一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，具體為其作為負(fù)載hBMP-2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的載體的應(yīng)用；本發(fā)明的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的制備過程簡單，實(shí)驗(yàn)條件溫和，易操作，本發(fā)明的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物載體是一種良好的基因載體，能成功負(fù)載hBMP-2pDNA，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，在骨組織修復(fù)和重建等方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子納米載體靶向基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，特別涉及一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物作為負(fù)載hBMP-2pDNA (人骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)粒DNA)誘導(dǎo)hMSCs(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)分化成成骨細(xì)胞的載體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療作為一種現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合而誕生的新技術(shù)，是將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償基因缺失或異常引起的疾病，從而達(dá)到疾病治療的新手。早在1968年，美國科學(xué)家邁克爾?布萊澤，首次在醫(yī)學(xué)界提出了基因治療的概念。但直到1990年，人類才首次進(jìn)行了相關(guān)的臨床試驗(yàn)。近十幾年，很多臨床試驗(yàn)都將基因治療作為一種新穎的藥用策略，應(yīng)用于癌癥、遺傳性疾病、心血管疾病、免疫缺陷病和許多其它的障礙性疾病相關(guān)的基因缺陷或丟失。
[0003]然而，目前基因治療最主要的障礙就是缺乏一種安全有效的傳遞表達(dá)載體，將遺傳物質(zhì)傳遞到生物體內(nèi)所需的位置。在基因載體系統(tǒng)中，主要借助病毒和非病毒載體將外源基因?qū)氚屑?xì)胞。病毒載體由于其高效的轉(zhuǎn)染效率而被應(yīng)用于臨床上的基因治療。但在將病毒載體作為基因運(yùn)載工具應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)中的時(shí)候，卻發(fā)現(xiàn)了很多安全隱患，比如基因突變、免疫原性，這些都進(jìn)一步制約了其作為載體的廣泛應(yīng)用。而非病毒載體，由于其低細(xì)胞毒性、無免疫原性、易操作和高基因裝載量等特點(diǎn)，越來越受到研究者們的關(guān)注。非病毒載體主要包括:陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物、殼聚糖載體聚合物和無機(jī)納米粒子載體等。其中，陽離子聚合物中的樹狀大分子作為一種新型的，具有獨(dú)特高度支化三維立體結(jié)構(gòu)的高分子被廣泛的應(yīng)用于基因傳遞中。
[0004]樹狀大分子的轉(zhuǎn)染能力依賴于其代數(shù)和表面的氨基數(shù)目，不同代數(shù)的樹狀大分子具有不同的表面氨基數(shù)目，因此選擇合適代數(shù)的樹狀大分子顯得至關(guān)重要。第五代聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子，表面擁有的豐富氨基基團(tuán)可進(jìn)行多功能化修飾，結(jié)構(gòu)內(nèi)部的空腔可包裹藥物分子或其它小納米顆粒，單分散性的結(jié)構(gòu)使其容易進(jìn)入細(xì)胞，這些優(yōu)異的特性促使我們利用第五代PAMAM樹狀大分子作為模板，在其表面修飾RGD和PEG，同時(shí)包裹金納米顆粒，有望制備得到具有高效基因傳遞性能的功能化的樹狀大分子及其納米顆粒，為新型的基因治療體系的開發(fā)及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供新的思路和參考價(jià)值。
[0005]檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明:以功能化的樹狀大分子及其納米顆粒為載體，用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的方法，尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種功能`化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物作為負(fù)載hBMP-2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的載體的應(yīng)用，該方法制備過程簡單，實(shí)驗(yàn)條件溫和，易操作，具有良好的基因轉(zhuǎn)染表達(dá)結(jié)果，骨組織工程的修復(fù)和重建中有良好的應(yīng)用前景。[0007]本發(fā)明的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物作為負(fù)載hBMP_2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的載體的應(yīng)用；
[0008]所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物具體為:{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10};其制備方法如下:
[0009](I)將 NH2-PEg-COOH 溶液與 6-MAL 溶液攪拌反應(yīng) 6_8h，得到 MAL-PEG-C00H 溶液，然后加入RGD-SH溶液，攪拌反應(yīng)10-12h，得到RGD-PEG-C00H溶液，隨后經(jīng)EDC和NHS溶液活化，再加入第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應(yīng)12-30h，得到G5.NH2-(PEG-RGD) 10溶液，然后將經(jīng)EDC.HCl和NHS活化的mPEG_C00H溶液加入到上述G5.NH2- (PEG-RGD) 10溶液中，反應(yīng) 12-30h，得到 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 溶液；
