一種牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化領(lǐng)域，尤其涉及一種牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液及 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙周膜是牙根與牙槽骨之間的一層結(jié)締組織，是重要的牙周支持組織，主要由成 纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和一些未分化的間充質(zhì)細(xì)胞組成。正常情況下，牙周組織具有自身 的更新和修復(fù)能力，其修復(fù)活動(dòng)是通過牙周膜細(xì)胞自我更新實(shí)現(xiàn)的。在疾病或在受到外界 刺激時(shí)，通過牙周膜中細(xì)胞的不斷增殖和分化使組織再生。2004年Seo等從拔除的第三磨牙 牙周膜組織中分離得到牙周膜干細(xì)胞(PeriodontalLigamentSemCellsJDLSCs)。此外， 在拔牙后牙槽窩的內(nèi)表面也有PDLSCs存在。近來，有人從成人牙周組織中得到了高度純化 的TOLSCs克隆。
[0003] PDLSCs具有潛在多向分化的干細(xì)胞特性，它不僅可以分化為牙體牙周組織細(xì)胞， 還可以橫向分化為其他譜系的細(xì)胞。生理狀態(tài)下牙周膜中并沒有脂肪組織，但是已有報(bào)道 顯示在地塞米松和胰島素、異丁基甲基黃嘌呤等誘導(dǎo)下干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞 作為美容修復(fù)軟組織缺損具有可塑性強(qiáng)、可適應(yīng)不同缺損形狀的優(yōu)勢。目前已有國外學(xué)者 研究證明TOLSCs可以通過cAMP調(diào)節(jié)成功分化為脂肪細(xì)胞。賀慧霞等通過STR0-1免疫磁珠分 選系統(tǒng)篩選roLSCs，取磁珠分離的第2代TOLSCs，培養(yǎng)3天待細(xì)胞長到90 %匯合度后，換成脂 誘導(dǎo)液A(基礎(chǔ)培養(yǎng)基A、100mmol·L-1吲哚美辛、250mmol·L-hBMXdmmg·L-1胰島素、 lmmol·L-1地塞米松、20%FBS)誘導(dǎo)3天，然后換成脂誘導(dǎo)維持液B(基礎(chǔ)培養(yǎng)基B、5mmg·L-1 胰島素)誘導(dǎo)1天，按照3:1方案連續(xù)誘導(dǎo)21天，實(shí)驗(yàn)中96.54%的TOLSCs可分化誘導(dǎo)成脂肪 細(xì)胞，證明了PDLSCs高效的成脂誘導(dǎo)潛能，其可望成為美容修復(fù)軟組織缺損的干細(xì)胞來源 (賀慧霞，劉洪臣，王東勝，等.牙周膜干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞方向定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)[J]，華西口 腔醫(yī)學(xué)雜志，2010,28(2): 203-207)。
[0004] 但現(xiàn)有技術(shù)中牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)的誘導(dǎo)液和方法還有待進(jìn)一步改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液及方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液，包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (IBMX)、胰島素、B引噪美辛、地塞米松、富血小板血漿(PRP)和胎牛血清(FBS)。
[0008] 優(yōu)選地，所述牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液中PRP的含量為1-lOv/v%。
[0009] 優(yōu)選地，所述牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液中PRP的含量為5v/v%。
[0010] 優(yōu)選地，所述牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液，由下述含量的下述組分組成： 0 ·ImmoL/LIBMX、10mg/L胰島素、0 ·ImmoL/L吲哚美辛、lymoL/L地塞米松、5v/v%PRP、10v/ v%FBS，余量為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0011 ] 本發(fā)明使用的富血小板血衆(zhòng)(Platelet-richplasma，PRP)是通過二次離心法得 到的血小板濃縮物，來自自體血液，獲取容易，對人體損傷小，不存在免疫排斥反應(yīng)，富含多 種生長因子如血小板衍生因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、血管內(nèi)皮生長因子等，不同濃度的PRP具有 促進(jìn)干細(xì)胞的增殖、成骨和成脂分化等作用，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景。
