專(zhuān)利名稱(chēng)：一類(lèi)能將間充質(zhì)干細(xì)胞分化為造血細(xì)胞的小rna分子及其作用靶點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因藥物領(lǐng)域，更具體地，涉及一種具有特定序列的小的 發(fā)夾RNA，其通過(guò)抑制E1A樣的分化抑制因子的表達(dá)，從而將間充質(zhì)干 細(xì)胞分化成造血細(xì)胞。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞移植是治療某些難以治愈的疾病的一種有希望的新興治 療技術(shù)。然而，造血干細(xì)胞的來(lái)源仍然是阻礙造血干細(xì)胞治療技術(shù)在臨床 上發(fā)揮功效的主要障礙之一。尋找其它來(lái)源的干細(xì)胞并使之分化成造血干 細(xì)胞是目前科學(xué)家們研究的重要課題。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是各國(guó)科學(xué)家 研究的比較多的一種干細(xì)胞，與造血干細(xì)胞(HSC) —樣，兩者都具有自 我更新的能力和維持器官的造血功能。組織培養(yǎng)擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 區(qū)別于造血干細(xì)胞的特征是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)CD45和CD31分子 (1)。盡管近來(lái)有報(bào)道認(rèn)為，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能 夠被誘導(dǎo)分化成造血干細(xì)胞(2)，但大多數(shù)的研究人員仍然認(rèn)為體外培養(yǎng) 尚不能將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞(4-5)。因此尋找新的方法 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成造血干細(xì)胞在拓展干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用具 有重要意義。
近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型的造血細(xì)胞中小RNA的表達(dá)顯著不同， 而且這種不同在細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。例如，miR-181 和B-淋巴細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)(6)， miR-142和miR-223與T-淋巴細(xì)胞的發(fā)育 有關(guān)，miR-221和miR-222與人的紅細(xì)胞生成有關(guān)(7), miR-223和小鼠 的粒細(xì)胞分化相關(guān)，而miR-lO， miR-126和miR-17與巨核細(xì)胞減少有關(guān) (8)。除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)某些小RNA，如miR-128和miR-181，能起 到阻止造血干細(xì)胞分化的作用(9)。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些miRNA，例如 miR-130a和miR-10a，通過(guò)作用HOXAl基因和MAFB基因的轉(zhuǎn)錄因子基
因從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化，人們?nèi)匀徊磺宄欠衲骋粋€(gè)miRNA或者其它的小 RNA就能決定細(xì)胞的自我更新過(guò)程，并能在細(xì)胞發(fā)育的早期階段將骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為造血干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種具有特定序列的小的發(fā)夾RNA，其通過(guò)抑制E1A樣 的分化抑制因子(EID1)的表達(dá)，從而將間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化成造 血細(xì)胞干細(xì)胞(HSC)。
本發(fā)明的核心內(nèi)容有以下六個(gè)方面。
第一方面，本發(fā)明提供了一種能將非造血干細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞的 短發(fā)夾核酸shR-337或其衍生物，所述短發(fā)夾核酸shR-337具有核心核苷 酸 序 列 5'-GAUCCCGUGUAACACAAUGGUGAGUAUUUG acuagaauauaCAAAUACUCACCAUUGUGUUACAUUUUUUGGAAA-3'