[0010](2)在上述 G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10 中，加入 HAuCl4 溶液，攪拌反應(yīng) 20_30min，再加入 NaBH4 溶液，攪拌 2-4h，得到{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}溶液；
[0011](3)步驟(2)所得的溶液進(jìn)行透析、冷凍干燥處理，得到干燥的{(Au°)25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}。
[0012]所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物與hBMP_2pDNA的N/P比為1:1~5:1，所述的N/P比為樹狀大分子的伯氨基與PDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比。
[0013]所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物與hBMP_2pDNA的N/P比為1:1,2.5:1 或者 5:1。
[0014]所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物與hBMP_2pDNA復(fù)合的方法為:將{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}用無菌水稀釋，然后無菌水稀釋質(zhì)粒，再將二者混合均勻后于37°C孵育30min，即`可。
[0015]所述步驟(1)中NH2-PEg-COOH 溶液、6-MAL 溶液、RGD-SH 溶液、mPEG_C00H 溶液的濃度均為5.8mmol/mL ;第五代聚酰胺_胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL ;溶劑均為 DMSO。
[0016]所述步驟(2)中HAuCl4溶液的濃度為30mg/mL，NaBH4溶液的濃度為10mg/mL。
[0017]所述步驟(3)中透析為用去離子水透析2-3d，每天3次，每次2L去離子水，其中透析袋截留分子量為14000。
[0018]功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物的制備方法，包括:
[0019](I)在第五代聚酰胺-胺樹狀大分子的DMSO (二甲基亞砜)溶液中，分別加入經(jīng)EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)活化的mPEG-COOH (端基分別為羧基和甲氧基的聚乙二醇)溶液，攪拌反應(yīng)12_30h，得到G5.NH2-mPEG20溶液；其中EDC與NHS的摩爾比為1:1，EDC和NHS與mPEG-COOH的摩爾比為
1.8:1, mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1。
[0020](2)在上述G5.NH2-mPEG20溶液中加入HAuCl4.4H20 (氯金酸)溶液，攪拌反應(yīng)20-30min，再加入NaBH4 (硼氫化鈉)溶液，攪拌2_4h，得到{(Au°)25_G5.NH2IiPEG2J溶液；其中HAuCl4.4H20與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH4與HAuCl4.4H20的摩爾比為5:1。
[0021](3)將NH2-PEg-COOH (端基分別為氨基和羧基的聚乙二醇)溶液與6-MAL (6_(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯)溶液攪拌反應(yīng)6-8h，得到MAL-PEG-C00H溶液，然后加入RGD-SH (巰基端環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽)(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)溶液，攪拌反應(yīng)10-12h，得到RGD-PEG-C00H溶液，隨后經(jīng)EDC和NHS溶液活化，再加入第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應(yīng)12-30h，得到G5.NH2- (PEG-RGD) 10溶液，然后按步驟(1)中的過程，得到活化的mPEG-COOH，加入到G5.NH2- (PEG-RGD) 10中，反應(yīng)12_30h，得至Ij G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 溶液；其中 NH2-PEG-C00H、6_MAL、RGD-SH 的摩爾比為 1:1:1，EDC與NHS的摩爾比為1:1，EDC與NHS之和與mPEG-COOH的摩爾比為1.8:1，EDC與NHS之和與RGD-PEG-C00H的摩爾比為1.8:1，mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1。
[0022] (4)在上述G5.NH2-(PEG-RGD) 1Q-mPEG1Q 中，按照步驟(2)的過程，得到{(Au°)25_G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}溶液；其中HAuCl4.4H20與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH4與HAuCl4.4H20的摩爾比為5:1。
[0023](5)將步驟(1) (2) (3) (4)所得的溶液進(jìn)行透析、冷凍干燥處理，得到干燥的 G5.NH2-mPEG20, {(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20}，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10};分另Ij 將 G5.NH2, G5.NH2_mPEG20，{(Au0) 25_G5.NH2_mPEG20}，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}給它們命名為 K0，Kl，K2，Κ3, Κ4。
[0024](6)按照不同的Ν/Ρ比(樹狀大分子的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比)，取Kl，K2，K3，K4用無菌水稀釋，并用無菌水稀釋質(zhì)粒，然后混合均勻，37°C孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/hBMP-2pDNA。
[0025]所述步驟(1)中mPEG-COOH溶液的濃度為11.6mmol/mL ；EDC和NHS溶液的濃度為20.88mmol/mL ;第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL ;溶液溶劑均為二甲基亞砜DMSO。
[0026]所述步驟(2)中HAuCl4水溶液濃度為30mg/mL，NaBH4溶液的濃度為10mg/mL。
[0027]所述步驟(3)中 NH2-PEg-COOH 溶液、6-MAL 溶液、RGD-SH 溶液、mPEG-COOH 溶液的濃度均為5.8mmol/mL ；EDC和NHS溶液的濃度均為10.44mmol/mL ;第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL ;溶劑均為DMS0。