[00?2 ] 優(yōu)選地，所述PRP通過以下方法制備：1 〇mL自體外周血于400g條件下離心1Omin，離 心結(jié)束后血樣自上而下依次分為上清層、白色細(xì)胞層和紅色細(xì)胞層，取紅色細(xì)胞層上部1-2mm以及全部的上清層和白色細(xì)胞層，在400g條件下離心5min，離心結(jié)束后血樣自上而下依 次分為上清層、白色細(xì)胞層和紅色細(xì)胞層，取上清層和白色細(xì)胞層在1200g條件下離心 5min，離心結(jié)束后保留最下面2.5mL即為PRP。
[0013]更優(yōu)選地，PRP在使用前需要進(jìn)行活化，所述活化方法為:將PRP移入含氯化鈣的促 凝管，4°C過夜后在800g條件下離心12min，取全部上清0.22μπι過濾，即得活化后的PRP。
[0014]-種牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)方法，使用上述成脂分化誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0015]優(yōu)選地，所述牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)方法，包括以下步驟:牙周膜組織消化后 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分選出STR0-1+PDLSCs進(jìn)行培養(yǎng)，使用上述成脂分化誘導(dǎo)液對第2-5代 TOLSCs進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0016] 優(yōu)選地，使用磁珠分選法分選出STRO-ΓPDLSCs。
[0017] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，磁珠分選法為:將收集消化后培養(yǎng)的細(xì)胞與STR0-1單抗4°C孵育 lh，與磁珠在4°C孵育30min，在磁力設(shè)備作用下篩選出STRO-ΓPDLSCs。
[0018]優(yōu)選地，所述牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)方法，包括以下步驟：
[0019] l)PDLSCs原代分離及傳代：
[0020] 刮取牙齒根中下1/3段的牙周膜組織，剪成約為1mm3大??；加入適量膠原酶_ Dispase酶1:1混合消化液，37°C消化3〇-35min后，lOOOrpm離心5min，棄上清，加入適量PBS 重懸，lOOOrpm離心5min，棄上清，加入含體積分?jǐn)?shù)10 %FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào) 整細(xì)胞密度至1Xl〇4cel1s/mL，2mL每孔接種于六孔板，于5 %C02、37°C條件下培養(yǎng)；
[0021] 待細(xì)胞長至匯合度80-90%，收集細(xì)胞，用磁珠分選法分選出STRO-ΓPDLSCs，用 含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至lX104cells/mL，2mL每 孔接種于六孔板中，于5%C02、37°C條件下培養(yǎng)；
[0022] 待細(xì)胞長至匯合度80-90%，棄培養(yǎng)液，加入適量0.25m/v%胰蛋白酶溶液，消化1-3min，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入適量含體積分?jǐn)?shù)10 %FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止 消化，收集細(xì)胞，l〇〇〇rpm離心5min，棄上清；用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5X104cells/mL，接種于培養(yǎng)皿中于5 %C02、37°C條件下進(jìn)行傳代培 養(yǎng)，每隔2-3天換液一次；
[0023] 2)PDLSCs成脂分化：
[0024]取第3代TOLSCs，按1X104cellS/mL密度接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至匯合度達(dá)到 70-80%以上時(shí)，更換為上述成脂分化誘導(dǎo)液，每隔3天換液，連續(xù)誘導(dǎo)21天。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0026] 1)本發(fā)明牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液及方法，在常規(guī)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液基礎(chǔ)上添加 人外周血提取的PRP，有效提高了PDLSCs的脂肪化效率，能夠成功實(shí)現(xiàn)對PDLSCs的成脂誘 導(dǎo)，證明了TOLSCs高效的成脂誘導(dǎo)潛能，為美容修復(fù)軟組織缺損應(yīng)用種子細(xì)胞提供多一種 選擇。