(SQE. ID. No.l)。該短發(fā)夾核酸的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生于人體蛋白質(zhì)編碼基因 Si^/^"i^的第一個(gè)內(nèi)含子部位，與外源的短發(fā)夾核酸類(lèi)似，該短發(fā)夾核酸 的莖部的兩條鏈呈完全互補(bǔ)，包含至少21個(gè)核苷酸 (ACAUUGUGUUACCACUCAUAA，見(jiàn)圖1B)。這類(lèi)小核酸能夠在造血 干細(xì)胞中高豐度表達(dá)，而在非造血干細(xì)胞中，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表 達(dá)豐度很低。由此衍生的含有上述核酸的核心結(jié)構(gòu)的小RNA，包括不同 長(zhǎng)度的小核酸以及在體內(nèi)能轉(zhuǎn)錄生成此類(lèi)小核酸的小核酸表達(dá)載體，也具 有一定的將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞的功能。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明所述的核苷酸序列中的任意一個(gè) 核苷酸可以是自然無(wú)修飾的，也可以是經(jīng)不同化學(xué)方法修飾的，包括肽核 苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修飾的核苷酸。
另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解，本發(fā)明所述的核苷酸其還可以 包括由上述發(fā)夾核酸衍生出來(lái)的單鏈核酸，如 5'-GAUCCCGUGUAACACAAUGGUGAGUAUUUG-3，等，或雙鏈核酸
5'隱GUAACACAAUGGUGAGUAUUUG-3'
I I I 1 I I I I I I I I I M I I I I I I I
3'-CAUUGUGUUACCACUCAUAAAC-5'等。
第二方面，本發(fā)明提供了能將間充質(zhì)干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的作用
耙點(diǎn)EIDl(ElA-樣分化抑制因子1) (GeneBank基因登記號(hào)為 NM一014335.2)。在EID1的3'不翻譯區(qū)存在著5個(gè)與本發(fā)明第一方面所述 的小RNA相互作用的作用位點(diǎn)(圖1C)。抑制EID1的表達(dá)能夠誘導(dǎo)非造 血干細(xì)胞，如骨髓千細(xì)胞向造血千細(xì)胞的定向分化。
第三方面，根據(jù)上述方面，本發(fā)明進(jìn)一步研究表明耙向EID1的一些 siRNA分子也具有內(nèi)源性小RNA的作用，它們能有效地抑制耙EID1的表 達(dá)，從而像內(nèi)源性的shR-337 —樣能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向造血干細(xì) 胞的定向分化。本發(fā)明將這種靶向EID1的siRNA分子命名為siR-EIDl， 其包括，但不限于，下表1中所列出的SEQ. ID. No. 2-23對(duì)應(yīng)的siRNAs, 以及它們的衍生物。
第四方面，本發(fā)明提供了一種將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞的方 法，其包括將本發(fā)明所述的小RNA或其衍生物轉(zhuǎn)染到間充質(zhì)干細(xì)胞中， 通過(guò)抑制作用靶點(diǎn)EID1的表達(dá)而將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞。
第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的小RNA或其衍生物的用途， 其可以用于制備將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞的藥物，用于治療人的 血液疾病。另外，本發(fā)明所述的小RNA或其衍生物還可以用于制備包含 其的試劑盒。
第六方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述的小RNA或其衍生物的試 劑盒。
以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但實(shí)施例并不限制本發(fā) 明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和所公開(kāi)的 技術(shù)方案，進(jìn)行不背離本發(fā)明的精神和范圍的修改和變動(dòng)，這也在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。


圖1. 一種具有能夠?qū)⒎窃煅杉?xì)胞分化為造血干細(xì)胞的小發(fā)夾RNA shR-337。 (A) shR-337在不同干細(xì)胞中的表達(dá)水平;(B) shR-337的代表 性結(jié)構(gòu)，禾Q (C) shR-337抑制EIDl基因表達(dá)的作用靶點(diǎn)。
圖2.過(guò)表達(dá)shR-337小RNA能有效地在轉(zhuǎn)譯水平抑制靶EID1的生 物合成。(A)無(wú)功能小RNA和shR-337有功能小RNA表達(dá)載體的構(gòu)建。
(B)新鑒定的shR-337小RNA在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平。(C)實(shí)時(shí)定量 PCR對(duì)不同條件下的EID1基因表達(dá)量的分析，揭示shR-337小RNA對(duì) EIDlmRNA的表達(dá)沒(méi)有影響，而相應(yīng)的siRNA卻能明顯的下調(diào) EIDlmRNA的表達(dá)。(D)蛋白質(zhì)印跡分析顯示shR-337小RNA明顯地誘 導(dǎo)EID1蛋白質(zhì)水平的下降，揭示shR-337小RNA能在轉(zhuǎn)譯水平抑制EID1 的合成，其中相同的蛋白質(zhì)上樣量通過(guò)使免疫印記分析獲得的相同的肌動(dòng) 蛋白的量來(lái)保證。