[0028]所述步驟(4)中HAuCl4.4H20溶液的濃度為30mg/mL ；NaBH4溶液的濃度為IOmg/HlL ;溶劑均為水。
[0029]所述步驟(5)中透析為透析袋截留分子量為14000 ;用去離子水透析2_3d，每天3次，每次2L去離子水。
[0030]所述步驟(6 )中的N/P比分別為1:1，2.5: 1，5:1。
[0031]本發(fā)明中將親水試劑PEG接枝到末端為氨基的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子表面，可以中和部分表面氨基以降低材料對(duì)細(xì)胞的毒性，從而提高材料的生物相容性。
[0032]本發(fā)明將靶向試劑RGD修飾到第五代聚酰胺-胺樹狀大分子表面，使材料能夠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面的α νβ 3整合素相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)材料對(duì)干細(xì)胞的特異性靶向效果。
[0033]本發(fā)明將HAuCl4.4Η20加入到聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中后，快速攪拌20-30min,能夠使HAuCl4.4Η20與樹狀大分子充分混合，進(jìn)入到樹狀大分子內(nèi)部空腔。再快速加入NaBH4還原得到金納米顆粒,避免了金納米顆粒的聚集。
[0034]本發(fā)明以功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物為載體，負(fù)載hBMP-2pDNA,以hMSCs作為靶細(xì)胞，經(jīng)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)其分化成成骨細(xì)胞。本發(fā)明通過水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢對(duì)載體/hBMP-2pDNA復(fù)合物的粒徑和電勢進(jìn)行了分析；通過MTT法測試材料對(duì)細(xì)胞的毒性；通過同時(shí)帶有熒光素酶報(bào)告基因(Luc)和加強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)的pDNA對(duì)載體的基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行測定；通過攜帶hBMP_2基因的pDNA對(duì)載體負(fù)載hBMP-2的基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行測定；通過定量的堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素沉積、鈣離子分泌和定性的馮庫薩染色對(duì)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力進(jìn)行分析。
[0035]水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、熒光素酶基因與綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、ALP活性、骨鈣素沉積、鈣離子分泌和定性的馮庫薩染色結(jié)果分別如下:
[0036](I)水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢測試結(jié)果:
[0037]水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢測試結(jié)果用于表征功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/hBMP-2pDNA進(jìn)細(xì)胞的能力，測試結(jié)果如說明書附圖1所示。結(jié)果表明，功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/hBMP-2pDNA的水動(dòng)力學(xué)粒徑在200nm左右，表面電勢在20mV左右，說明復(fù)合物的尺寸和電勢都在合適的轉(zhuǎn)染范圍內(nèi)。
[0038](2)細(xì)胞毒性試驗(yàn)測試結(jié)果:
[0039]細(xì)胞毒性試驗(yàn)用于表征功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物和功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/hBMP-2pDNA對(duì)細(xì)胞的毒性，參見說明書附圖2。MTT試驗(yàn)結(jié)果表面，隨著載體和復(fù)合物的濃度增加，材料對(duì)細(xì)胞的毒性也隨之增加。而在同樣的濃度下，復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性比單獨(dú)的載體對(duì)細(xì)胞的毒性有所降低，說明hBMP-2pDNA在與載體作用的時(shí)候，中和了載體表面部分的氨基，從而降低了其生物學(xué)毒性。
[0040](3)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)結(jié)果:
[0041]突光素酶表達(dá)實(shí)驗(yàn)用于研究載體對(duì)基因的轉(zhuǎn)染能力，以帶有突光素酶基因的質(zhì)粒并以具有表達(dá)ανβ3整合素的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hMSCs為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)五種材料對(duì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，參見說明書附圖3。結(jié)果顯示，材料的轉(zhuǎn)染效率均與N/P比有關(guān)，且在N/P比為2.5的時(shí)候，熒光素酶轉(zhuǎn)染效率最高。對(duì)比五種材料，發(fā)現(xiàn)在N/P比為2.5的時(shí)候，K4的轉(zhuǎn)染效率最高，與其它材料相比都具有顯著性的差異。說明親水分子PEG、靶向分子RGD的修飾和金納米顆粒的包裹有效的提聞了材料的轉(zhuǎn)染效率。
`[0042](4)加強(qiáng)綠色熒光蛋白基因表達(dá)結(jié)果:
[0043]加強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)用于研究載體對(duì)基因的轉(zhuǎn)染能力，以帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒并以具有表達(dá)α νβ 3整合素的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hMSCs為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)五種材料對(duì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，參見說明書附圖4。結(jié)果顯示，在N/P比為2.5的時(shí)候，K4負(fù)載質(zhì)粒后所表達(dá)的綠色熒光蛋白強(qiáng)度最強(qiáng)，這一結(jié)果亦表面，表明修飾了 RGD的材料和包裹了金納米顆粒的材料比沒有修飾RGD的材料和沒有包裹金納米顆粒的材料轉(zhuǎn)染效率高。
