治療是一種抗癌或抗病毒治療。
11.一種在哺乳動(dòng)物中治療免疫相關(guān)疾病的方法，它包括以對(duì)治療疾病有效的量將權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的淋巴樹突細(xì)胞對(duì)需要其的受試者給藥。
全文摘要
用一種方法可以生產(chǎn)具有CD8α
文檔編號(hào)A61P37/04GK1543502SQ02807665
公開日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月29日
發(fā)明者金炫壽, 李京福, 金孝哲 申請(qǐng)人:金炫壽