圖3.在人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)shR-337能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和 分化。(A)在倒置顯微鏡下(型號(hào)EHSYLAB，日本OLYMPUS)觀察到 的人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染有假的小RNA (Mock)的人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 以及轉(zhuǎn)染有shR-337的人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。(B)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后在 生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，再在轉(zhuǎn)移到細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后 進(jìn)行造血千細(xì)胞專(zhuān)一的CD45的免疫組化染色。(C) CD45陽(yáng)性的造血干細(xì) 胞的細(xì)胞集落形成能力分析。人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染shR337和假的小 RNA載體后14天形成的細(xì)胞集落數(shù)。11>6/組，p<0.001。。
圖4.體內(nèi)強(qiáng)制表達(dá)shR-337對(duì)造血干細(xì)胞系分化的影響。(A)細(xì)胞移 植后60天小鼠骨髓部位的免疫熒光和Hochest33342(Sigma-Aldrich, cat. no. H-3201 )染色。圖中展示了種植了對(duì)照，轉(zhuǎn)染了假小RNA(Mock)和shR-337 60天后的小鼠骨髓中具冇人CD45, CD13或CD33專(zhuān)一性抗原的細(xì)胞。(B) 在NOD-SCID鼠體內(nèi)由人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行的造血干細(xì)胞重建。將105 GFP+CD45+BMSCs移植到經(jīng)臨界致死劑量的輻射處理過(guò)的NOD-SCID小 鼠。移植8周后，小鼠骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞圖表明具有多種細(xì)胞系(淋巴 細(xì)胞和骨髓細(xì)胞)的重建。(C) shR-337誘導(dǎo)造血干細(xì)胞系分化的工作機(jī)制 圖。(D) RUNX1在不同情況中的表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式
以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述。但是，本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實(shí)施例僅是用于舉例說(shuō)明的目的，并不限制本 發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的精神和范圍由后附的權(quán)利要求所限定。本領(lǐng)域 有關(guān)的技術(shù)人員完全可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和所公開(kāi)的技術(shù)方案，進(jìn)行不
背離本發(fā)明的精神和范圍的修改和變動(dòng)，這也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 實(shí)施例1.細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)
骨髓樣本來(lái)源于30位健康的志愿者(年齡為20-50歲)，骨髓的獲取 遵循北京協(xié)和醫(yī)院管理委員會(huì)的利用人體材料進(jìn)行科學(xué)研究的指導(dǎo)原則， 在捐獻(xiàn)者同意的前提下進(jìn)行的。從骨髓中分離具有表型為 Flkl+CD3rCD34—的干細(xì)胞的基本步驟為通過(guò)蔗糖梯度密度離心(離心 力為1.077g/ml)獲得單核細(xì)胞。利用結(jié)合有CD5,GlyA和CD34的磁珠將 獲得的單核細(xì)胞中的造血干細(xì)胞剔除。為了獲得單細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞克隆， 每一位病人的骨髓細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法依次稀釋到9600個(gè)孔的鋪有纖連 蛋白(fibronectin，目錄號(hào)W1509，購(gòu)自Genitix，英國(guó))和膠原蛋白(collagen, 目錄號(hào)W1557,購(gòu)自Genitix，英國(guó))的培養(yǎng)板上，使細(xì)胞數(shù)為1個(gè)/孔。 