[0044](5) hBMP-2基因表達(dá)結(jié)果:
[0045]hBMP-2基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)用于研究載體負(fù)載hBMP_2pDNA后對(duì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力，參見說明書附圖5。結(jié)果表明，在N/P比為2.5的時(shí)候，相比于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有明顯hBMP-2表達(dá)。其中，經(jīng)K4負(fù)載后的基因表達(dá)濃度最高，與KO和Kl相比都具有顯著性的差異，hBMP-2表達(dá)結(jié)果為K4>K2>K3>K1>K0。這與上述的熒光素酶報(bào)告基因和加強(qiáng)綠色熒光蛋白基因表達(dá)結(jié)果相一致。
[0046](6) ALP 活性結(jié)果:
[0047]ALP活性結(jié)果用于定量的研究載體負(fù)載hBMP_2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力，參見說明書附圖6。結(jié)果表明:在N/P比為2.5時(shí)，ALP活性隨著時(shí)間的延長而增加，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞較之未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，ALP表達(dá)水平明顯得到提升，其中K4的ALP表達(dá)水平最高，與hBMP-2基因表達(dá)結(jié)果一致。
[0048](7)骨鈣素分泌結(jié)果:
[0049]骨鈣素分泌結(jié)果用于定量的研究材料作為載體負(fù)載hBMP_2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力，參見說明書附圖7。結(jié)果表明:骨鈣素分泌量在第14天的時(shí)候，分泌較少，隨著時(shí)間的延長，在第21天的時(shí)候，骨鈣素分泌量明顯的增加，其中骨鈣素分泌量為:K4>K2>K3>K1>K0。這個(gè)結(jié)果同樣體現(xiàn)了 Κ4材料優(yōu)秀的靶向性能和高效的基因轉(zhuǎn)染性能。
[0050](8)鈣離子沉積結(jié)果:
[0051]鈣離子沉積結(jié)果用于定量的研究材料作為載體負(fù)載hBMP_2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力，參見說明書附圖8。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的鈣離子含量隨著時(shí)間的延長而增加，在14天和21天的時(shí)候，K4材料處理的細(xì)胞都擁有最高的鈣離子濃度，這同樣體現(xiàn)了樹狀大分子表面功能化的修飾有利于基因轉(zhuǎn)染。
[0052](9)馮庫薩染色結(jié)果:
[0053]馮庫薩染色結(jié)果用于定性的研究材料作為載體負(fù)載hBMP_2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力。參見說明書附圖9。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，它們的顏色和形態(tài)都發(fā)生了明顯的改變，說明干細(xì)胞已成功分化成成骨細(xì)胞。而經(jīng)K4轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，成骨細(xì)胞被染色的密度是最大的。這與ALP活性，骨鈣素分泌，鈣離子沉積結(jié)果都一致，體現(xiàn)了 K4材料對(duì)hMSCs的特異靶向性和高效轉(zhuǎn)染效率。
[0054]有益效果:`[0055](I)本發(fā)明制備的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物具有良好的基因轉(zhuǎn)染效果，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染打下了基礎(chǔ)；
[0056](2)本發(fā)明制備的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有靶向作用，可用于基因的靶向輸送；
[0057](3)本發(fā)明的材料具有制備過程簡單，實(shí)驗(yàn)條件溫和，易操作，在骨組織的修復(fù)和重建中有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1為本發(fā)明制備的載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物的水動(dòng)力學(xué)粒徑(a)和電勢(b)圖；
[0059]圖2為本發(fā)明制備的材料對(duì)hMSCs的細(xì)胞毒性結(jié)果圖(a)載體；(b)載體/hBMP-2pDNA 復(fù)合物；
[0060]圖3為本發(fā)明制備的載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物在不同N/P下對(duì)hMSCs的熒光素酶基因轉(zhuǎn)染效率圖；
[0061]圖4為本發(fā)明制備的載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物在N/P=2.5時(shí)，對(duì)hMSCs的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的熒光顯微鏡圖；
[0062]圖5為本發(fā)明制備的載體/hBMP-2pDNA復(fù)合物在Ν/Ρ=2.5時(shí)，對(duì)hMSCs的hBMP_2基因轉(zhuǎn)染效率圖；
[0063]圖6為本發(fā)明制備的載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物在N/P=2.5時(shí)，ALP活性結(jié)果圖；
[0064]圖7為本發(fā)明制備的載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物在N/P=2.5時(shí)，骨鈣素沉積結(jié)果圖；
[0065]圖8為本發(fā)明制備的載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物在N/P=2.5時(shí)，鈣離子分泌結(jié)果圖；[0066]圖9為本發(fā)明制備的載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物在N/P=2.5時(shí)，馮庫薩染色結(jié)果圖；