[0027] 2)本發(fā)明采用的原材料是12-18歲青少年在進(jìn)行牙齒正畸治療時(shí)需要拔除的第三 磨牙，目前基本作為醫(yī)療廢棄物而扔掉；而本發(fā)明用于分離培養(yǎng)PDLSCs，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)方 法，有效實(shí)現(xiàn)了醫(yī)療廢棄物的再利用。
【附圖說明】
[0028] 圖1為PDLSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的流式檢測圖。圖A-圖F分別為⑶146、⑶105、 CD73、HLA-DR、CD34和CD45的流式檢測圖。
[0029]圖2為細(xì)胞形態(tài)圖。其中，圖2A、圖2B和圖2C分別為P0代、P1代和P3代100倍放大圖。 [0030]圖3為陰性對照組油紅0染色的結(jié)果圖。其中圖3A和圖3B分別為200倍和400倍放大 圖。
[0031]圖4為陽性對照組油紅0染色的結(jié)果圖。其中圖4A和圖4B分別為200倍和400倍放大 圖。
[0032]圖5為實(shí)驗(yàn)組1油紅0染色的結(jié)果圖。其中圖5A和圖5B分別為200倍和400倍放大圖。 [0033]圖6為實(shí)驗(yàn)組2油紅0染色的結(jié)果圖。其中圖6A和圖6B分別為200倍和400倍放大圖。 [0034]圖7為實(shí)驗(yàn)組3油紅0染色的結(jié)果圖。其中圖7A和圖7B分別為200倍和400倍放大圖。 [0035]圖8為效果實(shí)施例1中的誘導(dǎo)分化率結(jié)果圖。
[0036] 圖9為效果實(shí)施例2中PPARγ-2的表達(dá)檢測結(jié)果圖。
[0037] 圖10為效果實(shí)施例2中LPL的表達(dá)檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例做進(jìn)一步說明。本發(fā)明中使 用的檢測方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。
[0039] 本發(fā)明使用的部分試劑或儀器來源如表1所示，未標(biāo)明來源的試劑或儀器均為本 領(lǐng)域常規(guī)試劑或儀器，可以自市面購買得到。
[0040] 表1、本發(fā)明使用的部分試劑和儀器來源
[0041]
[0042] 實(shí)施例1
[0043] -種牙周膜干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)液，包含下述含量的下述組分:0.1mm〇L/L IBMX、 10mg/L胰島素、0 · ImmoL/L吲噪美辛、lymoL/L地塞米松、lv/v%PRP、10v/v%FBS，余量為 DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0044] 本實(shí)施例中PRP通過以下方法制備:將與牙齒同一供者的外周血于超凈臺內(nèi)把血 樣轉(zhuǎn)入15mL離心管，10mL每管，400g，離心lOmin。離心結(jié)束后血樣自上而下分為三層:淡黃 色上清層、白色細(xì)胞層和紅色細(xì)胞層。吸取全部上清層、白色細(xì)胞層及紅色細(xì)胞層上部1-2mm，移入新15mL離心管，400g離心5min。離心結(jié)束后吸取上清層和白色細(xì)胞層，移入新15mL 離心管，1200g離心5min。離心結(jié)束后棄上清，保留最下面的2.5mL，即富血小板血漿。移入含 氯化鈣的促凝管，4°C過夜后800g離心12min，吸取出促凝管內(nèi)的全部上清，0.22μπι過濾，濾 液-20°C保存待用。當(dāng)PRP與氯化鈣和凝血酶混合后，生長因子即從血小板中的α顆粒釋放出 來，再經(jīng)離心過濾就可以得到活化的PRP。
[0045]使用上述成脂分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞成脂分化的方法，包括以下步驟：
[0046] l)roLSCs原代分離及傳代
[0047]取材:將12-18歲健康供者的因正畸需要拔除的第三磨牙，快速浸入含3倍雙抗的4 °C預(yù)冷的PBS中備用。用含3倍雙抗的PBS從牙根到牙冠的方向沖洗牙體，徹底清除血污，重 復(fù)3次。用手術(shù)刀片冠根單向刮取根中下1/3段的牙周膜組織，移入離心管，并用眼科剪將組 織塊剪成約為1_ 3大小。
[0048]消化：向組織碎塊中加入適量混合消化液，置37°C恒溫?fù)u床中消化30-35min，消化 結(jié)束后，lOOOrpm離心5min，棄上清，加入適量PBS重懸，lOOOrpm離心5min，棄上清;加入培養(yǎng) 基(含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞，使其密度為1X104cells/mL，接種于 六孔板，每孔2mL，5 %⑶2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)。所述混合消化液由3g/L膠原酶溶液和4g/L Dispase酶溶液按體積比1:1的比例混合而成。
[0049]純化：待細(xì)胞長至匯合度80-90 %，收集細(xì)胞，用磁珠分選法純化細(xì)胞；具體方法 為:將收集的細(xì)胞與STR0-1單抗4°C孵育lh，與磁珠在4°C孵育30min，在磁力設(shè)備作用下篩 選出STRO-ΓPDLSCs，加入培養(yǎng)基(