細(xì)胞培養(yǎng)基為Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和含40%MCDB-201 (目錄號(hào) M6770， Sigma-Aldrich)及微量元素的Ham F12完全培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基 補(bǔ)充了 2%的胎牛血清(目錄號(hào)12319018， GIBCO)， 1 ng的轉(zhuǎn)硒胰島素 (insulin transferring selenium)(目錄號(hào)17-838Z ITS,畢龍-畢特博生物技 術(shù)有限公司，西安)，IO'9 M地塞米松(dexamethasone)(目錄號(hào)D-2915, Sigma), l(T4 M2-磷酸-抗壞血酸(目錄號(hào)A-8960, Sigma), 20 ng/ml白介 素-6 (R&D systems, R錄號(hào)406-ML) , 10 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(目錄號(hào) E-9644, Sigma), 10 ng/ml血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子BB (Sigma-Aldrich,目 錄號(hào)P-3201)， 50ng/ml胎牛肝酪氨酸激酶3 (Flt-3)的配體(Sigma目錄 號(hào)P2850)， 30 ng/ml的骨的形態(tài)蛋白-4 (目錄號(hào)P2714, Sigma Chemical, St Louis, MO)以及100單位/ml的青霉素(目錄號(hào)15140 - 122， Gibco Invitrogen)禾P 100 ng/ml的鏈霉素(目錄號(hào)15140 - 122, Gibco Invitrogen)。 將細(xì)胞在37°C， 5%二氧化碳的濕潤(rùn)空氣中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每4-6天更換一 次。組織培養(yǎng)時(shí)，對(duì)培養(yǎng)槽中的單個(gè)貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)的第一天進(jìn)行鑒定。 每天檢查單細(xì)胞集落的形成。單細(xì)胞集落通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)法收集并進(jìn)行擴(kuò)增培 養(yǎng)。CD133+的造血干細(xì)胞從血庫(kù)中的血液經(jīng)過(guò)偶聯(lián)有CD133+免疫抗體的 磁珠進(jìn)行分離。
實(shí)施例2.短發(fā)夾小核酸pre-shR337的表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
我們使用生物信息學(xué)從人體蛋白質(zhì)編碼基因SK5/IYD2^的第一個(gè)內(nèi) 含子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)短發(fā)夾小RNA基因，命名為shr-337。為證實(shí)此小RNA 基因能產(chǎn)生相應(yīng)的功能性小RNA,我們用克隆測(cè)序技術(shù)在造血干細(xì)胞中 檢測(cè)到它的表達(dá)(圖1A)。為了構(gòu)建能表達(dá)這個(gè)小RNA的病毒載體，用 化學(xué)合成的方法合成了與pre-shR337的序列相對(duì)應(yīng)的短的發(fā)夾DNA序歹U: 5 ， -G ATCCCGTGTA AC AC A ATGGTG AGTATTTGactagaatataC AAATACTC ACCATTGTGTTAC ATTTTTTGGAAA-3'和5 ，-AGCTTTTCCAAAAAATG TAACACAATGGTGAGTATTTGtatattctagtCAAATACTCACCATTGTGTTA CACGG-3，，將合成的兩條DNA退火形成雙鏈DNA，利用標(biāo)準(zhǔn)的分子克 隆方法將上述DNA克隆到逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體pMSCV (目錄號(hào)35140, Invitrogen)中。構(gòu)建的小核酸表達(dá)質(zhì)粒利用U6啟動(dòng)子表達(dá)目的小核酸 pre-shR337。將該質(zhì)粒通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到人腎上皮細(xì)胞H293T (來(lái) 源醫(yī)科院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心)中(4， 8， 9， 11)。對(duì)照質(zhì)粒mock-GFP用 同樣的方法轉(zhuǎn)染。含mock-GFP和shR337-GFP的轉(zhuǎn)染H293T細(xì)胞中的逆 轉(zhuǎn)錄病毒分別為3xl06/ml和4xl06/ml。
實(shí)施例3.過(guò)表達(dá)shR-337能夠誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞
圖2B給出了將含shR-337的病毒載體轉(zhuǎn)染到實(shí)施例1中培養(yǎng)的人骨 髓間質(zhì)干細(xì)胞后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的定量RT-PCR檢測(cè)的shR-337在細(xì)胞中的表 達(dá)水平。與對(duì)照以及假的小RNA轉(zhuǎn)染的情況相比較，轉(zhuǎn)染shR-337病毒 表達(dá)載體(表達(dá)載體圖譜示意圖見(jiàn)圖2A)后，細(xì)胞內(nèi)的shR-337的表達(dá) 水平顯著增高(圖2B)。而且轉(zhuǎn)染shR337后能在細(xì)胞中長(zhǎng)期維持。高效 表達(dá)shR-337后2天用RT-PCR反應(yīng)可以檢測(cè)到shR337的耙基因EID1在 其轉(zhuǎn)錄水平上有微小的變化(圖2C)，但是用免疫印記分析發(fā)現(xiàn)EID1的 蛋白表達(dá)水平發(fā)生了顯著的降低(圖2D)。這一點(diǎn)和造血干細(xì)胞中內(nèi)源性 的EID1下調(diào)相一致，同時(shí)伴隨著CD45標(biāo)志分子的表達(dá)(圖3A和3B)。 為了明確證實(shí)單細(xì)胞通過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)能生成分化了的后代，將轉(zhuǎn)染過(guò)的 干細(xì)胞分離出來(lái)再接種到涂有纖連蛋白和膠原蛋白的24孔培養(yǎng)板中，并 向培養(yǎng)基中加入造血干細(xì)胞細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的混合物。轉(zhuǎn)染的人骨髓 間質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染載體中所含的綠色熒光蛋白來(lái)鑒定，而骨髓間質(zhì)
干細(xì)胞分化成為造血干細(xì)胞通過(guò)鑒定專(zhuān)一性的CD45表面抗原(圖3A)
來(lái)鑒定。
從每一組的骨髓中選取2000個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行14天的組織培養(yǎng)。體外 細(xì)胞群落形成能力分析表明(1,2,3,5)，在這14天的培養(yǎng)過(guò)程中，過(guò)表達(dá) shR-337有利于生長(zhǎng)并形成祖細(xì)胞。這種變化是因?yàn)檗D(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇性擴(kuò) 增。只有在含shR-337的細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增的細(xì)胞主要才主要是含綠色熒 光蛋白的細(xì)胞并具有CD45陽(yáng)性的特征，如圖3B所示。雖然在骨髓間質(zhì) 干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染有假的小RNA載體的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和轉(zhuǎn)化有shR-337的 骨髓干細(xì)胞的三種情況F起始接種的細(xì)胞數(shù)均為5000個(gè)/孔，但是，只有 含有shR337的轉(zhuǎn)染細(xì)胞才能快速增殖(圖3C)。定量分析表明在感染有 假小RNA載體的骨髓干細(xì)胞中只有0.02%的細(xì)胞經(jīng)過(guò)14天的培養(yǎng)能夠形 成CD45陽(yáng)性的群落，而在感染有shR337的骨髓間質(zhì)細(xì)胞中經(jīng)過(guò)14天的 培養(yǎng)有0.5%的細(xì)胞能夠形成CD45陽(yáng)性的細(xì)胞群落。這一結(jié)果表明強(qiáng)制性 升高shR337在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)量能夠?qū)⒐撬栝g質(zhì)干細(xì)胞專(zhuān)一性 的定向分化成造血干細(xì)胞。
實(shí)施例4.抑制shR-337的靶基因EIDl同樣能夠誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)千細(xì)胞向造 血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
本實(shí)施例通過(guò)化學(xué)合成法合成了高專(zhuān)一性地沉默EID1基因的一系列 干擾小RNAs分子siR-EIDl(序列見(jiàn)表1， SQE. ID. No.2-23)，但本領(lǐng)域的 技術(shù)人員應(yīng)該理解其不局限于這些siRNAs，還可以包括其它相應(yīng)的能使 靶EIDl基因下調(diào)的siRNAs分子，或它們的衍生物。在本實(shí)施例中，將其 中一個(gè)siR-EIDl,即SQE. ID. No.2，轉(zhuǎn)染到實(shí)施例1中培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞中，并用定量RT-PCR方法分析EID1基因的表達(dá)改變，與假的小 RNA對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染了 EIDl-siRNA的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中EID1的表達(dá) 量降低了40% (圖2C)，而經(jīng)過(guò)上述處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成 為造血干細(xì)胞，并伴隨著CD45專(zhuān)一性表面抗原的表達(dá)(圖3A)，而轉(zhuǎn)染假 小RNA卻沒(méi)有CD45表面抗原的專(zhuān)一性表達(dá)。從本實(shí)施例的研究結(jié)果我 們發(fā)現(xiàn)shR-337的作用靶點(diǎn)是EID1基因，敲除骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中的EID1
基因能夠?qū)е鹿撬栝g質(zhì)干細(xì)胞定向分化成為造血干細(xì)胞。