[0067]圖10為功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物的制備原理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0068]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0069]實(shí)施例1
[0070]稱取Nh2-PEG-COOhI 1.58mg,溶于5mL DMS0。邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImLDMSO溶液的干重為1.785mg的6-MAL，反應(yīng)8h，得到MAL-PEG-C00H溶液。將ImLRGD-SH的DMSO溶液(4mg/mL)，逐滴加入到上述的MAL-PEG-C00H溶液中，反應(yīng)12h，得到RGD-PEG-C00H溶液。稱取4.0mg EDC和2.4mg NHS，分別溶于ImL DMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加RGD-PEG-C00H溶液中，攪拌反應(yīng)3h。稱取第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(G5.NH2)15.06mg,溶于5mL DMSO中。將上述活化好的RGD-PEG-C00H溶液逐滴加入到G5.NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反 應(yīng)3d，得到G5.NH2-(PEG-RGD)iqij稱取mPEG-COOHIL 58mg,溶于5mLDMSO。稱取2.0mg EDC和1.2mg NHS，分別溶于ImL DMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG-COOH溶液中，攪拌反應(yīng)3h。將上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到G5.NH2- (PEG-RGD) 10 溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng) 3d，得到 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 溶液。將G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析三天(2LX3)，然后進(jìn)行冷凍干燥處理，最后將得到的干燥G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10溶于5mL水中，再逐滴加入198.67 μ L HAuCl4水溶液(30mg/mL)混合攪拌30min，然后快速的加入 27.4 μ L 的 10mg/mL 的 NaBH4 溶液，反應(yīng) 3h，得到{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}溶液。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD)icrmPEG1J轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析三天(2LX3)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到最終干燥產(chǎn)物{: (Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}。
[0071]實(shí)施例2
[0072]將G5.NH2,對(duì)比例I，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1的方法制備得到的G5.NH2-mPEG20, {(Au°)25-G5.NH2-mPEG20} , G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10_mPEG10}在不同的 N/P 比條件下(1:1,2.5:1,5:1)分別與 5 μ g hBMP_2pDNA通過靜電作用形成載體/hBMP-2pDNA復(fù)合物，使終體積固定在100 μ L，室溫下孵育20min，然后加入ImL PBS0通過馬爾文激光粒度儀(Malvern，MK，633nm激光)對(duì)其水動(dòng)力學(xué)粒徑和表面電勢進(jìn)行了表征，結(jié)果如說明書附圖1所示。結(jié)果表明，隨著N/P比的增加，復(fù)合物的水動(dòng)力學(xué)粒徑減小了，幾乎都在200nm以下；而大部分復(fù)合物的表面電勢隨著N/P比的增加而增加，但也都在20mV左右。這些說明材料有利于細(xì)胞的吸附和內(nèi)吞，也就有利于載體對(duì)目的基因的傳遞。
[0073]實(shí)施例3
[0074]以具有V 3整合素表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hMSCs為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)G5.NH2,對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料的細(xì)胞毒性。以1.5X IO4/孔的密度將hMSCs種于96孔板中，培養(yǎng)于添加100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素和10%FBS的ΙΟΟμ La -MEM培養(yǎng)液中，37°C，5% 二氧化碳濃度下培養(yǎng)24h。然后將培養(yǎng)基換成濃度分別為0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM和 3000nM 的含 G5.NH2, G5.NH2-mPEG20, {(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20}，G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10 和{: (Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10}的細(xì)胞培養(yǎng)基與細(xì)胞共培養(yǎng)24h，隨后加入20 μ LMTT (5.0mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。去除孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L DMSO,搖床振蕩30min，用多功能酶標(biāo)儀測試吸光值，測試波長570nm，參比波長630nm，結(jié)果如說明書附圖2a所示。隨后，在上述同樣的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下，在材料換成 G5.NH2, G5.NH2-mPEG20, {(Au0) 25_G5.NH2_mPEG2。}，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 和{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}與I μ g pDNA的復(fù)合物，再測量吸光值，結(jié)果如說明書附圖2b所示。結(jié)果表明，隨著材料濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，但四種材料的毒性都比G5.NH2的毒性低。說明PEG和RGD的修飾都降低了樹狀大分子表面的氨基數(shù)目，從而降低了材料的細(xì)胞毒性。同時(shí)，在相同的濃度條件下，復(fù)合物的毒性比單獨(dú)載體的毒性要有所降低。這說明PDNA在與載體通過靜電作用相結(jié)合的時(shí)候，中和了樹狀大分子表面的部分氨基，從而降低了材料的細(xì)胞毒性。
[0075]實(shí)施例4
[0076]以攜帶熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒并以具有v 3整合素表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hMSCs為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)G5.NH2，對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料作為載體對(duì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。以1.5 X IO4/孔的密度將hMSCs種于24孔板中，培養(yǎng)于添加100U/mL青霉素 ，100U/mL鏈霉素和10%FBS的ImL a -MEM培養(yǎng)液中，37°C，5% 二氧化碳濃度下培養(yǎng)24h。隨后按照N/P比=1:1，2.5:1和5:1，制備載體/hBMP_2pDNA復(fù)合物，其中每個(gè)孔的hBMP-2pDNA的量為I μ L。將培養(yǎng)基換成不含F(xiàn)BS的a -MEM培養(yǎng)基，再加入上述復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h。然后更換含10%FBS的新鮮a -MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。將細(xì)胞裂解，并通過Promega公司的luciferase assay來檢測突光素酶活性,結(jié)果見說明書附圖
3。從圖中可以明顯的看出，材料在N/P比為2.5:1的時(shí)候，熒光素酶活性最高，五種材料的熒光素酶活性分別為:K4>K2>K3>K1>K0，而K4與前四種材料相比都具有顯著性差異，說明樹狀大分子表面PEG和RGD的修飾，和內(nèi)部金納米顆粒的包裹都顯著性的提高了材料的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0077]實(shí)施例4
[0078]以攜帶加強(qiáng)綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒并以具有ν 3整合素表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hMSCs為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)G5.NH2,對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料作為載體對(duì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞的培養(yǎng)方法和復(fù)合物的制備方法如實(shí)施例3所示，采用了攜帶加強(qiáng)綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒，在N/P比為2.5時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24h后，采用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)果見說明書附圖4。從圖中可以看出，K4的加強(qiáng)熒光蛋白基因的表達(dá)強(qiáng)度是最強(qiáng)的，而KO是最弱的，這個(gè)結(jié)果與熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)結(jié)果相一致。
[0079]實(shí)施例5
[0080]以攜帶hBMP-2基因的質(zhì)粒并以具有v 3整合素表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hMSCs為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)G5.NH2，對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料作為載體對(duì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞的培養(yǎng)方法和復(fù)合物的制備方法如實(shí)施例3所示，采用了攜帶hBMP-2基因的質(zhì)粒，在N/P比為2.5時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48h后，將培養(yǎng)基換成不含F(xiàn)BS的a -MEM培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24h。隨后收集100 μ L上清液，用hBMP_2ELISA試劑盒來檢測hBMP-2基因的表達(dá)量，結(jié)果見說明書附圖5。測試結(jié)果顯示:在N/P比為2.5時(shí)，K4材料檢測出最強(qiáng)的hBMP-2基因的表達(dá)量，相比于KO和Kl都具有顯著性差異，這可能歸因于RGD多肽的靶向性能，和金納米顆粒維系的剛性立體三維結(jié)構(gòu)對(duì)基因轉(zhuǎn)染的促進(jìn)作用。
[0081]實(shí)施例6
[0082]以ALP活性結(jié)果來檢驗(yàn)G5.NH2，對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料作為載體負(fù)載hBMP-2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力。細(xì)胞的培養(yǎng)方法和復(fù)合物的制備方法如實(shí)施例3所示，采用了攜帶hBMP-2基因的質(zhì)粒，在N/P比為2.5時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染第7天，第14天和第21天的時(shí)候，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，將細(xì)胞裂解，采用細(xì)胞比色分析方法對(duì)細(xì)胞的ALP活性進(jìn)行檢測。通過說明書附圖6可知，ALP活性隨著時(shí)間的延長而增加，但在第14天到第21天的時(shí)候，ALP活性的增加速度有所降低。這可能是由于隨著干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，ALP表達(dá)水平隨之上升，但隨著成骨細(xì)胞的逐漸形成，ALP表達(dá)水平有所降低。從圖中亦可看出，在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞較之未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，ALP表達(dá)水平明顯得到提升，其中K4的ALP表達(dá)水平最高，與hBMP-2基因表達(dá)結(jié)果一致。