表l.耙向EIDlmRNA不同位點(diǎn)的siRNA分子(siR-EIDl)的序列。
SQE. ID, No.對(duì)應(yīng)的DNA序列(正義鏈)
2GGAGGACGACTACGACTATTT
GCATCTGTCTTGCTGGAAGCT
4GGTTGAGCGGTTTGCACAATG
GGTTTGCACAATGTCGGAAAT
6GGCGAGGAATTTGATGACTGG
7GCGAGGAATTTGATGACTGGG
8GCTCTTGAAGAAGCCGACAAG
9GACAAGATGTTTCTGAGAACA
10GGCGGGTTTCAGATGCATTAT
11GCGGGTTTCAGATGCATTATG
12GGTTTCAGATGCATTATGATT
13GGACCCAACTTTCCGCTATCT
14GCCACAGTTATCAAAGGCTAC
15GACACTAAATGTGTGTGAATG
16GCCCAGAAATTACCTTGGTAT
GCTTGTTATTTGTCATGCACC
18GCTTCAGCTATCTAATTCACA
19GCCCTATCAATGAGTATGTTG
20GCCGTGGTTACCTTACTAAGA
21GCTGAAGTTCTAGGAGAGTAA
22GCTCCATTATAGCAGTAAAGA
23GAACGAATATCCAATGCAACA
實(shí)施例5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明在人的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中高效表達(dá)shR-337后能 定向分化成造血干細(xì)胞
將轉(zhuǎn)染有shR-337以及假的shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒酶載體的骨髓間質(zhì)
干細(xì)胞分別移植到經(jīng)臨界致死劑量的放射處理的聯(lián)合免疫缺陷小鼠(小鼠
的品系為非肥胖糖尿病(nonobese diabetic) ( NOD)/LtSz-sd"W (SCID )，
來(lái)源上海腫瘤生物技術(shù)研究所，體重20g左右，年齡6-8周，雄性)
體內(nèi)。60天后能夠檢測(cè)到由表達(dá)GFP的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化成的造血細(xì) 胞。利用抗人源性細(xì)胞抗原的單克隆抗體對(duì)鼠的骨髓進(jìn)行免疫組化分析， 發(fā)現(xiàn)在經(jīng)臨界致死輻射劑量的放射處理的小鼠的骨髓中能夠檢測(cè)到造血 干細(xì)胞祖細(xì)胞基因標(biāo)志分子的表達(dá)，這些造血祖細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化成以 特征表達(dá)CD33分子標(biāo)志物的髓樣白細(xì)胞和以特征表達(dá)CD13分子標(biāo)志物 的淋巴細(xì)胞(圖4A)。相反，在對(duì)照組和移植有假siRNA的小鼠實(shí)驗(yàn)組的 骨髓部位，幾乎檢測(cè)不到人源細(xì)胞的CD45， CD33或CD13特征分子標(biāo)志 物陽(yáng)性的細(xì)胞。
我們還分別收集了實(shí)驗(yàn)鼠的各個(gè)器官，通過(guò)GFP發(fā)光法檢測(cè)各器官中 是否存在由人的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化后的細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果未觀察到人的骨 髓間質(zhì)干細(xì)胞的分化細(xì)胞。由此可見(jiàn)shR-337能夠?qū)Ｒ恍缘貙⑷说墓撬栝g 質(zhì)干細(xì)胞定向分化成造血干細(xì)胞。我們還采用了三種抗人源白細(xì)胞和干細(xì) 胞分子標(biāo)志物的單克隆抗體如抗CD13， CD33和CD45抗體對(duì)小鼠骨髓 中的間質(zhì)干細(xì)胞分化細(xì)胞進(jìn)行表型分析。8周后從小鼠的骨髓腔中獲取感 染了轉(zhuǎn)染有shR-337的人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的組分進(jìn)行細(xì)胞流式分析(圖 4B)。和體外研究的結(jié)果一致，在人的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)shR-337能 使CD13陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞從對(duì)照組的0.5%提高到實(shí)驗(yàn)組的2.8%。同樣， 對(duì)CD33陽(yáng)性的骨髓細(xì)胞也有顯著的提高。
上述實(shí)施例表明shR-337和其它EIDl相關(guān)的siRNAs，通過(guò)抑制EID-l 基因的表達(dá)，能夠在體內(nèi)和體外專(zhuān)一性地將非造血干細(xì)胞，如人骨髓間質(zhì) 千細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞。這一研究結(jié)果揭示這些小RNA分子也許可用 于大規(guī)模的間充質(zhì)干細(xì)胞向造血細(xì)胞的分化，以致代替造血干細(xì)胞用于人 體血液病的治療。
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<110〉中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所