[0083]實(shí)施例6
[0084]以骨鈣素分泌量來檢驗(yàn)G5.NH2，對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料作為載體負(fù)載hBMP-2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力。骨鈣素是在成骨細(xì)胞形成的時(shí)候由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的，因此可作為成骨細(xì)胞形成的一種關(guān)鍵性指標(biāo)。細(xì)胞的培養(yǎng)方法和復(fù)合物的制備方法如實(shí)施例3所示，采用了攜帶hBMP-2基因的質(zhì)粒，在N/P比為2.5時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于成骨細(xì)胞是在后期形成的，收集在轉(zhuǎn)染第14天和第21天的時(shí)候的上清液，通過人骨鈣素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測骨鈣素分泌，結(jié)果見說明書附圖7。從圖中可以得知，在14天的時(shí)候，骨鈣素分泌較少，說明這個(gè)時(shí)期，干細(xì)胞處于成骨細(xì)胞初期，尚處于分化過程中。而在21天的時(shí)候，骨鈣素分泌量得到顯著性的提高，說明干細(xì)胞已經(jīng)開始分化成成骨細(xì)胞，其中骨鈣素分泌量為:K4>K2>K3>K1>K0。這個(gè)結(jié)果同樣體現(xiàn)了 Κ4材料優(yōu)秀的基因傳遞性能。`
[0085]實(shí)施例7
[0086]以鈣離子沉積結(jié)果來檢驗(yàn)G5.NH2，對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料作為載體負(fù)載hBMP-2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力。鈣離子沉積也是一種成骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)之一，細(xì)胞的培養(yǎng)方法和復(fù)合物的制備方法如實(shí)施例3所示，采用了攜帶hBMP-2基因的質(zhì)粒，在N/P比為2.5時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)上述骨鈣素分泌的結(jié)果，我們同樣收集14天和21天的細(xì)胞，將細(xì)胞裂解，通過鈣離子測定試劑盒來檢測細(xì)胞中鈣離子的含量，結(jié)果見說明書附圖8。測試結(jié)果顯示:隨著時(shí)間測延長，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的鈣離子含量明顯的增加。在14天和21天的時(shí)候，K4材料處理的細(xì)胞都擁有最高的鈣離子濃度，這同樣驗(yàn)證了 PEG和RGD的修飾,金納米顆粒的包裹大大提高了材料轉(zhuǎn)染性能，體現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0087]實(shí)施例8
[0088]以馮庫薩染色結(jié)果定性的檢驗(yàn)G5.NH2，對(duì)比例1，對(duì)比例2，對(duì)比例3和實(shí)施例1制備的材料作為載體負(fù)載hBMP-2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的能力。馮庫薩染色是能通過染色的方法將礦化的基質(zhì)染成黑色，從而定性的驗(yàn)證成骨細(xì)胞的形成。細(xì)胞的培養(yǎng)方法和復(fù)合物的制備方法如實(shí)施例3所示，采用了攜帶hBMP-2基因的質(zhì)粒，在N/P比為2.5時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)實(shí)施例5、6、7的結(jié)果，干細(xì)胞在21天的時(shí)候已成功的分化成成骨細(xì)胞，因此，我們對(duì)21天的細(xì)胞進(jìn)行馮庫薩染色，結(jié)果見說明書附圖9。測試結(jié)果顯示:經(jīng)染色后，對(duì)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，從細(xì)胞的顏色和形態(tài)明顯看出細(xì)胞依舊是干細(xì)胞；而對(duì)于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，細(xì)胞的顏色和形態(tài)都發(fā)生顯著性的改變，說明干細(xì)胞已成功分化成成骨細(xì)胞。對(duì)于經(jīng)K4轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，細(xì)胞被染成黑色的密度是最大的，這結(jié)果與ALP活性，骨鈣素分泌，鈣離子沉積結(jié)果都一致，說明樹狀大分子上的PEG修飾提高了材料的轉(zhuǎn)染效率，RGD修飾提高了材料對(duì)干細(xì)胞的靶向性能，金納米顆粒的包裹提高了材料的立體剛性結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)材料的內(nèi)吞。
[0089]對(duì)比例I
[0090]稱取mPEG-C00H23.16mg，溶于 5mL DMS0。稱取 4.0mg EDC 和 2.4mg NHS，分別溶于ImL DMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG-COOH溶液中，攪拌反應(yīng)3h。稱取第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(G5.NH2) 15.06mg，溶于5mL DMSO中。將上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到G5.NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3d，得到樣品G5.NH2-mPEG20溶液。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物G5.NH2-mPEG20轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析三天(2LX3)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到干燥的G5.NH2-mPEG20 產(chǎn)物。
[0091]對(duì)比例2