<120> —類(lèi)能將間充質(zhì)干細(xì)胞分化為造血細(xì)胞的小RNA分子及其作用靶點(diǎn) <130〉 IB083046 <160> 23
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<2U〉 75
<212〉 RNA
<213〉 人.T.的
<400〉 1
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<210〉 2 <211〉 21 <212〉 DNA
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<400〉 23
g幼cgaatat ccaatgcaac 權(quán)利要求
1.一種將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞的小RNA或其衍生物，其包括具有SQE.ID.No.1的核心核苷酸序列的發(fā)夾核酸或其衍生物。
2. 權(quán)利要求1所述的小RNA或其衍生物，其還包括由所述發(fā)夾核酸 衍生 出 來(lái) 的 單鏈核 酸5'-GAUCCCGUGUAACACAAUGGUGAGUAUUUG匿3，等，或雙鏈核酸 5'-G U AACACAAUGG UGAGUAU U UG-3'11111111 m 11 m 1111113'-CAUUGUGUUACCACUCAUAAAC-5'等。
3. 權(quán)利要求1所述的小RNA或其衍生物，其還包括沉默EID1的小 干擾RNAsiR-EIDl，其包括SEQ. ID. No. 2-23對(duì)應(yīng)的siRNAs，以及它們 的衍生物。
4. 權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的小RNA或其衍生物，其作用靶點(diǎn)是 EID1基因。
5. 權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的小RNA或其衍生物，所述核苷酸序 列中的任意一個(gè)核苷酸是自然無(wú)修飾的，或是經(jīng)不同化學(xué)方法修飾的，包 括肽核苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修飾的核苷 酸。
6. 權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的小RNA或其衍生物，其還包括通過(guò) 能表達(dá)所述小RNA的各種病毒和質(zhì)?？寺≥d體將所述小RNA序列所對(duì)應(yīng) 的DNA序列所構(gòu)成的小RNA表達(dá)體系。
7. —種將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞的方法，其包括將權(quán)利要求 1到6任一項(xiàng)所述的小RNA或其衍生物轉(zhuǎn)染到間充質(zhì)干細(xì)胞中，通過(guò)抑 制作用靶點(diǎn)EID1的表達(dá)而將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)所述的小RNA或其衍生物的用途，其通過(guò) 抑制作用靶點(diǎn)EID1的表達(dá)而將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求8所述的用途，其用于制備將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干 細(xì)胞的藥物。
10. —種將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞的試劑盒，其包括權(quán)利要 求1到6任一項(xiàng)所述的小RNA或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠?qū)⑷说姆窃煅杉?xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，分化為造血干細(xì)胞(HSC)的一種小RNA(shR337)以及其衍生物，該小RNA的發(fā)現(xiàn)還提供了能夠?qū)⒎窃煅杉?xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分化成造血細(xì)胞的作用靶點(diǎn)。將該小RNA轉(zhuǎn)染到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中后可以抑制EID1基因的蛋白質(zhì)翻譯，使人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有CD45⁺表面抗原陽(yáng)性的造血干細(xì)胞，并能進(jìn)一步分化為髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。小鼠活體實(shí)驗(yàn)表明該類(lèi)小RNA對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化是定向、專(zhuān)一的。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101368180SQ20081022411
公開(kāi)日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者張洪杰, 殷勤偉, 谷同軍, 趙春華, 邊春景 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所