[0092]將對(duì)比例I中得到的G5.NH2-mPEG20溶于5mL水中，再逐滴加入198.67 μ L HAuCl4水溶液(30mg/mL)混合攪拌30min,然后快速的加入27.4 μ L的10mg/mL的NaBH4溶液,反應(yīng) 3h，得到樣品{(Au°)25-G5.NH2-mPEG2Q}溶液。將反應(yīng)產(chǎn)物{(Au°) 25_G5.NH2-mPEG2(l}轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析三天(2LX3)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到干燥的{(Au°)25-G5.NH`2-mPEG2Q}產(chǎn)物。
[0093]對(duì)比例3
[0094]稱取Nh2-PEG-COOhI 1.58mg,溶于5mL DMS0。邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImLDMSO溶液的干重為1.785mg的6-MAL，反應(yīng)8h，得到MAL-PEG-C00H溶液。將ImLRGD-SH的DMSO溶液(4mg/mL)，逐滴加入到上述的MAL-PEG-C00H溶液中，反應(yīng)12h，得到RGD-PEG-C00H溶液。稱取4.0mg EDC和2.4mg NHS，分別溶于ImL DMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加RGD-PEG-C00H溶液中，攪拌反應(yīng)3h。稱取第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(G5.NH2)15.06mg,溶于5mL DMSO中。將上述活化好的RGD-PEG-C00H溶液逐滴加入到G5.NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3d，得到G5.NH2-(PEG-RGD)iqij稱取mPEG-COOHIL 58mg,溶于5mLDMSO。稱取2.0mg EDC和1.2mg NHS，分別溶于ImL DMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG-COOH溶液中，攪拌反應(yīng)3h。將上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到 G5.NH2- (PEG-RGD) 10 溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng) 3d，得到 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10溶液。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物G5.NH2-(PEG-RGD)icrmPEGici轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析三天(2LX3)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到干燥的G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 產(chǎn)物。
【權(quán)利要求】
1.一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于:所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物作為負(fù)載hBMP-2pDNA誘導(dǎo)hMSCs分化成成骨細(xì)胞的載體； 所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物具體為:{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10};其制備方法如下:
(1)將NH2-PEg-COOH溶液與6-MAL溶液攪拌反應(yīng)6_8h，得到MAL-PEG-C00H溶液，然后加入RGD-SH溶液，攪拌反應(yīng)10-12h，得到RGD-PEG-C00H溶液，隨后經(jīng)EDC和NHS溶液活化，再加入第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應(yīng)12-30h，得到G5.NH2- (PEG-RGD) 10溶液，然后將經(jīng)EDC.HCl和NHS活化的mPEG_C00H溶液加入到上述G5.NH2- (PEG-RGD) 10溶液中，反應(yīng) 12-30h，得到 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 溶液； (2)在上述G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10 中，加入 HAuCl4 溶液，攪拌反應(yīng) 20_30min，再加入 NaBH4 溶液，攪拌 2-4h，得到{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}溶液； (3)步驟(2)所得的溶液進(jìn)行透析、冷凍干燥處理，得到干燥的{(Au°)25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物與hBMP-2pDNA的N/P比為1:1~5:1，所述的N/P比為樹狀大分子的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，所述的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物與hBMP-2pDNA的N/P比為1:1,2.5:1 或者 5:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物與hBMP-2pDNA復(fù)合的方法為: 將{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD)icrmPEGltJ用無菌水稀釋，然后無菌水稀釋質(zhì)粒，再將二者混合均勻后于37°C孵育30min，即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中NH2-PEg-COOH溶液、6-MAL溶液、RGD-SH溶液、mPEG_C00H溶液的濃度均為5.8mmol/mL ;第五代聚酰胺_胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL ;溶劑均為 DMSO。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中HAuCl4溶液的濃度為30mg/mL，NaBH4溶液的濃度為10mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)中透析為用去離子水透析2-3d，每天3次，每次2L去離子水，其中透析袋截留分子量為14000。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK103623417SQ201310699637
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】史向陽, 孔令丹, 侯文秀 申請(qǐng)人:東華大學(xué)